黎光楊 王之盛* 胡 瑞 鄒華圍 姜雅慧 代秦丹 梁秀容 張祺琪 王艷陽(yáng) 彭全輝 周振勇 張 楊 朱兵山

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所,肉用牛低碳養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì),四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611130;2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所,烏魯木齊 830000;3.新疆刀郎陽(yáng)光農(nóng)牧科技股份有限公司,喀什 844000)

隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料原料的匱乏成為我國(guó)飼料行業(yè)面臨的主要問(wèn)題。此外,隨著玉米、豆粕減量替代計(jì)劃推出,傳統(tǒng)玉米-豆粕型飼糧結(jié)構(gòu)逐步發(fā)生變化,多元化飼料配方將成為我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的常態(tài)。因此,開(kāi)發(fā)新的飼料原料和充分利用現(xiàn)有飼料原料是行業(yè)發(fā)展的重要目標(biāo)。

我國(guó)是產(chǎn)棉大國(guó),棉花加工副產(chǎn)物全棉籽(whole cottonseed,WCS)產(chǎn)量豐富。全棉籽既能提供能量和蛋白質(zhì),又能提供有效纖維,是極具潛力的反芻動(dòng)物飼料原料[1]。但由于存在游離棉酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子、蛋白質(zhì)品質(zhì)不高、消化利用率低等問(wèn)題,使得全棉籽的飼料化利用存在一定限制[2-3]。微生物固態(tài)發(fā)酵是改善飼料原料品質(zhì)的有效手段[4]。Sun等[5]通過(guò)固態(tài)發(fā)酵棉籽粕、代秦丹等[6]通過(guò)固態(tài)發(fā)酵酒糟發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后棉籽粕和酒糟營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到顯著改善。因此,本試驗(yàn)以解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)作為發(fā)酵菌種,固態(tài)發(fā)酵全棉籽,結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選出全棉籽適宜的發(fā)酵條件,評(píng)估發(fā)酵效果和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,以期為全棉籽的飼料資源化高效利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種:解淀粉芽孢桿菌T11(BacillusamyloliquefaciensT11)為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室篩選保藏的菌株,保藏號(hào)為CCTCC M 20211450,保藏地為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北武漢)。

發(fā)酵底物:全棉籽、玉米面和麥麩按8∶1∶1比例混勻作為發(fā)酵底物。全棉籽采自新疆喀什,粗蛋白質(zhì)含量為25.56%;玉米面和麥麩采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)科研基地,粗蛋白質(zhì)含量分別為7.61%和15.66%。稱取20 g發(fā)酵底物,裝入250 mL三角瓶中,按照設(shè)定的試驗(yàn)條件進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。

1.2 種子液的制備

將保藏的解淀粉芽孢桿菌T11菌液接種到鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,挑取1接種環(huán)的菌株接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于39 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16 h,作為種子液[6]。此菌液濃度下進(jìn)行平板計(jì)數(shù),測(cè)得其濃度約為2.03×107CFU/mL。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵因素初步優(yōu)化,發(fā)酵因素分別為發(fā)酵溫度(30、33、36、39和42 ℃;此時(shí)固定發(fā)酵時(shí)間4 d,接種量20%,料水比1∶0.8)、發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5和6 d;此時(shí)固定發(fā)酵溫度39 ℃,接種量20%,料水比1∶0.8)、接種量(10%、15%、20%、25%和30%,體積質(zhì)量比,即v/m;此時(shí)固定發(fā)酵溫度39 ℃,發(fā)酵時(shí)間5 d,料水比1∶0.8)、料水比(1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0和1∶1.2;此時(shí)固定發(fā)酵溫度39℃,發(fā)酵時(shí)間5 d,接種量25%),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、接種量(C)、料水比(D)進(jìn)行4因素3水平條件優(yōu)化,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量。根據(jù)極差分析和方差分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.3 體外發(fā)酵試驗(yàn)

晨飼前2 h采集3頭體況良好的黃牛瘤胃液,混勻后過(guò)濾到充滿二氧化碳(CO2)且預(yù)熱至39 ℃的密封保溫瓶中,并立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。黃牛飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地。

