劉晉仙,李瑋濤,,柳曉芳,王秀萍,張中志

(1.東營(yíng)市食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 東營(yíng) 257091;2.東營(yíng)天東制藥有限公司,山東 東營(yíng) 257000)

肝素(Heparin)是一種帶有高密度負(fù)電荷的糖胺聚糖類化合物,產(chǎn)自動(dòng)物結(jié)締組織型肥大細(xì)胞。肝素蛋白聚糖是由一條獨(dú)特的核心蛋白(絲甘蛋白)和與其共價(jià)連接的多條肝素多糖鏈組成。最終,肝素鏈在水解作用下斷裂形成分子量不同的較小肝素多糖(相對(duì)分子質(zhì)量5 000～25 000)多分散混合物,儲(chǔ)存在肥大細(xì)胞的胞質(zhì)分泌顆粒中[1]。臨床上主要用于預(yù)防和治療深靜脈血栓或肺栓塞(尤其與某些手術(shù)有關(guān)的栓塞)、防止血液透析等體外循環(huán)中血栓形成等。除抗凝活性外,肝素同時(shí)具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗瘧疾等功能。肝素分子結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜,是由不同分子量的線性多糖糖鏈組成的多分散性混合物。其活性成分肝素是由α-D-氨基葡萄糖(N-硫酸化,O-硫酸化或N-乙?；?和O-硫酸化糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸或β-D-葡萄糖醛酸)組成的二糖重復(fù)單位以1-4糖苷鍵連接形成的線性多糖。迄今為止,人們?nèi)晕茨軐?duì)肝素的結(jié)構(gòu)進(jìn)行完全解析,更遑論人工合成。肝素可以從豬、牛、羊等動(dòng)物的小腸黏膜和牛肺等組織中提取,但是不同來源的肝素化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性存在明顯的差異[2],其不良反應(yīng)程度也不同。例如,相較于豬源肝素,牛源肝素引起血小板減少不良反應(yīng)(heparin induced thrombocytopenia,HIT)的概率升高了1倍[3]。20世紀(jì)90年代源自歐洲的由朊病毒引起的牛海綿狀腦病(瘋牛病)以及同樣由朊病毒引起的羊癢病加劇了世界各國(guó)及其藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)牛、羊來源肝素的擔(dān)憂。目前,在肝素產(chǎn)品的主要市場(chǎng),如歐、美、中等,其藥典明確要求肝素及低分子肝素僅限來源自豬腸黏膜,不得混有其他來源肝素。中國(guó)是世界上第一大肝素供應(yīng)國(guó),占比超過50%。近年,特別是新冠肺炎疫情發(fā)生以來,由于肝素類產(chǎn)品作為抗凝藥物在新冠肺炎重癥患者的對(duì)癥治療中起到了一定作用,進(jìn)一步使肝素價(jià)格飆升,甚至于肝素產(chǎn)業(yè)在一定程度上具有了資源類產(chǎn)業(yè)屬性。豬源粗品肝素的短缺和價(jià)格飆升造成了市場(chǎng)上粗品肝素良莠不齊,對(duì)于不同種屬來源的有效區(qū)分已經(jīng)成為目前肝素產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要考量。因此,有必要對(duì)鑒別不同種屬來源肝素檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理,以便于保障廣大人民群眾的用藥安全。

1 肝素種屬來源的鑒別方法

目前,鑒別肝素不同種屬來源的方法主要分為兩類:一類是基于殘留核酸(DNA)、殘留蛋白的生化檢測(cè)方法,另一類是基于肝素結(jié)構(gòu)的理化檢測(cè)方法。其中,生化檢測(cè)方法易受實(shí)驗(yàn)環(huán)境、熟練程度、異物污染等影響。如肝素的提取、純化過程中使用的強(qiáng)堿、高溫等條件會(huì)導(dǎo)致DNA嚴(yán)重破壞,另外一些不良廠家會(huì)有意去除牛羊肝素中的DNA,同時(shí)肝素對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)有較強(qiáng)的抑制作用[4],導(dǎo)致PCR易出現(xiàn)假陰性,使針對(duì)核酸的PCR法失去效用;蛋白質(zhì)釋放后很容易失活,特別是肝素的提取、純化過程中使用的強(qiáng)堿、高溫等條件更易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的破壞和變性,因此基于物種特異性蛋白的檢測(cè)方法也有很大的局限性。

近年來,基于肝素特征化學(xué)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法日益增多[5],相關(guān)檢測(cè)方法從肝素結(jié)構(gòu)本身入手,不易受到干擾,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性都得到了保證。此類檢測(cè)方法的一個(gè)問題是使用的儀器一般較為昂貴,但隨著國(guó)內(nèi)科學(xué)研究?jī)x器的日益完備,這一問題也逐步得到了解決。

