羅 強(qiáng) 蘭碧洋 黃斯陽(yáng) 張曉安 武國(guó)煜

廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院胸心腺體科,廣西南寧市 530001

肺癌是最為常見(jiàn)的癌癥死亡原因,2018年全球預(yù)計(jì)有210萬(wàn)例新肺癌病例和180萬(wàn)例死亡病例,分別占癌癥發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)的11.6%和18.4%[1]。盡管已經(jīng)確定了許多與肺癌相關(guān)的生物標(biāo)志物,但是肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程十分復(fù)雜,難以憑借單一指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)?？截悢?shù)變異(Copy number variation,CNV)指基因組DNA的改變,其特征在于正常(二倍體)基因組中DNA序列數(shù)的改變。這些DNA改變可能會(huì)影響單個(gè)基因、染色體區(qū)域或整個(gè)染色體。研究表明,CNVs與肺癌及其他幾種惡性疾病有關(guān)[1]。通常,在癌癥中,DNA拷貝數(shù)的減少或增加可能對(duì)影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響。

眾多研究表明KEAP1-NFE2L2通路的激活與肺癌的耐藥及預(yù)后相關(guān)[2-8]。KEAP1-NFE2L2通路涉及主要的基因包括KEAP1、NFE2L2、UBC、SQSTM1、CUL3、MYC、MAFG和CREBBP等。故本研究對(duì)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)肺癌患者血清中KEAP1、NFE2L2、UBC、SQSTM1、CUL3、MYC、MAFG和CREBBP基因拷貝數(shù),比較它們?cè)诜伟┗颊吆徒】抵驹刚咧g的差異,以及與各種臨床病理特征的關(guān)系,探討KEAP1-NFE2L2基因在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究使用2021年9月—2022年2月在我院住院的肺癌患者和健康志愿者的血液樣本進(jìn)行。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn),最終入組15例患者[男11例和女4例,平均年齡(65.40±9.60)歲]作為肺癌組。根據(jù) WHO 和 UICC TNM 分期系統(tǒng)(第 8 版)的標(biāo)準(zhǔn)確定每個(gè)癌樣本的 TNM 分期[9]。所有患者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均經(jīng)病理確診為肺癌,無(wú)既往或共存癌癥;(2)臨床資料完整。同時(shí)將15例接受體檢的健康志愿者[男10例,女5例;平均年齡(62.10±9.11)歲]納入對(duì)照組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)如下:無(wú)肺癌臨床癥狀(如咳嗽、咯血、呼吸困難和體重減輕等);(2)無(wú)惡性腫瘤家族史;(3)無(wú)心、肝、脾、肺、腎等主要臟器疾病。所有樣本均經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者知情同意。

1.2 PCR測(cè)定目的基因mRNA表達(dá)和CNV 采用血液樣品總 RNA小量提取試劑盒(R4163-02,美基生物)從血液樣品中提取總 RNA。使用HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01,諾維贊)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。詳細(xì)如下:加入1 μg的總 RNA到反轉(zhuǎn)錄管中,加入10μl的2× HiScriptⅡQ RT SuperMix,混勻,放入熱循環(huán)儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?0℃,15min;85℃,5s,然后保持4℃。使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02,諾維贊)進(jìn)行目的基因 PCR 擴(kuò)增。首先在PCR管中加入2μl的cDNA模板,加入10μl的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,加入目的基因的特異引物(濃度為10μmol/L),加入RNase-free水至總體積為20μl。混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件:通過(guò)初始95℃、5min開始熱循環(huán),然后是 95℃、15s,57℃、15s和72℃、20s的35個(gè)循環(huán)。qPCR 使用 熒光定量 PCR 儀(qTOWERE3,德國(guó) AnalytikJena)進(jìn)行,每個(gè)拷貝數(shù)由 CopyCaller v1.0(Thermo Fisher Scientific)使用CT 方法計(jì)算。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司(南寧) 進(jìn)行合成,見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.3 標(biāo)本采集和腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè) 抽取所有受試者(包括肺癌組和健康對(duì)照組)的清晨空腹靜脈血5ml。隨后,將血液樣本在4℃下以2 500g離心15min,之后收集血漿并儲(chǔ)存在-80℃直到進(jìn)一步分析。在自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司,中國(guó))上通過(guò)羅氏電化學(xué)發(fā)光法分析5種腫瘤生物標(biāo)志物(CYFRA21-1、CEA、CA125、CA153h和CA199),所有測(cè)定程序均根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行,校準(zhǔn)溶液和試劑均為制造商的原裝試劑盒。參考區(qū)間:CA125為0～35U/ml,CYFRA21-1為0～3.3ng/ml,CEA為0～5μg/L,CA153為0 ～25U/ml,CA199為0～27U/ml。