參照Menke等[7]方法配制人工瘤胃液并進(jìn)行體外發(fā)酵。設(shè)置對(duì)照組(以未發(fā)酵全棉籽為底物)和發(fā)酵組(以發(fā)酵全棉籽為底物,該發(fā)酵全棉籽是由正交試驗(yàn)得到的適宜條件經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵獲得),并設(shè)未添加任何底物的空白對(duì)照,用于矯正累積產(chǎn)氣量。在發(fā)酵3、6、9、12、24、48 h時(shí)記錄產(chǎn)氣量;在發(fā)酵12、24、48 h時(shí)收集發(fā)酵液,測(cè)定pH后,分裝發(fā)酵液用于發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算

干物質(zhì)(DM)、粗灰分(Ash)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗蛋白質(zhì)(CP)含量分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6438—2007、GB/T 6434—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2022、GB/T 6432—2018中方法測(cè)定;樣品經(jīng)硫酸銅沉淀法預(yù)處理后參照文獻(xiàn)[8]的方法測(cè)定真蛋白質(zhì)(TP)含量;氨基酸含量的測(cè)定參照GB/T 18246—2019;游離棉酚含量的測(cè)定參照GB/T 13086—2020;黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮含量的測(cè)定參照NY/T 2071—2011,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的測(cè)定參照GB/T 30956—2014;淀粉酶和纖維素酶活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定;蛋白酶活性參照SB/T 10317—1999中的福林法測(cè)定。利用掃描電鏡(HITACHI Regulus 8100)進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)觀察。

采用雷磁25型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液pH。采用堿性次氯酸鈉-苯酚分光光度法[9]進(jìn)行氨態(tài)氮(NH3-N)濃度測(cè)定。使用差速離心法[10]提取微生物蛋白(MCP)沉淀,稀釋后使用BCA蛋白定量測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定MCP濃度。采用氣相色譜儀(CP-3800)測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸濃度,計(jì)算乙酸/丙酸的值,總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度為乙酸、丙酸和丁酸濃度之和。

產(chǎn)氣量的計(jì)算公式[11]為:

GPt=200×(Vt-V0)/W。

式中:GPt為樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL/mg);Vt為樣品發(fā)酵t小時(shí)后發(fā)酵管刻度讀數(shù);V0為樣品在開(kāi)始發(fā)酵時(shí)空白發(fā)酵管刻度讀數(shù);W為樣品干物質(zhì)重量(mg)。

對(duì)產(chǎn)氣量進(jìn)行非線性擬合,計(jì)算公式[12]為:

GPt=a+b×(1-e-ct)。

式中:GPt為t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL/mg);a為快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(mL/mg);b為慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量;c為慢速發(fā)酵部分的產(chǎn)氣速率(%/h);a+b為潛在產(chǎn)氣量(mL/mg);t為發(fā)酵時(shí)間(h)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019整理后,采用SPSS 27.0對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),并使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,并以粗蛋白質(zhì)含量增加率作為效應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行二次回歸統(tǒng)計(jì)分析;對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析;對(duì)發(fā)酵前后全棉籽的營(yíng)養(yǎng)成分含量和體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件下解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵對(duì)全棉籽粗蛋白質(zhì)含量的影響

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。隨著發(fā)酵溫度的升高,粗蛋白質(zhì)含量先上升后下降,當(dāng)發(fā)酵溫度為36和39 ℃時(shí),粗蛋白質(zhì)含量接近且顯著高于其余發(fā)酵溫度時(shí)(P<0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,粗蛋白質(zhì)含量先升高后趨于穩(wěn)定,發(fā)酵4 d及以后時(shí)粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其余發(fā)酵時(shí)間時(shí)(P<0.05)。隨著接種量的增加,粗蛋白質(zhì)含量先升高后下降,當(dāng)接種量為25%時(shí),粗蛋白質(zhì)含量顯著高于其余接種量(P<0.05)。隨著料水比的降低,粗蛋白質(zhì)含量先上升后下降,當(dāng)料水比為1∶0.6時(shí),粗蛋白質(zhì)含量最高且顯著高于其余料水比時(shí)(P<0.05)。根據(jù)單因素試驗(yàn)的回歸分析(表1),可以確定當(dāng)發(fā)酵溫度為38.24 ℃,發(fā)酵時(shí)間為5.03 d,接種量為24.17%,含水量為36.50%(料水比1∶0.6)時(shí),粗蛋白質(zhì)含量最高。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定正交試驗(yàn)選取的4個(gè)因素的3個(gè)水平分別為:發(fā)酵溫度,36、39、42 ℃;發(fā)酵時(shí)間,4、5、6 d;接種量,20%、25%、30%;料水比,1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由極差分析(表2)的R值和方差分析(表3)的F值可知,影響解淀粉芽孢桿菌固體發(fā)酵全棉籽的因素先后順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間、料水比、發(fā)酵溫度和接種量。方差分析結(jié)果表明發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量及料水比均顯著影響粗蛋白質(zhì)含量增加率(P<0.05)。根據(jù)極差分析(表2)的K值可得最佳發(fā)酵組合為:發(fā)酵溫度42 ℃,發(fā)酵時(shí)間6 d,接種量20%,料水比1∶0.6。

