王如意, 劉 杰, 馮 琴, 張熠玚, 肖 寧, 吳 俊,鄭文靜, 李愛(ài)宏, 寧約瑟*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；2. 全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，北京 100125；3. 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，揚(yáng)州 225009；4. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；5. 遼寧省水稻研究所，沈陽(yáng) 110101)

1 近10年稻瘟病病害發(fā)生危害情況的統(tǒng)計(jì)

稻瘟病是由Pyriculariaoryzae侵染引起的對(duì)水稻安全生產(chǎn)影響最嚴(yán)重的世界性稻作病害,已經(jīng)在超過(guò)85個(gè)國(guó)家發(fā)生。全世界每年因稻瘟病造成的損失足以養(yǎng)活6 000萬(wàn)人口[1]。由于其在生產(chǎn)上的嚴(yán)重危害性和在科學(xué)研究上的重要性,2010年稻瘟病被Science雜志列為食品安全“最嚴(yán)重的生物威脅”之一[2]。2012年稻瘟病菌被國(guó)際分子植物病理學(xué)界列為“十大植物病原真菌之首”[3]。

稻瘟病在我國(guó)不同水稻種植區(qū)及水稻不同生育期的不同組織部位均有發(fā)生(圖1),嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。據(jù)全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心數(shù)據(jù)顯示,2012年-2021年我國(guó)稻瘟病年均發(fā)生面積381.5萬(wàn)hm2次(圖2a),年均實(shí)際損失36.8萬(wàn)t(圖2b),其中2014、2015年連續(xù)兩年發(fā)生面積超過(guò)500萬(wàn)hm2次,造成年實(shí)際稻谷損失超過(guò)50萬(wàn)t(圖2)。

圖1 稻瘟病發(fā)病情況Fig.1 Incidence of rice blast

圖2 2012年-2021年我國(guó)稻瘟病發(fā)生面積(a)及引起的實(shí)際損失(b)Fig.2 The occurrence area (a) of rice blast and caused actual losses (b) in China from 2012 to 2021

我國(guó)稻作區(qū)自然生態(tài)環(huán)境、水稻種植類型與栽培制度復(fù)雜多樣,稻瘟病的發(fā)生具有明顯的區(qū)域性差異。例如,隨著優(yōu)質(zhì)食味粳稻的推廣,江蘇省稻瘟病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也逐步加大,2014年稻瘟病在江蘇省偏重發(fā)生,發(fā)生面積達(dá)到100萬(wàn)hm2,占水稻播種面積的43%,嚴(yán)重影響了水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[4]。華南雙季稻稻作區(qū)以秈稻為主,該區(qū)稻瘟菌病原小種分化復(fù)雜,稻瘟病發(fā)生具有點(diǎn)多面廣、地域間發(fā)生分布不平衡等特點(diǎn)。據(jù)全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì),2015年-2021年,廣東省稻瘟病年發(fā)生面積約26.7萬(wàn)hm2,平均年損失稻谷約為2.5萬(wàn)t。

