楊妹妹 梁詠梅 招麗君 梁云飛 蘭 星　

三七總皂苷注射劑除熱原方法的效果及對有效成分的影響研究

楊妹妹1,2梁詠梅1,2招麗君1,2梁云飛1,2蘭 星1,2

（1.廣西梧州制藥集團（股份）有限公司，廣西 梧州 543002；2.廣西三七綜合利用技術(shù)重點實驗室，廣西 梧州 543002）

目的：考察三七總皂苷注射劑除熱原方法的效果及其對三七總皂苷有效成分的影響。方法：外加細菌內(nèi)毒素模擬熱原污染，采用動態(tài)濁度法和高效液相色譜法檢測藥用炭吸附及無菌濾膜過濾前后三七總皂苷藥液中細菌內(nèi)毒素及有效成分含量，分別計算內(nèi)毒素去除率和三七總皂苷回收率。結(jié)果：細菌內(nèi)毒素標準曲線值為0.998 2，符合要求；三七總皂苷供試品最小無干擾稀釋倍數(shù)為128倍；以水為溶質(zhì)時，藥用炭對細菌內(nèi)毒素最小飽和吸附濃度為0.1%；以三七總皂苷為溶質(zhì)時，細菌內(nèi)毒素最小飽和吸附濃度為0.5%；藥用炭吸附后再通過過濾手段能進一步提高細菌內(nèi)毒素去除率；藥用炭對不同濃度的藥液存在不同吸附影響。結(jié)論：同時采取藥用炭吸附與過濾兩種手段能有效除去細菌內(nèi)毒素，但對于突發(fā)大污染情況，常規(guī)藥用炭用量可能不能完全控制細菌內(nèi)毒素的清除。

三七總皂苷；動態(tài)濁度法；細菌內(nèi)毒素；藥用炭

引言

熱原反應是注射劑給藥過程中常見的安全性問題之一[1-3]，由熱原引起的不良反應事件被多次報道，如2009年的香丹注射液、2015年的生脈注射液、2017年的紅花注射液[4]。因此對于注射劑生產(chǎn)全過程熱原的控制尤為重要，而在生產(chǎn)過程中溶劑的貯存、使用，原輔料、配制注射劑的裝置、用具、容器等均有可能帶入熱原[5]。國家食品藥品監(jiān)督管理局對生產(chǎn)過程除熱原的方法及效果作出了明確的要求[6]。三七總皂苷注射劑生產(chǎn)過程以藥用炭吸附和過濾為主要的除熱原手段，其中飽和吸附又是藥用炭除熱原效果的影響因素之一[7,8]。本研究采用外加細菌內(nèi)毒素模擬中藥注射劑熱原污染，以動態(tài)濁度法檢測藥用炭吸附及過濾前后藥液中細菌內(nèi)毒素含量，考察熱原去除效果，檢測三七總皂苷含量變化，探討藥用炭對三七總皂苷有效成分的影響，為三七總皂苷注射劑的生產(chǎn)工藝中去除熱原方法提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BET-48G細菌內(nèi)毒素檢測儀（廠家：天津市天大天發(fā)科技有限公司，儀器型號：BET-48G）；電子天平[廠家：丹佛儀器（北京）有限公司，儀器型號：TP-214]；超聲波清洗機（廠家：寧波新芝生物科技股份有限公司，儀器型號：SB-5200-DTD）；ZH-3自動旋渦混合器（廠家：天津藥典標準儀器廠，儀器型號：ZH-3）；Thermo高效液相色譜儀（廠家：賽默飛世爾科技（中國）有限公司，儀器型號：Uitimate 3000）；電子分析天平（廠家：METTLER TOLEDO，儀器型號：MS204S）。