表1 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽單因素試驗(yàn)結(jié)果的回歸分析

表2 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

表3 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

2.2 適宜條件下解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽后營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的變化

2.2.1 發(fā)酵前后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化

由表4可知,在正交試驗(yàn)得出的適宜條件下對(duì)全棉籽進(jìn)行發(fā)酵,與發(fā)酵前相比,全棉籽發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量從21.35%提高到25.73%(P<0.05),真蛋白質(zhì)含量從20.24%提高到22.50%(P<0.05),中性洗滌纖維含量變化不顯著(P>0.05),酸性洗滌纖維含量從28.37%降低到27.80%(P<0.05),粗纖維含量從24.96%降低到22.95%(P<0.05),粗灰分含量從4.01%提高到5.27%(P<0.05)。

表4 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽前后常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量對(duì)比(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2.2 發(fā)酵前后氨基酸含量的變化

由表5可知,與發(fā)酵前相比,全棉籽發(fā)酵后谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸含量沒(méi)有顯著變化(P>0.05),脯氨酸含量顯著降低(P<0.05),其他氨基酸含量均顯著提高(P<0.05);此外,必需氨基酸含量從5.98%提高到6.86%(P<0.05),提高了14.72%;總氨基酸含量從20.20%提高到21.66%(P<0.05),提高了7.23%。

表5 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽前后氨基酸含量對(duì)比(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2.3 發(fā)酵前后游離棉酚和霉菌毒素含量的變化

由表6可知,與發(fā)酵前相比,全棉籽發(fā)酵后游離棉酚含量從3 316.60 mg/kg降低到1 444.40 mg/kg(P<0.05),降低了56.45%;玉米赤霉烯酮含量沒(méi)有顯著變化(P>0.05),脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量從0.13 mg/kg降低到0.10 mg/kg(P<0.05)。全棉籽在發(fā)酵前和發(fā)酵后均未檢出黃曲霉毒素B1。

表6 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽前后游離棉酚和霉菌毒素含量對(duì)比(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2.4 發(fā)酵前后酶活性的變化

由表7可知,與發(fā)酵前相比,全棉籽發(fā)酵后淀粉酶活性由0.00 U/g達(dá)到34.67 U/g(P<0.05),纖維素酶活性由251.12 U/g提高到364.13 U/g(P<0.05),中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活性顯著提高(P<0.05),分別提高了171.66%、100.58%和129.11%。

表7 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽前后酶活性對(duì)比

2.2.5 發(fā)酵前后超微結(jié)構(gòu)的變化

由掃描電鏡圖(圖2)可知,發(fā)酵前的全棉籽的結(jié)構(gòu)較完整,表面光滑;發(fā)酵后的全棉籽表面不平整,有很多不規(guī)則孔洞,纖維結(jié)構(gòu)被破壞,結(jié)構(gòu)較松散。

2.3 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽對(duì)體外發(fā)酵特性的影響

2.3.1 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響

由圖3可知,隨體外發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組和發(fā)酵組的產(chǎn)氣量均呈增加趨勢(shì)。由表8可知,發(fā)酵不同時(shí)間(12、24和48 h)時(shí)對(duì)照組的產(chǎn)氣量均顯著高于發(fā)酵組(P<0.05);對(duì)照組的快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和潛在產(chǎn)氣量顯著高于發(fā)酵組(P<0.05),慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率顯著低于發(fā)酵組(P<0.05)。

2.3.2 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)的影響

由表9可知,對(duì)照組與發(fā)酵組的pH無(wú)顯著差異(P>0.05);發(fā)酵組體外發(fā)酵24和48 h時(shí)NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),體外發(fā)酵12 h時(shí)NH3-N濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05);發(fā)酵組體外發(fā)酵12 h時(shí)MCP濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),體外發(fā)酵24和48 h時(shí)MCP濃度與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05);發(fā)酵組體外發(fā)酵12、24和48 h時(shí)TVFA、乙酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05),體外發(fā)酵24和48 h時(shí)丁酸濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05);體外發(fā)酵12、24和48 h時(shí),發(fā)酵組與對(duì)照組的丙酸濃度和乙酸/丙酸的值沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

