包美美,許盼盼,吳春麗

包美美,許盼盼,吳春麗,金華市人民醫(yī)院血透室 浙江省金華市 321000

核心提要 背景 四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)中毒是化工從業(yè)人員常見的中毒類型,但目前尚無特效的臨床藥物能治療此類中毒導致的肝、腎、腸損傷.目的 探索連續(xù)性血液透析濾過(continuous blood purification,CBP)對口服CCl4中毒大鼠肝、腎、腸功能的保護作用及其潛在干預機制.方法 將斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬状笫蠓譃閷φ战M、模型組(CCl4)和CBP治療組(CCl4+CBP),利用CCl4灌胃建立大鼠模型.收集外周血用于檢測白細胞和中性粒細胞數以及血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(alanine aminotransferase,AST)、D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)、腸性脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)和降鈣素(procalcitonin,PCT)的水平.將收集的肝腎腸組織進行相關病理檢測,免疫組化法和免疫印跡法檢測核轉錄因子(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路的相對表達水平.結果 CBP處理可顯著降低CCl4引起的白細胞和中性粒細胞增多(P＜0.05)以及血清BUN、Cr、CRP、ALT、AST、D-LA、I-FABP和PCT的水平的增高(P＜0.05),并降低腎臟組織中損傷標記物中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的表達以及肝、腎、腸相關病理形態(tài)改變.免疫組化和免疫印跡法檢測顯示,CBP處理能降低CCl4引起的NF-κB通路激活(P＜0.05).結論 CBP對CCl4引起的肝、腎、腸損傷具有保護效果,其可能通過降低CCl4引起NF-κB通路激活從而改善肝、腎、腸損傷的癥狀.

0 引言

腎功能損傷通常由化學毒素、藥物過量等毒性因素引起[1].四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)為常見的一種工業(yè)溶劑,是公認的肝毒素[2].肝臟并不是CCl4唯一的毒靶器官,其還在如腎、腸、肺、睪丸、腦和血液等其它器官或組織中誘發(fā)自由基的生成并造成損害[3].目前已有證據表明接觸或誤服CCl4可誘發(fā)急性和慢性的肝、腎、腸損傷[4],由此引起的肝、腎、腸功能下降可導致嚴重的并發(fā)癥,嚴重威脅人類健康.目前針對此類疾病尚無特異的干預措施.目前已建立成熟的口服CCl4中毒的相關動物模型,此可為理解CCl4中毒導致的相關肝、腎、腸等器官損傷的病理生理學機制及開發(fā)相關療法提供極好的模型方法.

Kramer等[5]人于1977年報道了連續(xù)動靜脈血液濾過作為急性腎衰竭患者的治療方案.此后,源自此策略的一系列治療模式被命名為連續(xù)性腎臟替代療法,也稱為連續(xù)性血液凈化或連續(xù)性血液透析濾過(continuous blood purification,CBP)[6].近年來,CBP在清除重大疾病中的炎癥介質中的應用一直是危重病醫(yī)學研究的熱點.口服CCl4中毒誘導器官損傷的動物模型可模擬臨床中常見的急性肝、腎、腸損傷疾病模型.在本研究中,我們探究了CBP對CCl4引起的肝、腎、腸損傷的潛在保護作用.