多年來(lái),“預(yù)防為主,綜合防治”的植物保護(hù)工作方針為我國(guó)病蟲(chóng)害的防控指明了方向,為糧食安全生產(chǎn)提供了重要保障[5]。在稻瘟病防治措施中,培育和推廣稻瘟病抗性品種被認(rèn)為是防控稻瘟病最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的策略[6]。因此,在國(guó)家和有關(guān)省農(nóng)作物新品種審定中,稻瘟病抗性一直被作為水稻新品種審定的重要指標(biāo),實(shí)行抗性不達(dá)標(biāo)一票否決制度[7]。為控制稻瘟病的發(fā)生,廣東省大力推廣以廣譜抗稻瘟病材料‘BL122’ (含稻瘟病抗病基因Pi1和Pi2)為父本的‘粵恢9802’等高抗稻瘟病雜交稻新品種。2013年-2021年,‘粵恢9802’在廣東稻瘟病發(fā)病區(qū)累計(jì)推廣33萬(wàn)hm2。東北早熟單季稻稻作區(qū)是我國(guó)粳稻的主產(chǎn)區(qū)之一,2018年以來(lái),黑龍江省每年對(duì)當(dāng)?shù)刂髟云贩N進(jìn)行接種測(cè)定,水稻品種整體抗病性有較大提升。全球氣候變化以及種植制度的變革加劇了稻瘟菌種群的變化,稻瘟病防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。2020年和2023年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后兩次將稻瘟病列入一類農(nóng)作物病蟲(chóng)害名錄。因此,一方面確定水稻品種抗瘟性及發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),結(jié)合田間生產(chǎn)實(shí)際,優(yōu)先種植在當(dāng)?shù)匕l(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低的水稻品種,降低稻瘟病大面積暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。另一方面,加強(qiáng)對(duì)稻瘟病常發(fā)區(qū)主栽品種的調(diào)整,避免單一抗病品種大面積種植,避免因抗病品種的垂直抗性喪失而造成巨大損失。為了應(yīng)對(duì)稻瘟菌種群變化對(duì)水稻生產(chǎn)帶來(lái)的危害,系統(tǒng)深入地研究稻瘟菌與水稻的相互作用,揭示水稻的抗病分子機(jī)制,改良水稻品種的稻瘟病抗性,加強(qiáng)對(duì)稻瘟病的綜合防控,對(duì)確保我國(guó)糧食安全具有舉足輕重的作用。

2 水稻稻瘟病抗病機(jī)制研究進(jìn)展

2.1 稻瘟病抗病基因匯總

截至目前,已經(jīng)有30多個(gè)稻瘟病抗病基因(resistance genes,R)被相繼鑒定和克隆。其中,大多數(shù)稻瘟病抗病基因,如Pi-ta、Pi2、Pi9、Piz-t、Pizh、Pi5、Pi50、Pik、Pi1、Pikm、Pi54(Pikh)、Pikp、Pid3、Pi25、Pid4、Pid3-A4、Pi36、Pi37、Pi56(t)、Pi63、Pia、Pib、Pi-CO39、Pish、Pi35、Pit、Pb1、Pi64和Pigm等編碼核苷酸結(jié)合和富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域受體(nucleotide-binding and leucine-rich repeat receptor,NLR)蛋白[8]。還有一些非NLR類抗病基因編碼蛋白激酶,如Pid2、Pi68(t)和Pi65分別編碼含有B-lectin 結(jié)構(gòu)域的類受體激酶、含有Malectin結(jié)構(gòu)域的類受體激酶和含有多個(gè)LRR (leucine-rich repeat)結(jié)構(gòu)域的類受體類激酶[9-11]。此外,Ptr編碼一個(gè)包含4個(gè)Armadillo重復(fù)的蛋白[12]。抗病基因的鑒定和克隆為抗病材料的創(chuàng)制和利用奠定了基礎(chǔ)。