A、B為發(fā)酵前的全棉籽,C、D為發(fā)酵后的全棉籽。A和C的放大倍數(shù)為1 000倍,B和D的放大倍數(shù)為3 000倍。

圖3 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽體外發(fā)酵產(chǎn)氣量動(dòng)態(tài)變化

3 討 論

3.1 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽條件優(yōu)化

發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料水比和接種量是影響發(fā)酵效果的主要因素[13]。本試驗(yàn)中,發(fā)酵時(shí)間和料水比對(duì)發(fā)酵效果影響較大,其次是發(fā)酵溫度和接種量。發(fā)酵時(shí)間通過(guò)影響菌株的數(shù)量和產(chǎn)酶量間接影響發(fā)酵效果。料水比即含水量直接影響菌株的生存環(huán)境和活性,進(jìn)而影響產(chǎn)酶效果[14]。

表8 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽對(duì)體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響

劉倚帆等[15]在發(fā)酵全棉籽時(shí)將含水量控制在30%,與本試驗(yàn)中所得最適料水比相差不大。微生物的生長(zhǎng)會(huì)因?yàn)檫^(guò)高或過(guò)低的溫度受到限制,菌株生長(zhǎng)的適宜溫度決定了固態(tài)發(fā)酵工藝的溫度。Gao等[16]篩選的芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的最適溫度為40 ℃,與本研究的得出的最適發(fā)酵溫度相近。接種量的大小直接決定發(fā)酵質(zhì)量,過(guò)低導(dǎo)致產(chǎn)酶活力受限,易被雜菌污染;過(guò)高導(dǎo)致微生物過(guò)度繁殖使發(fā)酵效果不佳。韋濤等[17]利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵小米糠的研究結(jié)果表明,隨著接種量的增加,發(fā)酵效果先升高后降低,與本試驗(yàn)中接種量對(duì)全棉籽粗蛋白質(zhì)含量的影響結(jié)果一致。

表9 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽對(duì)體外發(fā)酵參數(shù)的影響

3.2 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽的效果

微生物固態(tài)發(fā)酵是改善飼料原料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有效途徑。夏新成等[18]利用酵母和霉菌復(fù)合發(fā)酵棉籽粕,使其粗蛋白質(zhì)含量提高了17.72%。本試驗(yàn)中,全棉籽經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量提高了20.52%,這可能是發(fā)酵過(guò)程中微生物合成MCP,同時(shí)消耗碳水化合物,造成部分干物質(zhì)損失,從而提高了粗蛋白質(zhì)含量。此外,微生物將非蛋白氮轉(zhuǎn)化為真蛋白氮,使全棉籽的真蛋白質(zhì)含量提高,與李英英等[19]的研究結(jié)果一致。發(fā)酵后全棉籽的纖維含量降低,這與Sun等[5]研究結(jié)果一致,可能是微生物產(chǎn)生纖維素酶,起到降解纖維作用。同時(shí),掃描電鏡結(jié)果表明發(fā)酵后全棉籽的結(jié)構(gòu)疏松多孔,更有利于動(dòng)物消化吸收。發(fā)酵后,全棉籽的粗灰分含量升高了31.42%,這是因?yàn)槲⑸锢昧说孜镏械挠袡C(jī)物,間接導(dǎo)致粗灰分含量上升,與Chi等[20]發(fā)酵豆粕所得結(jié)果一致。王曉玲等[21]利用混菌發(fā)酵棉籽粕,發(fā)酵后總氨基酸和必需氨基酸含量分別增加了22.20%和28.40%。本試驗(yàn)中,發(fā)酵后全棉籽的必需氨基酸和總氨基酸含量分別提高了14.72%和7.23%,但增幅與王曉玲等[21]的研究結(jié)果存在差距。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵底物不同,且單菌發(fā)酵效果不及混菌發(fā)酵;此外,微生物利用氨基酸存在偏好,直接影響發(fā)酵后的氨基酸含量變化[4]。