2 結(jié)果

2.1 研究人群 15例肺癌患者的臨床病理參數(shù)見(jiàn)表2,患者年齡為49～84歲,大多數(shù)患者為男性,超過(guò)一半的患者吸煙。大多數(shù)患者被診斷為腺癌或鱗狀細(xì)胞癌,大多數(shù)患者被診斷為腫瘤分期為Ⅳ期,其中Ⅰ～Ⅲ期各1例,5種腫瘤標(biāo)志物的水平詳見(jiàn)表2。

表2 15例肺癌患者臨床病理參數(shù)

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 待測(cè)樣本經(jīng)熒光定量 PCR,電泳條帶(見(jiàn)圖1)單一,結(jié)果比較理想。

表3 肺癌患者與健康對(duì)照組目的基因mRNA表達(dá)和相對(duì)拷貝數(shù)的比較

2.3 肺癌患者與健康對(duì)照組目的基因mRNA表達(dá)和相對(duì)拷貝數(shù)的比較 NFE2L2、NFE2L2拷貝數(shù)、SQSTM1、MYC和 MYC拷貝數(shù)與肺癌呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。肺癌組NFE2L2、SQSTM1、MYC表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而NFE2L2和MYC的拷貝數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。但兩組其他目的基因表達(dá)及拷貝數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

2.4 NFE2L2和MYC基因相對(duì)拷貝數(shù)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 如表4所示,NFE2L2拷貝數(shù)與CYFRA21呈明顯正相關(guān)(P<0.05),而與NFE2L2基因表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05)。NFE2L2基因表達(dá)與CYFRA21 基因表達(dá)和NFE2L2拷貝數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與KEAP1、SQSTM1、CUL3和CREBBP基因表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。MYC拷貝數(shù)與KEAP1拷貝數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05),與MAFG、MYC和KEAP1基因表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(P<0.05)。MYC基因表達(dá)與CREBBP拷貝數(shù)、KEAP1拷貝數(shù)、MYC拷貝數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與病理類型、KEAP1、CUL3和CREBBP基因表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P<0.05)。

圖1 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

表4 NFE2L2和MYC基因相對(duì)拷貝數(shù)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

肺癌是一種復(fù)雜的疾病,其發(fā)生和發(fā)展涉及多重因素和信號(hào)調(diào)控機(jī)制。因此,肺癌的預(yù)測(cè)和診斷也需要綜合考慮多個(gè)指標(biāo)。近期的研究表明,基因的拷貝數(shù)異常在肺癌的發(fā)展機(jī)制中扮演著重要的角色。例如,Heo等人的研究發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因拷貝數(shù)異常(ACOT1、NAA60、GSDMD、HLADPA1和SLC35B3)和非小細(xì)胞肺癌之間存在顯著關(guān)聯(lián),證實(shí)基因的拷貝數(shù)和肺癌的發(fā)展機(jī)制有關(guān)[10]。此外,Kou Fan等人的研究表明體細(xì)胞拷貝數(shù)可以和腫瘤的原發(fā)灶、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分期聯(lián)合用于預(yù)測(cè)早期肺腺癌患者接受放療后的無(wú)進(jìn)展生存期[11]。Reika等人的研究則表明MYC拷貝數(shù)的增加和小細(xì)胞肺癌和肺腺癌的預(yù)后不良有關(guān)[12]。Sunpaweravong等人的研究表明HER2基因擴(kuò)增或17號(hào)染色體拷貝數(shù)增加以及c-Myc的高表達(dá)與總生存率下降有關(guān)[13]。類似的,本研究也發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,MYC和NFE2L2的拷貝數(shù)在肺癌組更高,由此可以推測(cè)MYC和NFE2L2或許可以作為肺癌的發(fā)展的生物標(biāo)志物。然而值得注意的是,MYC的相對(duì)拷貝數(shù)與NFE2L2相對(duì)拷貝數(shù)沒(méi)有相關(guān)性,這提示了基因拷貝數(shù)在肺癌的發(fā)展中可能存在不同的調(diào)控機(jī)制。

