朱羽君

南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,河南省南陽市 473061

梗阻性黃疸(Obstructive jaundice, OJ)是由各種原因引起的以膽汁淤積、肝膽組織受損等一系列病理生理改變?yōu)橹鞯呐R床癥候群[1-2]。枸杞是我國傳統(tǒng)中藥方劑中的常用配方成分,味甘、性平,具有延緩衰老、明目安神、抗疲勞等多種保健功效,其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是枸杞發(fā)揮功效的主要成分[3]。研究表明,LBP有明顯的肝細(xì)胞保護(hù)活性,且無毒副作用[4-5],LBP還具有抗氧化活性以及對線粒體的保護(hù)作用等[6]。本研究以梗阻性黃疸小鼠為研究對象,通過LBP實施干預(yù),觀察肝功能總膽紅素(TBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)指標(biāo)及肝組織中TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α表達(dá)的變化,為梗阻性黃疸患者保肝方案提供新的治療線索,也為枸杞中藥資源的開發(fā)利用提供新的研究方向?，F(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 納入成年健康雄性昆明小鼠60只,體質(zhì)量(20±2)g,實驗小鼠由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要實驗試劑及儀器 枸杞多糖(購于寧夏啟元藥業(yè)),0.9%NaCl,冰醋酸,EDTA,蘇木素,多聚甲醛,松節(jié)油等試劑,TBIL、ALT、AST 試劑盒,DAB 染色液,NF-κB P65,TNF-α一抗,PCR儀,核酸蛋白檢測儀,高速低溫離心機(jī)等。

1.3 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠分為3組,即假手術(shù)組(Blank control group, B組)、模型組(Model group, M組)和枸杞組(Lycium barbarum polysaccharide group,L組),每組20只。

模型組和枸杞組行膽總管結(jié)扎致肝損傷構(gòu)建梗阻性黃疸模型,采用張守華等[7]構(gòu)建黃疸模型的方法并加以改良。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺,備皮,消毒鋪巾。在上腹部正中做切口,進(jìn)入腹腔并提出十二指腸,找到并暴露膽總管,用不可吸收手術(shù)絲線將膽總管懸掛于腹壁,依次縫合手術(shù)傷口。48h后剪斷膽總管固定線。之后枸杞組于手術(shù)后2d行固定時間枸杞多糖500mg/(kg·d)灌胃,連續(xù)給藥6周。假手術(shù)組小鼠只進(jìn)行腹部切開手術(shù),不進(jìn)行模型構(gòu)建和枸杞多糖干預(yù)即空白對照組。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 標(biāo)本采集與處理:用消毒后的手術(shù)剪行腹腔切口后,分離出肝臟組織,并進(jìn)行分解,10%甲醇溶液固定后石蠟包埋切片,用于免疫組化分析。

1.4.2 肝功能指標(biāo)檢測:采用生物化學(xué)分析法檢測血清中TBIL、ALT、AST等肝功能指標(biāo)的濃度,操作方法參照試劑盒說明書。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色:采用鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物組織化學(xué)染色法(Strept Avidin-Biotin Complex, SABC)檢測小鼠肝臟組織中TNF-α的表達(dá),采用Realtime-PCR技術(shù)檢測NF-κB、IKK-α、IκB-α的表達(dá)水平,操作方法按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及肉眼觀察 在建模的6周時間內(nèi),三組小鼠均未出現(xiàn)由建?；蛭桂B(yǎng)或其他原因?qū)е滤劳龅那闆r。建模成功后假手術(shù)組小鼠的食欲、生長均正常;隨著梗阻時間的增加,模型組和枸杞組小鼠的活躍度降低,出現(xiàn)嗜睡,尿液顏色逐漸變黃,建模成功約2d后小鼠的皮膚、毛發(fā)、耳尖等部位出現(xiàn)局部發(fā)黃現(xiàn)象;而經(jīng)過一段時間的干預(yù)后,枸杞組小鼠的癥狀均輕于模型組小鼠。