肝素糖鏈?zhǔn)怯砂盘侨┧?葡萄糖醛酸與葡萄糖胺組成的二糖重復(fù)單位以1-4糖苷鍵連接形成的線性多糖。其中,糖醛酸C2位可發(fā)生硫酸化;葡萄糖胺的氨基位置可被乙酰化或硫酸化,C3和C6位可發(fā)生硫酸化。不同的硫酸化程度、不同的取代基位置形成了肝素復(fù)雜的不均一結(jié)構(gòu)[6](見圖1)。對(duì)肝素進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析主要有兩種策略(見圖2):自上而下(Top-down)、自下而上(Bottom-up)。Top-down方法中,肝素糖鏈不經(jīng)過進(jìn)一步降解,而直接進(jìn)行檢測(cè)分析,如核磁(NMR)、紅外(IR)、分子排阻色譜法(SEC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等方法,從而獲得肝素中原始寡糖、單糖、特征結(jié)構(gòu)等信息。Bottom-up方法中,肝素糖鏈?zhǔn)紫冉?jīng)肝素酶(Ⅰ and/or Ⅱ and/or Ⅲ)或亞硝酸降解,然后經(jīng)強(qiáng)陰離子交換高效液相色譜法(SAX-HPLC)、反相離子對(duì)液相色譜法(RPIP)、毛細(xì)管電泳法(CE)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)等,對(duì)降解后的二糖、寡糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)和含量分析,從而投射出肝素糖鏈的宏觀結(jié)構(gòu)信息。

X=sulfo 或H,Y=sulfo,Ac或H

圖2 自上而下、自下而上分析策略

2 Top-down方法

Top-down分析方法以完整肝素糖鏈為直接分析對(duì)象,因此保留了糖鏈完整的信息,例如糖醛酸C5位差向異構(gòu)信息。與Bottom-up方法相比,此種分析方法可以提供的肝素鈉糖鏈結(jié)構(gòu)信息更為完整、豐富、精準(zhǔn)。

Liu等[7]的工作報(bào)道了采用親水相互作用色譜-質(zhì)譜法(HILIC-MS),在線分析對(duì)比依諾肝素鈉原研及仿制藥的全糖鏈結(jié)構(gòu)信息。HILIC-MS方法可對(duì)糖鏈的N-乙?；潭取⑦€原端結(jié)構(gòu)、非還原端結(jié)構(gòu)等進(jìn)行深度解析。Chen等[8]的工作中,使用類似的方法,在線分析對(duì)比依諾肝素鈉原研與羊來源肝素鈉制備的依諾肝素鈉之差異,發(fā)現(xiàn)羊來源肝素制備的依諾肝素鈉含有227種寡糖,而在原研Lovenox中鑒定出225種寡糖,兩者存在130種相同的寡糖,種類上有明顯差異。且這130種寡糖的具體含量也有明顯差異,如羊來源肝素制備的依諾肝素鈉,其硫酸化程度較高的寡糖[1,2,3,0,8],[1,4,5,0,12],[1,5,6,0,16],[1,5,6,0,17]和[1,6,7,0,17]含量較原研Lovenox多;其硫酸化程度較低的N-乙?；烟荹1,4,5,1,10],[1,4,5,1,11]和[1,4,5,1,12]含量較原研Lovenox多(寡糖組成信息通常采用[ΔHexA、HexA、GlcN、Ac、SO3]方式描述,其中ΔHexA代表寡糖鏈中不飽和糖醛酸、HexA代表糖醛酸、GlcN代表葡萄糖胺、Ac代表乙酰基、SO3代表磺酸基,數(shù)字代表各種結(jié)構(gòu)的數(shù)量)。HILIC-MS方法以其良好的質(zhì)譜兼容性,可對(duì)肝素類產(chǎn)品中含量極低的寡糖進(jìn)行、發(fā)現(xiàn)和解析,近年來成為寡糖序列分析的重要手段。

Liang等[9]的工作中,介紹了一種對(duì)首先對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)中醇羥基、胺基進(jìn)行保護(hù),然后使用LC-MS/MS方法,分析肝素/硫酸乙酰肝素中寡糖結(jié)構(gòu)的方法。糖鏈羥基、胺基上硫酸取代基團(tuán)在電離過程中易發(fā)生破壞,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損失,限制了質(zhì)譜方法在寡糖結(jié)構(gòu)解析中的使用。該工作中,用氘代乙酸酐/丙酸酐取代糖鏈上不穩(wěn)定的硫酸基團(tuán),得到的衍生化寡糖經(jīng)C18色譜柱分離,聯(lián)用MS分析,可分析至十二糖,為鑒別不同來源肝素提供了一種可能的方法。