2.2 稻瘟菌AVR蛋白與水稻NLR蛋白的識(shí)別

水稻R基因和稻瘟菌無(wú)毒基因(avirulence genes,AVR)的識(shí)別遵循“基因?qū)颉奔僬f(shuō)。水稻抗稻瘟病R基因與稻瘟菌中AVR基因相對(duì)應(yīng),目前已報(bào)道的AVR/R基因?qū)χ饕?Avr-Pita/Pi-ta、Avr-Pik/Pik、AvrPiz-t/Piz-t、Avr-Pia/Pia、Avr1-CO39/Pi-CO39、AvrPi54/Pi54、AvrPi9/Pi9[8]、AvrPib/Pib[13]和Avr-Pii/Pii[14]。研究發(fā)現(xiàn),水稻R蛋白Pi-ta 的 LRR 結(jié)構(gòu)域能夠直接和稻瘟菌的 AVR蛋白 Avr-Pita 相互作用,誘導(dǎo)植物的局部細(xì)胞死亡,阻止稻瘟菌進(jìn)一步擴(kuò)散[15], 這是水稻和稻瘟菌互作系統(tǒng)中首次證明R蛋白和相應(yīng)的AVR蛋白直接相互作用。隨后發(fā)現(xiàn)AVR蛋白AvrPi54與R蛋白Pi54能夠在水稻原生質(zhì)膜上直接互作激發(fā)特異性抗病反應(yīng)[16]。近來(lái)研究表明,植物中NLR蛋白也以成對(duì)的形式發(fā)揮作用,稱為 Senser NLR和Helper NLR。Senser NLR整合了特殊的結(jié)構(gòu)域來(lái)識(shí)別病原菌AVR蛋白,而Helper NLR負(fù)責(zé)起始下游免疫信號(hào)。如Pikp由Senser NLR 蛋白Pikp-1和 Helper NLR蛋白Pikp-2組成,Pikp-1含有 HMA 結(jié)構(gòu)域 (heavy-metal-associated domain),能夠與Avr-PikD直接相互作用;Pikp-1和Pikp-2 協(xié)同行使功能對(duì)含有Avr-PikD的稻瘟菌小種產(chǎn)生免疫反應(yīng)[17]。HMA 結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異決定了水稻對(duì)AVR蛋白的特異性抗性。因此,水稻R基因Pik的多個(gè)等位基因(Pikm、Piks、Pikp和Pikh)分別對(duì)含有相應(yīng)Avr-Pik的稻瘟菌小種表現(xiàn)特異抗性[18]。類似地,水稻抗病蛋白Pia由Senser NLR 蛋白R(shí)GA5和Helper NLR蛋白 RGA4組成,對(duì)攜帶Avr-Pia或Avr1-CO39的稻瘟菌表現(xiàn)特異的抗性[19]。RGA5能夠抑制RGA4的激活,Avr-Pia和 Avr1-CO39與RGA5的HMA結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合,解除 RGA5對(duì)RGA4 的抑制作用從而激發(fā)免疫反應(yīng)[20]。

大多數(shù)水稻R蛋白與對(duì)應(yīng)的稻瘟菌AVR蛋白不直接相互作用,這些R蛋白在水稻中的關(guān)鍵互作因子介導(dǎo)了R蛋白對(duì)AVR蛋白的識(shí)別。如NLR蛋白Pii和相對(duì)應(yīng)的Avr-Pii均與水稻胞吐作用相關(guān)蛋白OsExo70-F2和OsExo70-F3 相互作用,而OsExo70-F2和OsExo70-F3是R基因Pii介導(dǎo)抗性的必需因子[21]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)NLR蛋白Pib和相應(yīng)的AvrPib與水稻SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)SH3P2相互作用,在正常情況下SH3P2抑制Pib的激活,稻瘟菌侵染時(shí)AvrPib與SH3P2互作抑制SH3P2-Pib復(fù)合物的形成從而激活Pib[22]。此外,研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子WRKY45和RAI1分別特異地與NLR蛋白Pb1或PID3相互作用,是NLR蛋白抗病途徑中的必需因子[23-24]。稻瘟菌AVR基因與水稻R基因的互作機(jī)制研究為拓展R基因的抗譜提供了關(guān)鍵理論基礎(chǔ)。