2.2 各組肝功能指標(biāo)比較 模型組小鼠血清TBIL、ALT、AST水平處于三組的最高水平,枸杞組的TBIL、ALT、AST水平較模型組有明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.863、5.324、5.232,均P<0.001);但枸杞組的TBIL、ALT、AST水平仍然分別高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.341、10.864、30.105,均P<0.001)。見表1。

表1 各組肝功能指標(biāo)比較

2.3 各組TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指標(biāo)比較 模型組小鼠肝組織中TNF-α、NF-κB、IKK-α的表達(dá)處于三組的最高水平,枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達(dá)水平較模型組有明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.471、-15.583、-22.856,P<0.001);但枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達(dá)水平仍然分別高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.981、6.001、14.381,均P<0.001);而IκB-α的表達(dá)水平則呈完全相反的趨勢,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指標(biāo)比較

3 討論

目前研究認(rèn)為 OJ的主要發(fā)病機(jī)制是由于肝臟的內(nèi)外膽管因內(nèi)部壓力原因造成的完全或不完全梗阻,進(jìn)而引發(fā)肝臟清除內(nèi)毒素的能力急劇降低[8]。當(dāng)梗阻長期存在時,可能引起膽管組織的纖維化,進(jìn)一步加劇膽汁的流動受阻,尤其是患者還合并有膽道感染時,膽管還會出現(xiàn)萎縮、炎性細(xì)胞浸潤等并發(fā)癥[9]。梗阻也會使得肝竇的血液流動受阻,進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性的門靜脈高壓,最終導(dǎo)致肝臟損傷[10]。

ALT、AST是肝內(nèi)主要的功能酶,主要存在于肝細(xì)胞內(nèi),當(dāng)出現(xiàn)肝臟細(xì)胞膜損傷或肝細(xì)胞壞死等情況時,ALT、AST會流入血液中,使血清中的轉(zhuǎn)氨酶水平升高。TBIL是直接膽紅素和間接膽紅素的總和,當(dāng)肝臟功能出現(xiàn)發(fā)生障礙時,會引起TBIL在血液中積聚,進(jìn)而發(fā)生黃疸癥狀。本組研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠血清的TBIL、ALT、AST水平處于三組的最高,而經(jīng)枸杞多糖干預(yù)后的小鼠TBIL、ALT、AST水平較模型組有明顯降低,但仍然高于假手術(shù)組(空白對照組)。這提示枸杞多糖對梗阻性黃疸肝損傷有明顯的改善和保護(hù)作用,同時對減輕肝臟纖維化具有促進(jìn)作用。劉翔探討黃芪多糖與枸杞多糖聯(lián)用對小鼠肝組織損傷的保護(hù)作用也發(fā)現(xiàn),枸杞多糖對四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用[11]。

近年來關(guān)于細(xì)胞因子與免疫功能相關(guān)關(guān)系的研究顯示[12-13],當(dāng)機(jī)體發(fā)生梗阻性黃疸時肝臟內(nèi)的TNF-α等細(xì)胞因子的過量表達(dá),促使炎癥反應(yīng)的加速,是導(dǎo)致繼發(fā)性肝損傷的重要原因。本研究中,枸杞組的TNF-α、NF-κB、IKK-α表達(dá)水平較模型組有明顯下調(diào),但高于假手術(shù)組,而IκB-α的表達(dá)水平則呈完全相反的趨勢,提示通過6周枸杞多糖灌胃干預(yù)后,下調(diào)了梗阻性黃疸肝損傷小鼠機(jī)體內(nèi)TNF-α、NF-κB、IKK-α表達(dá)水平,上調(diào)了IκB-α的表達(dá)水平,通過減少與其下游的信號分子的結(jié)合,從而控制了小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng),改善和保護(hù)了肝功能的損傷[14]。提示枸杞多糖的干預(yù)通過抑制TNF-α所介導(dǎo)的NF-κB信號通路,進(jìn)而在梗阻性黃疸肝損傷的改善及保護(hù)中起到關(guān)鍵作用[15]。

綜上所述,枸杞多糖干預(yù)對梗阻性黃疸小鼠的肝功能具有保護(hù)作用,能有效改善肝損傷小鼠的肝功能和免疫功能,可能通過抑制腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路發(fā)揮作用。