Guerrini等[10]的工作報(bào)道了通過結(jié)合1H和13C核磁共振譜圖,表征肝素生產(chǎn)、組成、硫酸基取代等信息,豬來源肝素與牛肺肝素在葡萄糖胺6位硫酸化取代程度(豬:81%～84%,牛59.3%～61.4%)、葡萄糖胺3位硫酸化取代程度(豬:5.1%～7.2%,牛1.4%～2.4%)、N-硫酸化(豬:78.2%,牛:89.6%)和N-乙?；?豬:15.9%,牛8.7%)組分含量等方面有明顯差異。

Ange等[11]的工作報(bào)道了使用1H、13C、HSQC核磁共振譜圖,對(duì)來源自豬腸黏膜、牛腸黏膜、牛肺的肝素進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果表明與豬腸黏膜肝素相比,牛腸黏膜肝素核磁氫譜中GlcNS的H1峰(5.23 ppm)明顯偏高,IdoA的H1峰(4.94 ppm)明顯偏低,GlcNY的H6峰(3.78 ppm)明顯偏高。牛肺肝素核磁氫譜中GlcNAc的甲基氫信號(hào)峰(1.95 ppm)明顯較低。

Mauri等[12]的工作中對(duì)于核磁氫譜的分析部分報(bào)道了類似于Ange工作的結(jié)論。該研究同時(shí)表明豬腸黏膜肝素與羊腸黏膜肝素核磁氫譜更為相似,兩者之間一個(gè)較為明顯的區(qū)別是羊腸黏膜肝素的GlcNAc的甲基氫信號(hào)峰低于豬腸黏膜肝素。該研究還根據(jù)核磁氫譜中GlcNY的H6峰(3.87 ppm)、GlcNS6X的H2峰(3.28 ppm)、GlcNAc的甲基氫信號(hào)峰(2.05 ppm)相互之間的比值關(guān)系給出了一種判斷肝素種屬來源的方法。Lucio Mauri的工作中對(duì)于HSQC譜圖的分析部分表明,來源自牛腸黏膜、豬腸黏膜、羊腸黏膜、牛肺的肝素在單糖組成上有較為明顯的差異,例如GlcNy6S(牛腸黏膜<其他來源),GlcA(豬腸黏膜>羊腸黏膜>牛肺),IdoA(豬腸黏膜>羊腸黏膜>牛肺)。

Monakhova等[13]的一項(xiàng)工作中通過核磁共振擴(kuò)散排序譜(DOSY)可對(duì)粗品肝素中不同來源的不同分子量糖胺聚糖進(jìn)行分析。

Monakhova等[14]的另一項(xiàng)工作中通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同來源肝素核磁氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)而鑒別其來源。應(yīng)用主成分分析法(PCA),因子判別分析法(FDA)等可鑒別豬腸黏膜肝素中2%含量的羊腸黏膜肝素?fù)诫s。該方法同樣適用于鑒別不同來源肝素制備的依諾肝素鈉。

Ouyang等[15]的工作中使用主成分分析法(PCA)對(duì)豬腸黏膜、牛腸黏膜、羊腸黏膜的核磁氫譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,該方法可鑒別豬腸黏膜肝素中10%含量的牛腸黏膜或羊腸黏膜肝素。

3 Bottom-up方法

Bottom-up分析方法是首先將完整的肝素糖鏈降解為二糖、短鏈寡糖,以降解后二糖、短鏈寡糖的組分含量和結(jié)構(gòu)為直接研究對(duì)象,得到二糖、短鏈寡糖的指紋圖譜,最后通過對(duì)降解后組分的鑒別分析、拼接,實(shí)現(xiàn)對(duì)糖鏈完整結(jié)構(gòu)信息的分析、推測(cè)。

Watt等[16]的工作中對(duì)不同來源肝素降解后二糖含量百分比進(jìn)行了分析。使用強(qiáng)陰離子交換樹脂柱對(duì)降解后樣品進(jìn)行了分離、分析,結(jié)果表明,不同來源肝素具有不同的二糖組成。例如牛肝素△IIIS含量明顯高于羊肝素和豬肝素(見表1),與Top-down方法,核磁氫譜分析中GlcNY的H6峰(3.78 ppm)明顯偏高結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

表1 豬、羊、牛肝素二糖組成(%)

Ouyang等[15]的工作中對(duì)豬、牛、羊肝素及不同程度摻雜牛、羊肝素的豬肝素樣品,經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,通過反相離子對(duì)液相色譜法聯(lián)用質(zhì)譜(RPIP LC-MS)檢測(cè)二糖;經(jīng)肝素酶Ⅱ酶解后,通過RPIP LC-MS檢測(cè)不被肝素酶Ⅱ降解的四糖。RPIP使用揮發(fā)性的流動(dòng)相,因而與MS有較好的兼容性,可以對(duì)經(jīng)色譜法分離的二糖、寡糖組分進(jìn)行更加靈敏的檢測(cè)和鑒別。應(yīng)用主成分分析法(PCA)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明該方法可有效區(qū)分不同來源肝素,用于豬肝素中牛、羊肝素?fù)诫s的檢測(cè)。例如以不被肝素酶Ⅱ降解的四糖為對(duì)象分析,可鑒別豬肝素中10%含量的?；蜓蚋嗡?。