1 材料和方法

1.1 材料 核轉錄因子(nuclear transcription factor-κB,NFκB)p65(A2547)和中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)抗體(A3176)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(AF1186)抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記山羊抗兔二抗(A0208)、花青素3(cyanine 3,Cy3)綴合的山羊抗兔二抗(A0516)、蛋白裂解液(P0013C)、考馬斯亮藍法蛋白測定試劑盒(P0006C)和BeyoECL增強發(fā)光試劑盒(P0018S)購自上海碧云天生物技術有限公司;血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)(C013-2-1)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)(H126-1-2)、肌酐(creatinine,Cr)(C011-2-1)、谷丙轉氨酶(alanine transaminase,ALT)(C009-3-1)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST)(C010-3-1)、D-乳酸(D-lactic acid,D-LA)(A019-2-1)、腸性脂肪酸結合蛋白(intestinal fatty acid-binding protein,I-FABP)(H265-1-1)和降鈣素(procalcitonin,PCT)(H153)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(streptavidin-perosidase,SP)法檢測試劑盒(SP0021)購自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組處理: 18只雄性7 wk齡斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠(200 g-230 g)購自杭州啟真實驗動物科技有限公司(SCXK(浙)2022-0005),在維持22 ℃-25 ℃和保持12 h/12 h的光/暗循環(huán)的屏障環(huán)境中飼養(yǎng),自由進食和飲水.在實驗中,將大鼠隨機分為三組: 對照組、模型組(CCl4)和CBP治療組(CCl4+CBP),每組納入6只SD大鼠.對照組大鼠灌胃生理鹽水,CCl4組和CCl4+CBP組給大鼠灌胃CCl4(溶于11%橄欖油),劑量為1 mL/kg.CBP治療方法參照文獻[7],通過右頸內靜脈插入雙向留置導管,形成體外循環(huán)系統(tǒng),用稀釋法以200 mL/min的流速注入替代液,在連接導管前,用肝素-生理鹽水(5000 U/L)循環(huán)沖洗右頸內靜脈30 min,治療期間用1500 U/h的肝素持續(xù)抗凝,透析處理持續(xù)24 h.實驗第3天,收集大鼠眼眶靜脈血2.5 mL,麻醉后處死大鼠,立即取出肝臟、腎臟和腸,用生理鹽水沖洗3次以去除血液,然后分為倆部分,一部分用石蠟包埋用于后續(xù)病理研究,另一部分儲存在80 ℃下用于蛋白免疫印跡檢測.實驗程序按照實驗動物管理和使用的指導原則進行.

1.2.2 血生化測定: 每只大鼠取0.3 m L靜脈血用EDTA-K2抗凝后,用VH20型血細胞分析儀(深圳市錦瑞生物科技股份有限公司)對血中白細胞(white blood cell,WBC)和中性粒細胞(neutrophil,NEU)計數.剩余外周靜脈血以2500 rpm離心5 min,收集血清,并根據試劑盒說明書步驟檢測血清中BUN、CRP、Cr、ALT、AST、D-LA、I-FABP和PCT水平.

1.2.3 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色組織病理學: 將石蠟包埋的肝、腎和腸組織切為6 μm厚的切片.將切片用二甲苯脫蠟,然后在從高到低不同濃度的酒精中對組織進行再水合.組織切片行HE染色.在CX23型光學顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察.

1.2.4 免疫熒光和免疫組化染色: 將不同分組的組織切片按上述方法進行脫蠟水合后,分別進行免疫熒光和免疫組化染色.對于免疫熒光染色,腎組織切片用10%山羊血清室溫封閉1 h,滴加抗NGAL抗體(1:500)在4 ℃下孵育過夜,洗片后,用Cy3綴合的山羊抗兔二抗(1:500)在37 ℃下避光孵育60 min,切片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復染,在BX53M型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察.對于免疫組化染色,按免疫組化SP法檢測試劑盒說明書步驟,組織切片經3%雙氧水處理和10%山羊血清室溫封閉后,滴加NF-κB p65抗體(1:300)在4℃下孵育過夜,按SP法進行免疫組化,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,在CX23型光學顯微鏡下觀察.

1.2.5 蛋白質免疫印跡檢測: 分別將肝、腎和腸組織切成大小大致相同的小塊,以150-250 μL/20 mg組織的比例加入蛋白質裂解緩沖液(含1%蛋白酶磷酸酶抑制劑),勻漿,在冰上裂解30 min以完全溶解組織.在4 ℃下裂解的樣品以12000 rpm離心10 min.用考馬斯亮藍法蛋白測定試劑盒測量上清液中的蛋白濃度.取含等量蛋白的裂解上清液通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離目標蛋白,并轉印到聚偏二氟乙烯膜上.封閉后,加入NF-κB p65抗體(1:2000)和GAPDH抗體(1:8000)4 ℃下孵育過夜.用0.5%吐溫20緩沖液沖洗膜后,室溫下孵育HRP標記山羊抗兔二抗(1:2000)1 h.用BeyoECL增強發(fā)光試劑盒顯像,用Image J軟件量化NF-κB p65蛋白的相對表達水平.