1.2 材料

三七總皂苷（PNS，廣西梧州制藥集團股份有限公司，批號：190202-2、190203-2、190301）；三七總皂苷對照（中國食品藥品檢定研究院，批號：110870-201904，規(guī)格：100 mg/支）；細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-202088，效價：60 EU/支）；細菌內(nèi)毒素檢查用水（中國食品藥品檢定研究院，批號：160006-201805，規(guī)格：10×5 mL）；動態(tài)濁度鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號：2009041、2010140）；動態(tài)濁度法鱟試劑（廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，批號：20104121，規(guī)格：1.7 mL/支）；甲醇（北京迪科馬科技有限公司；批號：R141823，色譜純）；乙腈（北京迪科馬科技有限公司，批號：R141792，色譜純）；藥用炭（上海興長活性炭有限公司，批號：Q251a2008020）；無熱原安瓿（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1912020，規(guī)格：2 mL/支）；無熱原安瓿（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1912250，規(guī)格：5 mL/支）；無熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號：2005021，規(guī)格：1 000 μL）；無熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號：2004211，規(guī)格：250 μL）；無菌一次性過濾裝置（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號：1258276，規(guī)格：0.45 μm）；無菌一次性過濾裝置[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號：1267078，規(guī)格：0.2 μm]；水（Millipore）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準曲線的可靠性試驗

用細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作標準品進行稀釋，分別配制成2、0.5、0.125、0.031 25 EU/mL的系列標準品溶液。取系列標準品溶液各0.1 mL加入預先添加0.1 mL鱟試劑的反應管內(nèi)，每個濃度2個平行管，同時設(shè)置檢查用水為陰性對照，反應管放入細菌內(nèi)毒素檢測儀中進行檢測。以細菌內(nèi)毒素濃度為橫坐標，反應時間的對數(shù)為縱坐標，得回歸方程：LgT=2.88 716-0.318 51 LgC，=-0.998 2，陰性對照反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，∣∣大于0.98，變異系數(shù)CV小于10%，標準曲線成立，表明線性關(guān)系良好。結(jié)果見表1。

表1 動態(tài)濁度法標準曲線的可靠性試驗結(jié)果（n=2）

注“/”表示無對應值。

2.2 干擾試驗

2.2.1 不同批次三七總皂苷干擾試驗

取三七總皂苷適量，加純化水溶解使成為濃度150 mg/mL的母液。根據(jù)最大稀釋倍數(shù)，取母液分別稀釋32、64、128、256、512倍，使成為濃度分別為4.687 5、2.343 75、1.171 875、0.585 937 5、0.292 9 mg/mL的系列溶液A三七總皂苷，平行配制三批系列溶液A三七總皂苷。每個濃度的三七總皂苷稀釋液加入細菌內(nèi)毒素工作標準品，制成含0.25 EU/mL細菌內(nèi)毒素的供試品陽性系列溶液B。動態(tài)濁度法檢測系列溶液A三七總皂苷、溶液B細菌內(nèi)毒素濃度，計算3個不同批次三七總皂苷供試品在相應稀釋倍數(shù)下的細菌內(nèi)毒素回收率。當稀釋倍數(shù)在128～512倍范圍內(nèi)，內(nèi)毒素回收率在50%～200%之間，表明該試驗濃度條件下供試品溶液不存在干擾作用，三七總皂苷供試品最小不干擾稀釋倍數(shù)為128倍。結(jié)果見表2。

表2 不同批次三七總皂苷細菌內(nèi)毒素干擾試驗結(jié)果

2.2.2 不同廠家鱟試劑干擾試驗

隨機取三七總皂苷一批按照“2.2.1”項下溶液制備方法制備系列溶液A三七總皂苷、溶液B。取系列溶液A三七總皂苷、溶液B使用兩個不同生產(chǎn)廠家鱟試劑進行干擾試驗，計算系列溶液細菌內(nèi)毒素回收率。使用兩個不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑進行干擾試驗，三七總皂苷樣品（150 mg/mL）在稀釋倍數(shù)128～512倍范圍內(nèi)的試驗濃度條件下檢測內(nèi)毒素回收率均在50%～200%之間，則在此實驗條件下均不存在干擾作用，最小不干擾稀釋倍數(shù)為128倍，表明兩個不同生產(chǎn)廠家檢測結(jié)果相比無明顯差別。結(jié)果見表3。