馬志華等[17]的工作中采用SAX-HPLC法對(duì)經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的豬、牛、羊粗品肝素的二糖組成進(jìn)行了定量分析,并對(duì)摻雜有5%～25%牛或羊粗品肝素的豬來源粗品肝素進(jìn)行了二糖定量分析。研究結(jié)果表明該方法可檢測(cè)出豬源粗品肝素中5%羊源粗品肝素?fù)诫s,而對(duì)牛源粗品肝素?fù)诫s不能很好地鑒別。

遲連利等[18-20]的工作中公開了一類通過分析待測(cè)樣品經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖、三糖組分,進(jìn)而分析待測(cè)樣品中是否摻雜有反芻類動(dòng)物肝素的方法。通過分析肝素待測(cè)樣品中全硫酸化三糖和△IA的比值,與豬源肝素標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的數(shù)據(jù)對(duì)比,可以分析待測(cè)肝素樣品中是否摻雜有反芻類動(dòng)物肝素;通過分析依諾肝素鈉待測(cè)樣品中單硫酸化三糖和還原端△IVS的比值,與豬源依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的數(shù)據(jù)對(duì)比,可以分析待測(cè)依諾肝素鈉樣品中是否摻雜有羊源依諾肝素鈉。該方法可以鑒別出豬肝素中10%羊肝素?fù)诫s比例和5%牛肝素?fù)诫s比例。

李瑋濤等[21]的工作中公開了一種通過分析待測(cè)樣品經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后二糖組分,進(jìn)而分析待測(cè)樣品中羊肝素?fù)诫s比例的方法。通過分析肝素待測(cè)樣品中△IS和△IIIA的比值,可回歸計(jì)算出待測(cè)樣品中羊肝素?fù)诫s比例。該方法可以鑒別出豬肝素中5%羊肝素?fù)诫s比例。

Chen等[22]的工作中,經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后的肝素樣品,使用二維液相與質(zhì)譜聯(lián)用方法,先經(jīng)強(qiáng)陰離子交換柱分離再經(jīng)分子排阻色譜柱脫鹽,脫鹽后的組分可通過MS進(jìn)行定性分析。通過此種方法,可以分離、定性酶解后樣品中存在的二糖、肝素酶耐受四糖、鏈接區(qū)等結(jié)構(gòu),并進(jìn)行定量分析。EP肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品的IIS結(jié)構(gòu)較ChP、USP高;對(duì)于鏈接區(qū)結(jié)構(gòu)的含量各標(biāo)準(zhǔn)品又各有差異(ChP>USP>EP)。Zhu等[23]的工作中,肝素經(jīng)肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ完全酶解后,經(jīng)SAX-HPLC、SEC-MS方法,同樣大大提高了對(duì)肝素鈉糖鏈更為細(xì)致的分離和結(jié)構(gòu)鑒定,例如對(duì)還原末端進(jìn)行了較為充分的結(jié)構(gòu)解析。這種組合策略結(jié)合了SAX方法的可靠性、分辨率和質(zhì)譜的靈敏度、定性分析能力,為研究肝素質(zhì)量和結(jié)構(gòu)提供了強(qiáng)有力的工具,有望在區(qū)分肝素不同種屬來源和辨別豬肝素?fù)诫s方面,發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)語

肝素是臨床上廣泛應(yīng)用的一種抗凝藥物,受限于豬腸黏膜來源肝素供應(yīng)的緊張,市場(chǎng)上一直存在不法商家以其它來源肝素?fù)诫s入豬腸黏膜肝素的行為,此舉一會(huì)損害正常合法的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)運(yùn)行規(guī)律,劣幣驅(qū)逐良幣;二會(huì)損害我國(guó)肝素產(chǎn)品、肝素生產(chǎn)廠家在國(guó)際上的信譽(yù)度[24];三最為嚴(yán)重的是摻雜肝素?zé)o充分的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn),若臨床上醫(yī)生按照豬腸黏膜來源肝素的使用方案使用的卻是摻雜肝素,可能引發(fā)嚴(yán)重的臨床事故,嚴(yán)重影響人民群眾的生命安全。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了近年來不同種屬來源肝素組成與結(jié)構(gòu)分析方法的研究進(jìn)展,期望能為肝素市場(chǎng)的規(guī)范性和保護(hù)人民群眾的健康做出點(diǎn)滴貢獻(xiàn)。