2.3 廣譜NLR抗病蛋白信號(hào)通路

水稻NLR蛋白Piz-t、Pi9和Pigm等對(duì)多個(gè)稻瘟菌小種具有抗性,表現(xiàn)出廣譜抗性特征,受到廣泛關(guān)注和深入研究。Piz-t特異性識(shí)別稻瘟菌AvrPiz-t蛋白并通過(guò)多種信號(hào)通路激發(fā)水稻的免疫反應(yīng)。AvrPiz-t能夠抑制水稻bZIP 類型轉(zhuǎn)錄因子APIP5轉(zhuǎn)錄活性和蛋白積累,促進(jìn)效應(yīng)蛋白激發(fā)的細(xì)胞壞死,而Piz-t通過(guò)靶向APIP5,阻止APIP5介導(dǎo)的細(xì)胞壞死[25]。AvrPiz-t可以抑制E3泛素連接酶APIP10的體外泛素化活性抑制水稻的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng),APIP10與維管植物單鋅指轉(zhuǎn)錄因子OsVOZ1與OsVOZ2相互作用促進(jìn)其通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解,抑制OsVOZ1/OsVOZ2 的表達(dá)會(huì)削弱Piz-t蛋白積累和對(duì)非親和小種的抗病性[26],說(shuō)明APIP10通過(guò)OsVOZ1/OsVOZ2調(diào)控Piz-t介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外,抗病蛋白Piz-t促進(jìn)水稻胰蛋白酶抑制劑APIP4蛋白積累,增強(qiáng)其活性從而增強(qiáng)免疫[27],因此OsVOZ1/OsVOZ2作用于R蛋白Piz-t上游,正調(diào)控Piz-t蛋白積累,激活的Piz-t進(jìn)一步通過(guò)其下游蛋白APIP5和APIP4調(diào)控稻瘟病抗性。R蛋白Pi9能夠特異性識(shí)別稻瘟菌AvrPi9蛋白,近來(lái)發(fā)現(xiàn)AvrPi9與含有類泛素結(jié)構(gòu)域的蛋白ANIP1互作并維持其穩(wěn)定性,而ANIP1促進(jìn)稻瘟菌抗性正調(diào)控因子OsWRKY62的降解,減弱寄主免疫反應(yīng)。雖然Pi9也能夠穩(wěn)定ANIP1,但AvrPi9可以促進(jìn)ANIP1和Pi9的解離從而激活Pi9[28]。目前R基因Pigm相應(yīng)的稻瘟菌無(wú)毒基因還沒(méi)有報(bào)道,研究發(fā)現(xiàn)PigmR能夠促進(jìn)具有RRM結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子PIBP1在細(xì)胞核中積累,PIBP1與細(xì)胞壁相關(guān)激酶基因OsWAK14和苯丙氨酶基因OsPAL1的啟動(dòng)子直接結(jié)合并促進(jìn)它們的表達(dá),增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性[29]。此外,PigmR能夠穩(wěn)定去泛素化酶PICI1,PICI1使甲硫氨酸合成酶OsMETS1去泛素化并維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,促進(jìn)乙烯的生物合成從而激活免疫[30]。因此,廣譜NLR抗病蛋白一方面通過(guò)APIP5、OsVOZ1/OsVOZ2、OsWRKY62和PIBP1等轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)下游抗病相關(guān)基因的表達(dá);另一方面,泛素化/去泛素化修飾酶APIP10、ANIP1和PICI1參與了抗病信號(hào)的調(diào)控。下游抗病信號(hào)通過(guò)代謝防御途徑的關(guān)鍵酶,比如PAL參與的苯丙氨酸代謝和OsMETS1參與的乙烯代謝途徑參與了廣譜NLR抗病基因介導(dǎo)的抗病信號(hào)通路。