表3 不同廠家鱟試劑干擾試驗結(jié)果

2.3 藥用炭對細菌內(nèi)毒素飽和吸附試驗

配制含細菌內(nèi)毒素濃度為0.25 EU/mL的100 mL水溶液4份，在4份溶液中分別加入4種濃度為0.05%、0.1%、0.5%、1.0%的藥用炭，60℃～65℃攪拌吸附30 min，經(jīng)0.45 μm無菌一次性過濾裝置過濾得到藥用炭吸附后的濾液，動態(tài)濁度法分別測定各濾液中細菌內(nèi)毒素的含量。結(jié)果顯示，當藥用炭濃度為0.05%時，吸附后水溶液中內(nèi)毒素含量明顯降低，從初始0.25 EU/mL降至0.098 2 EU/mL，除菌率為60.72%；當藥用炭濃度增至0.1%及以上時，內(nèi)毒素則完全被除去，說明藥用炭能夠通過吸附作用有效去除水溶液中的細菌內(nèi)毒素，且內(nèi)毒素去除率與藥用炭濃度呈正相關(guān)，最少使用量為0.1%。結(jié)果見表4。

表4 藥用炭對細菌內(nèi)毒素飽和吸附試驗結(jié)果

注“/”表示無對應值。

2.4 藥用炭對三七總皂苷吸附影響試驗

2.4.1高效液相色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，進樣量10 μL，按下表進行梯度洗脫；檢測波長為203 nm。理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應不低于8 000。

表5 流動相梯度表

2.4.2對照品溶液的制備

取三七總皂苷對照提取物適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2.5mg的溶液，即得。

2.4.3供試品溶液的制備

模擬三七總皂苷注射劑生產(chǎn)工藝，精密稱取三七總皂苷粉末適量，溶解配制成濃度為125 mg/mL的三七總皂苷藥液4份各100 mL，分別加入0.05%、0.1%、0.5%、1.0% 4種濃度藥用炭，攪拌吸附，經(jīng)0.45 μm無菌一次性過濾裝置過濾得藥用炭吸附后藥液，分別取藥用炭吸附前后藥液各0.32 mL于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。按“2.4.1”項下色譜條件檢測并計算吸附前后三七總皂苷中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd總含量，計算回收率。結(jié)果顯示，藥用炭吸附前后藥液三七總皂苷含量的回收率在100%～102%范圍內(nèi)，三七總皂苷含量隨著藥用炭的增加無明顯變化，表明藥用炭在0.05%～1%范圍內(nèi)對高濃度三七總皂苷溶液（125 mg/mL）幾乎無吸附影響。結(jié)果見表6。

表6 藥用炭吸附前后三七總皂苷含量及回收率結(jié)果

2.5 藥用炭和過濾對細菌內(nèi)毒素污染的三七總皂苷吸附試驗

根據(jù)干擾實驗，最小不干擾稀釋倍數(shù)為128倍，即三七總皂苷濃度為1.171 9 mg/mL，為避免濃藥液對細菌內(nèi)毒素檢測的干擾，因此該試驗中三七總皂苷供試品溶液濃度選擇1.171 9 mg/mL。

稱取三七總皂苷粉末適量，溶解配制成濃度為1.171 9 mg/mL的藥液4份，各100 mL，分別外加細菌內(nèi)毒素工作標準品，得三七總皂苷原液。每份原液加入0.05%、0.1%、0.5%、1.0% 4種濃度藥用炭，攪拌吸附得三七總皂苷吸附液，將吸附液用0.2 μm無菌一次性過濾裝置過濾，得過濾液。分別計算吸附液、過濾液的細菌內(nèi)毒素去除率及三七總皂苷含量的回收率。結(jié)果顯示：隨著藥用炭濃度（0.05%～1%）的增加三七總皂苷藥液回收率逐漸減?。?6.56%→9.2%），藥用炭濃度小于或等于0.1%時，三七總皂苷回收率大于90%，當藥用炭濃度大于或等于0.5%時，三七總皂苷損失大于50%，藥用炭對低濃度三七總皂苷（1.171 9 mg/mL）吸附影響較大；吸附液過濾后，細菌內(nèi)毒素含量進一步降低，藥用炭含量為0.1%及以上時，除菌率大于90%。結(jié)果見表7、表8。