統(tǒng)計學處理用GraphPad Prism 8.0.0軟件分析數據,結果表示為均數±標準差(mean±SD).用單因素方差分析組間差異.P＜0.05的值表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠血液生化指標的影響 首先通過血液生化法檢測了創(chuàng)傷/炎性指標(WBC和NEU細胞計數、CRP和PCT水平)、腎功能指標(BUN和Cr水平)、肝功能指標(ALT和AST水平)和腸功能指標(D-LA和I-FABP水平).表1結果所示,CCl4導致大鼠肝腎腸損傷,表現為WBC和NEU細胞增多(P＜0.05)、CRP、PCT、BUN、Cr、ALT、AST、D-LA和I-FABP水平均顯著升高(均P＜0.05),而CBP能有效降低CCl4誘導的上述指標(均P＜0.05).

表1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠血液學指標的影響(mean±SD,n=6)

2.2 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現的影響 本研究對CBP參與改善CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現進行了HE染色觀察檢測.對照組大鼠的肝、腎、結腸和小腸的病理形態(tài)正常.CCl4組大鼠的肝、腎、腸組織病理形態(tài)學均發(fā)生了明顯改變,表現為: 肝實質肝細胞呈灶狀或帶狀壞死、細胞凋亡和氣球樣變、匯管區(qū)和肝小葉內炎性細胞浸潤;腎小管部分上皮細胞空泡變性、系膜基質擴張且有明顯的腎小球肥大及腎小球體積增加;小腸和結腸組織的絨毛變短和結構不清晰、絨毛黏膜上皮層的上皮細胞受到破壞.CCl4+CBP組大鼠的肝、腎、腸組織病理形態(tài)學均較CCl4組得到明顯改善.具體見圖1所示.

圖1 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織病理形態(tài)表現的影響(HE染色法).CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4:四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.

2.3 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠腎損傷的影響 本研究進一步采用免疫熒光標記NGAL評估了CBP對CCl4模型大鼠腎損傷的影響,熒光染色(圖2)顯示,CCl4組急性腎損傷的生物標志物NAGL的熒光表達豐度較對照組明顯增高,說明CCl4組大鼠發(fā)生了腎損傷;而CCl4+CBP組腎組織中NAGL表達較CCl4組明顯降低,說明CBP能降低CCl4導致的腎損傷.

圖2 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠腎損傷標記物NAGL表達的影響(免疫熒光染色法).DAPI: 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚;NAGL: 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白;CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4: 四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.

2.4 連續(xù)性血液透析濾過對CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織NF-κB通路激活的影響 為研究CBP對CCl4誘發(fā)肝、腎、腸損傷的保護作用的機制,本研究采用免疫組織化學法和蛋白免疫印跡法檢測肝、腎、腸組織中NF-κB的表達情況,圖3結果顯示,CCl4誘導了肝、腎、腸組織中NF-κB p65表達上調(P＜0.05);而CBP則有效降低了CCl4導致該通路激活,即: NF-κB p65表達較CCl4組明顯降低(P＜0.05).

圖3 連續(xù)性血液透析濾過抑制CCl4模型大鼠肝、腎、腸組織NF-κB通路激活. A: 每組大鼠肝組織代表性NF-κB p65免疫組織化學染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達量(右);B: 每組大鼠腎組織代表性NF-κB p65免疫組織化學染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達量(右);C: 每組大鼠結腸組織代表性NF-κB p65免疫組織化學染色圖像(左)、蛋白免疫印跡檢測(中)及相對表達量(右).NF-κB p65: 核轉錄因子p65;CBP: 連續(xù)性血液透析濾過;Ctrl: 對照組;CCl4: 四氯化碳,模型組;CCl4+CBP: 連續(xù)性血液透析濾過治療組.aP＜0.05,與對照組相比;bP＜0.05,與模型組相比;n=6.

3 討論

CCl4中毒主要見于是二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷及氯仿等化工從業(yè)人員.常見的CCl4中毒方式包括吸入高濃度CCl4蒸汽中毒和接觸、口服CCl4中毒.盡管CCl4中毒方式存在差異,但CCl4最為突出的是肝臟損害,另外腎臟也為CCl4損傷靶器官,其還能引起胃腸功能紊亂和其他靶器官損傷[3,4,8,9],而目前尚無特效藥物對此類損傷進行干預.近來研究認為,CBP不僅可維持機體水平衡和排泄代謝產物,還可調節(jié)炎癥和促進器官恢復,尤其是腎衰竭相關疾病的重要治療策略[10,11].另外,CBP也常用于其他急性器官損傷的治療[12],但其確切機制尚不清楚.本研究通過CCl4口服(灌胃)法建立了大鼠的急性內臟損傷模型,并在此探索了CBP對CCl4引起內臟損傷的保護性作用效果,發(fā)現其可改善CCl4導致的大鼠肝、腎、腸損傷,并初步揭示了其作用可能與抑制NF-κB信號活性有關.