3 水稻感病基因/負(fù)調(diào)控因子研究進(jìn)展

感病基因(susceptibility gene,S)是指植物中有利于病原菌侵染的基因,是病原菌成功侵染寄主必需的關(guān)鍵因子[8]。在稻瘟病抗病性研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)一些感病基因/抗病負(fù)調(diào)控因子的功能缺失突變表現(xiàn)廣譜抗病性(圖3)。雖然這些S基因編碼的蛋白沒(méi)有保守性,但是一些感病基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在類似性。比如,Bsr-d1 編碼 C2H2類轉(zhuǎn)錄因子,Bsr-d1蛋白促進(jìn)下游過(guò)氧化物酶基因的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的消除,使水稻感病。而bsr-d1 突變體導(dǎo)致活性氧增加,表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病廣譜抗病性[31](圖3)。ROD1基因編碼包含C2結(jié)構(gòu)域的鈣感應(yīng)蛋白,能促進(jìn)CatB介導(dǎo)的過(guò)氧化氫酶活性,抑制活性氧的積累導(dǎo)致感病。而ROD1缺失突變體表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病的廣譜抗性[32](圖3)。說(shuō)明Bsr-d1和ROD1都通過(guò)調(diào)控ROS的產(chǎn)生介導(dǎo)抗病性。Bsr-k1編碼TPR(tetratricopeptide repeats)類型蛋白,能夠與苯丙氨酸代謝限速酶基因OsPAL(OsPAL1～OsPAL7)的mRNA結(jié)合促進(jìn)其降解,導(dǎo)致木質(zhì)素合成減少進(jìn)而削弱免疫反應(yīng)。而B(niǎo)sr-k1功能喪失突變體中木質(zhì)素合成增多,賦予水稻對(duì)稻瘟病菌的廣譜抗性[33](圖3)。RLK類型激酶(receptor-like kinases)BDR1能夠磷酸化MPK3,抑制稻瘟菌誘導(dǎo)的茉莉酸(jasmonic acid,JA)信號(hào)和萜類生物合成基因TPS3和TPS29的表達(dá),負(fù)調(diào)控稻瘟抗性。BDR1功能缺失突變體抑制JA信號(hào)和萜類代謝物途徑,增強(qiáng)稻瘟病抗性[34](圖3)。表明Bsr-k1和BDR1都通過(guò)參與抗病代謝物合成介導(dǎo)抗病性。近來(lái)發(fā)現(xiàn)稻瘟菌侵染水稻時(shí),水稻磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸被招募到侵染菌絲周圍促進(jìn)其侵染。水稻感病基因RBL1編碼胞嘧啶二脂酰甘油合成酶(CDP-DAG合成酶),參與磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的生物合成。rbl1突變體中細(xì)胞膜磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸含量顯著減少,抑制了稻瘟菌的侵染[35](圖3)。感病基因的鑒定及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的解析為水稻抗病育種提供了新的切入點(diǎn)。

4 其他抗病相關(guān)基因

4.1 其他稻瘟病正調(diào)控因子

除了稻瘟病抗病基因和感病基因,研究發(fā)現(xiàn)一些參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的調(diào)控因子兼具廣譜抗病性。IPA1是調(diào)控水稻理想株型的關(guān)鍵基因,近來(lái)發(fā)現(xiàn)稻瘟菌能夠誘導(dǎo)IPA1磷酸化,促進(jìn)IPA1與抗病正調(diào)控因子WRKY45 啟動(dòng)子的結(jié)合,促進(jìn)其表達(dá),增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟菌的廣譜抗病性[36]。水稻捕光復(fù)合體亞基LHCB5的高表達(dá)促進(jìn)LHCB5的磷酸化水平,磷酸化的LHCB5增加了葉綠體中ROS的累積和對(duì)稻瘟病菌多個(gè)小種的廣譜抗性[37]。水稻中蛋白酶體成熟因子UMP1編碼基因的一個(gè)天然等位基因UMP1R2115,增加了蛋白酶體的豐度和活性,促進(jìn)過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的降解,導(dǎo)致ROS積累,賦予水稻對(duì)稻瘟病菌等的廣譜抗性[38]。與抗病基因相比,盡管這些基因表現(xiàn)出不完全抗性,但這些基因介導(dǎo)的抗病性不依賴稻瘟菌AVR基因的限制具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