MYC是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá),包括調(diào)節(jié)中央代謝途徑、細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞死亡以及應(yīng)激途徑和耐藥機(jī)制等。此外,先前的研究表明,MYC的過(guò)表達(dá)可以與其他基因的激活或喪失相結(jié)合,從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[14]。此外,Ireland的研究顯示MYC與NOTCH可能相互合作,驅(qū)動(dòng)小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[15]。本研究顯示,MYC的拷貝數(shù)和KEAP1拷貝數(shù)呈正相關(guān),這一發(fā)現(xiàn)與先前的研究結(jié)果一致,表明MYC的作用不僅限于單個(gè)通路,而是涉及多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)和影響。盡管我們尚未探索MYC與KEAP1之間的具體作用機(jī)制,但本研究結(jié)果表明,MYC可能通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)多個(gè)基因和通路,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。

近年來(lái),越來(lái)越多的研究表明NFE2L2與肺癌發(fā)生機(jī)制之間存在密切關(guān)系。在Binkley的研究中證實(shí)了NFE2L2可以預(yù)測(cè)接受放射治療的非小細(xì)胞肺癌患者的局部復(fù)發(fā)率[14]。另外,Ju等人[16]實(shí)驗(yàn)顯示NEF2L2的表達(dá)水平與5個(gè)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(Mismatch repair system,MMR)的基因突變水平呈正相關(guān)。因此,NFE2L2的異常表達(dá)可能通過(guò)調(diào)節(jié)MMR基因突變水平和DNA甲基化等方式在腫瘤發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用[16]。本研究結(jié)果也支持了NFE2L2在肺癌發(fā)生過(guò)程中的重要作用。具體而言,NFE2L2的相對(duì)拷貝數(shù)和細(xì)胞角蛋白十九片段CYFRA21-1呈現(xiàn)正相關(guān),這表明NFE2L2的異常表達(dá)可能與肺癌細(xì)胞增殖和浸潤(rùn)的程度相關(guān)。

肺癌的發(fā)生和發(fā)展是由多個(gè)基因異常和環(huán)境因素共同作用引起的,其中MYC和NFE2L2基因被認(rèn)為是肺癌的關(guān)鍵基因之一,其在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。一些研究表明,基因的拷貝數(shù)增加可能是肺癌侵襲性表型的標(biāo)志,而MYC基因的拷貝數(shù)與小細(xì)胞肺癌和腺癌的預(yù)后不良有關(guān)[1]。然而,本研究中并未涉及患者的生存時(shí)間數(shù)據(jù),因此無(wú)法對(duì)基因的拷貝數(shù)與患者生存情況之間的關(guān)系進(jìn)行分析。本研究的另一個(gè)局限性是分析樣本數(shù)量較少,因此無(wú)法進(jìn)行更精確的數(shù)據(jù)分析。

綜上所述,MYC和NFE2L2基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,因此深入研究這兩個(gè)基因在肺癌中的作用,進(jìn)一步分析其對(duì)肺癌患者的預(yù)后作用,將有助于提高肺癌患者的治療效果,延長(zhǎng)患者的生命,為肺癌患者的治療提供更好的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。