眾所周知,過度的炎性反應是急性多器官損傷發(fā)生的關鍵病理學因素.炎性介質的釋放,刺激細胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6和白細胞介素-1β等)、趨化因子和粘附分子的產生,級聯(lián)放大反應,進一步增強了炎性損傷[13].另一方面,活性氧的產生能導致氧化應激和線粒體損傷,加劇炎性反應和細胞凋亡[14].因此,抑制炎性微環(huán)境在治療急性器官損傷中起著重要作用.本研究顯示,CBP能降低CCl4造模大鼠外周血中WBC和NEU細胞計數以及血清CRP和PCT水平,體現了CBP能清除促炎性介質的能力.此外,本研究以腎功能(BUN和Cr水平)、肝功能(ALT和AST水平)和腸功能(D-LA和I-FABP水平)生化標記物、組織形態(tài)學表現以及腎組織損傷標志物水平的改變證實了CBP對CCl4造成的肝、腎、腸損傷的治療效果.

既往研究證實了NF-κB信號通路可通過炎性反應參與調節(jié)急性器官損傷的進展[15,16].NF-κB信號通路在組織中的改變與損傷發(fā)生及緩解密切相關,其被認為是急性器官損傷中的細胞因子信號通路、細胞應激反應和炎癥因子生成的關鍵中樞信號通路[15-18].已有研究表明,抑制NF-κB信號通路能減輕CCl4導致的動物模型中肺、肝、腎和腸損傷[17,19-21].為探討CBP對CCl4造成的內臟損傷的改善作用是否與NF-κB通路有關,我們實驗分析了各組肝、腎和腸組織中NF-κB p65表達,發(fā)現NF-κB p65在CCl4造模大鼠中高表達,而給予CBP治療后其表達降低,提示CBP可能至少通過抑制CCl4肝、腎和腸組織中NF-κB信號激活,進而改善急性器官損傷的炎性反應以及損傷癥狀;但其中涉及的具體機制仍需進一步闡明.

4 結論

總之,本研究提示CBP可改善CCl4造成的肝、腎和腸損傷,其機制至少與抑制NF-κB信號介導的炎性反應有關,但具有機制仍需進一步闡明.另外,本研究還提示了CBP治療可能是治療肝、腎和腸損傷尤其是腎損傷的潛在候選干預策略.在應對器官損傷時,應嚴格考慮多器官并發(fā)損傷的潛在因素,尤其存在腎損傷可能時應及時給予CBP治療.

文章亮點

實驗背景

四氯化碳中毒可引起肝臟、腎臟和腸等器官損傷,而目前針對此類損傷尚無特效的干預措施.

實驗動機

連續(xù)性血液透析濾過是急重性內臟器官損傷的常見干預措施,而其對四氯化碳中毒可引起肝臟、腎臟和腸等器官損傷的干預效果尚不清楚.

實驗目標

以灌胃法建立四氯化碳中毒模型大鼠,觀察連續(xù)性血液透析濾過是否對四氯化碳中毒大鼠的肝、腎、腸發(fā)揮器官保護作用.

實驗方法

收集大鼠外周血及肝、腎和腸組織,進行血液生化檢測和病理學檢測.免疫熒光法觀察腎損傷標記物中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白表達,免疫組織化學和免疫印跡法檢測核轉錄因子p65的表達.

實驗結果

連續(xù)性血液透析濾過改善四氯化碳中毒大鼠的血液生化指標及肝、腎、腸組織的病理學形態(tài),降低腎組織中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的表達及肝、腎、腸組織中核轉錄因子p65的表達.

實驗結論

連續(xù)性血液透析濾過能對四氯化碳中毒大鼠的肝、腎、腸發(fā)揮器官保護作用.

展望前景

連續(xù)性血液透析濾過可能是四氯化碳中毒的潛在候選干預策略,特別是存在腎損傷可能時應及時給予連續(xù)性血液透析濾過干預.