表7 三七總皂苷含量及回收率結(jié)果

表8 細菌內(nèi)毒素含量及去除率結(jié)果

注“/”表示無對應值。

3 結(jié)論

（1）一般注射劑常用藥用炭及過濾除菌作為熱原去除手段，從藥用炭對細菌內(nèi)毒素飽和吸附實驗結(jié)果看，完全吸附除去細菌內(nèi)毒素的最小藥用炭濃度為0.1%，筆者模擬三七總皂苷藥液外源性突發(fā)污染情況，0.1%藥用炭除菌率卻只有83.49%，當藥用炭使用量達到0.5%時，細菌內(nèi)毒素去除率才能達到100%，假如三七總皂苷藥液在生產(chǎn)過程發(fā)生突發(fā)污染情況，單純使用常規(guī)用量藥用炭可能達不到對細菌內(nèi)毒素的除菌效果。

（2）將藥用炭吸附液通過0.2 μm微孔濾膜裝置過濾，過濾液中三七總皂苷的含量與吸附液相比無差別，表明過濾步驟對三七總皂苷溶液濃度無顯著影響，而過濾液的細菌內(nèi)毒素含量較吸附液時有下降，提示過濾除菌手段能進一步提高除菌率。

（3）三七總皂苷注射劑在生產(chǎn)過程采用藥用炭與過濾手段除去細菌內(nèi)毒素，但對于大劑量的細菌內(nèi)毒素，常規(guī)方法的除去效果并不能達到100%，需要對工藝風險進行合理評估，保證最終產(chǎn)品的臨床安全性。

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Study on the Effect of Depyrogenation Method of Panax Notoginsenosides Injection and Its Influence on Active Ingredients

Objective: To investigate the effect of depyrogenation method of Panax notoginsenosides injection and its influence on active ingredient of Panax notoginsenosides. Methods: The bacterial endotoxin was added to simulate pyrogen pollution, and the content of bacterial endotoxin and active ingredient in Panax notoginsenosides solution before and after medicinal charcoal adsorption and sterile membrane filtration were detected by dynamic turbidimetry and high-performance liquid chromatography. The endotoxin removal rate and recovery rate of Panax notoginsenosides were calculated respectively. Results: Thevalue of the bacterial endotoxin standard curve is 0.9982, which meets the requirements; the minimum non-interference dilution ratio of Panax notoginsenosides for the test sample is 128 times; when water is used as the solute, the minimum saturated adsorption concentration of bacterial endotoxins on medicinal charcoal is 0.1%; when using Panax notoginsenosides as solute, the minimum saturated adsorption concentration of bacterial endotoxin is 0.5%; the adsorption of medicinal charcoal and subsequent filtration can further improve the removal rate of bacterial endotoxins; medicinal charcoal has different adsorption effects on different concentrations of medicinal solutions. Conclusion: Both medical carbon adsorption and membrane filtration can effectively remove bacterial endotoxins, but for sudden large pollution situations, conventional dosage of medicinal charcoal may not fully control the clearance of bacterial endotoxins.

Panax notoginsenosides; dynamic turbidity method; bacterial endotoxin; medicinal charcoal

R282

A

1008-1151(2023)09-0026-04

2023-04-27

中央引導地方科技發(fā)展資金項目（桂科ZY22096004）；廣西科技基地和人才專項（桂科AD20297068）；梧州市科技計劃項目（202202022）。

楊妹妹（1993－），女，廣西梧州制藥集團（股份）有限公司助理工程師，研究方向為藥品生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標準研究。

梁詠梅（1994－），女，廣西梧州制藥集團（股份）有限公司助理工程師，研究方向為藥品生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標準研究。