微生物發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生多種酶類,不同微生物的產(chǎn)酶特性不同。和小黑[22]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕產(chǎn)物中含有豐富的淀粉酶和蛋白酶。本試驗(yàn)中,發(fā)酵后全棉籽的淀粉酶活性達(dá)到34.67 U/g,發(fā)酵過(guò)程中可將淀粉降解為單糖等供微生物生長(zhǎng)繁殖,合成MCP;纖維素酶活性提高了45.00%,說(shuō)明發(fā)酵破壞底物纖維結(jié)構(gòu),使粗纖維含量顯著降低;中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶活性均顯著提高,使不易被消化吸收的大分子蛋白質(zhì)降解為易被利用的小分子多肽類物質(zhì),使植物蛋白轉(zhuǎn)化為更優(yōu)質(zhì)的MCP。

固態(tài)發(fā)酵能有效降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量。張文舉等[23]用熱帶假絲酵母、黑曲霉以及復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕,使得游離棉酚含量顯著下降,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Nagalakshmi等[24]認(rèn)為發(fā)酵過(guò)程中游離棉酚與微生物分泌的氨基酸或者活性蛋白質(zhì)中的游離氨基酸結(jié)合,形成結(jié)合棉酚;或者微生物能夠分泌可降解棉酚的酶類,從而達(dá)到脫毒效果。霉菌毒素是霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,通過(guò)影響動(dòng)物的各種生理特性發(fā)揮毒性,含量超標(biāo)會(huì)導(dǎo)致家畜的生產(chǎn)性能下降,甚至發(fā)生中毒。萬(wàn)里等[25]通過(guò)復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料,使得黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量顯著降低?！讹暳闲l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)對(duì)黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇給出的限量分別是30.00 μg/kg、1 000 μg/kg和5.00 mg/kg。本試驗(yàn)中,發(fā)酵后全棉籽中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量降低了23.08%,與前人研究一致,玉米赤霉烯酮含量雖沒(méi)有顯著變化,但遠(yuǎn)低于《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的限量。

3.3 體外產(chǎn)氣法評(píng)定發(fā)酵全棉籽的瘤胃發(fā)酵特性

產(chǎn)氣參數(shù)反映瘤胃微生物對(duì)飼料中不同成分的發(fā)酵效果[26]。本試驗(yàn)中,發(fā)酵組的慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率高于對(duì)照組,說(shuō)明發(fā)酵后的全棉籽可一定程度提高瘤胃微生物的發(fā)酵能力,增強(qiáng)對(duì)非可溶性成分的消化。NH3-N濃度可以用來(lái)評(píng)定瘤胃微生物降解蛋白質(zhì)與合成MCP的動(dòng)態(tài)平衡情況。瘤胃液NH3-N濃度與飼料粗蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系[27]。本試驗(yàn)中,發(fā)酵組的底物粗蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照組,所以發(fā)酵組的NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組。MCP作為反芻動(dòng)物最主要的氮源,能夠提供所需蛋白質(zhì)的40%～80%,其濃度高低與微生物對(duì)NH3-N的利用效率有關(guān)。本試驗(yàn)中,體外發(fā)酵12 h時(shí),發(fā)酵組MCP濃度顯著高于對(duì)照組,可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵前期,底物碳水化合物含量較高,發(fā)酵組粗蛋白質(zhì)含量更高,碳氮協(xié)同釋放,轉(zhuǎn)換效率更高,合成更多的MCP,這與Nocek等[28]的研究結(jié)果相同。揮發(fā)性脂肪酸是飼料中碳水化合物經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后的主要產(chǎn)物,是反芻動(dòng)物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的主要能量來(lái)源[29]。體外發(fā)酵24和48 h時(shí),發(fā)酵組的乙酸、丁酸和TVFA濃度均高于對(duì)照組,可能因?yàn)閷?duì)照組結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量高,纖維降解菌不能充分利用,而發(fā)酵全棉籽非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量較高,可消化養(yǎng)分增加,因此產(chǎn)生更多的揮發(fā)性脂肪酸[6]。

4 結(jié) 論

① 解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵全棉籽的適宜條件為:發(fā)酵溫度42 ℃,發(fā)酵時(shí)間6 d,接種量20%,料水比1∶0.6。

② 全棉籽經(jīng)解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)含量由21.35%提高到25.73%,粗纖維含量由24.96%降低到22.95%,必需氨基酸含量由5.98%提高到6.86%,游離棉酚含量由3 316.60 mg/kg降低到1 444.40 mg/kg,霉菌毒素含量降低,淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶活性增加,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到有效改善。

③ 發(fā)酵全棉籽可提高體外發(fā)酵乙酸、丁酸和TVFA濃度,促進(jìn)體外瘤胃發(fā)酵。