4.2 microRNA介導(dǎo)的稻瘟病抗性

microRNAs (miRNAs) 是一類調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平的非編碼RNA[39]。miRNAs與AGROUNATE (AGO)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體,該復(fù)合體的miRNA與靶基因序列堿基互補(bǔ)配對(duì),通過(guò)切割mRNA、促進(jìn)DNA甲基化或阻遏翻譯等方式來(lái)抑制下游基因表達(dá)[39-42],研究表明多個(gè)“miRNA-靶基因”參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等生物學(xué)過(guò)程[43]。其中miR398b 靶向4個(gè)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)基因OsCSD1、OsCSD2、OsCCSD和OsSODX。在水稻中過(guò)表達(dá)miR398b或敲除靶基因OsCSD1、OsCSD2和OsSODX能夠增強(qiáng)SOD活性,增加 H2O2的累積,提高水稻對(duì)稻瘟病的抗性[44]。miR160a靶向5個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(auxin response factor, ARF)編碼基因OsARF8、OsARF10、OsARF13、OsARF18和OsARF22。在水稻中超表達(dá)miR160a或敲除OsARF8、OsARF18或OsARF22增強(qiáng)對(duì)稻瘟病的抗性[45]。此外,研究發(fā)現(xiàn)miRNA及其靶基因也能夠負(fù)調(diào)節(jié)稻瘟病抗性。miR319b靶向JA信號(hào)通路關(guān)鍵基因OsTCP21。過(guò)表達(dá)miR319b抑制JA合成通路多個(gè)基因表達(dá),促進(jìn)稻瘟菌的侵染;而過(guò)表達(dá)OsTCP21增強(qiáng)了JA合成通路中這些基因的表達(dá),抑制了稻瘟菌的侵染[46]。miR1871靶向一個(gè)定位于細(xì)胞壁的基因OsMFAP1。過(guò)表達(dá)miR1871或敲除OsMFAP1削弱水稻的基礎(chǔ)免疫反應(yīng),而抑制miR1871的功能或過(guò)表達(dá)OsMFAP1不僅提高了水稻對(duì)稻瘟菌的抗性,還顯著提高了水稻的產(chǎn)量,暗示miR1871可能是一個(gè)具有抗病育種應(yīng)用價(jià)值的潛在感病基因[47]。此外,miR168能夠靶向并抑制OsAGO1的表達(dá),負(fù)調(diào)控多個(gè)miRNAs的積累。通過(guò)負(fù)調(diào)控miR1320的表達(dá)能增強(qiáng)稻瘟病抗性,通過(guò)負(fù)調(diào)控miR535和miR164的表達(dá)能增加水稻穗數(shù)并延長(zhǎng)抽穗時(shí)間,最終提高產(chǎn)量。抑制miR168的表達(dá)能同時(shí)提高稻瘟抗性和水稻產(chǎn)量[48]。這些研究表明,microRNA作為一種非蛋白的抗病相關(guān)基因廣泛參與水稻對(duì)稻瘟病抗性的調(diào)控,在水稻抗病育種中具有應(yīng)用潛力。

5 水稻稻瘟病抗病育種策略

稻瘟病抗病基因、感病基因以及其他抗病相關(guān)基因的挖掘、克隆與應(yīng)用,大幅提升了生產(chǎn)上水稻主推品種的稻瘟病抗性。然而,隨著全球氣候變化和水稻種植制度的變革,新品種需要進(jìn)一步拓展抗病譜和廣泛適應(yīng)性,以應(yīng)對(duì)變化的新環(huán)境。

5.1 抗病基因的聚合

雖然抗病基因具有垂直抗性,但是抗病蛋白僅能識(shí)別包含有相應(yīng)無(wú)毒效應(yīng)因子的病原小種,限制了單個(gè)抗病基因抗病品種的大面積推廣。采用多個(gè)抗病基因的聚合有助于培育廣譜稻瘟病抗性品種。例如:以‘07GY31’水稻材料為基礎(chǔ),將抗病基因Pi9和Piz-t分別與抗病基因Pi54進(jìn)行聚合,創(chuàng)制了葉瘟和穗瘟抗性均顯著提高的新材料[49];類似地,以‘YD6號(hào)’水稻材料為基礎(chǔ),將Piz不同等位基因(Pigm、Pi40、Pi9、Pi2和Piz)和Pi1、Pi33以及Pi54分別進(jìn)行聚合,發(fā)現(xiàn)Pigm/Pi1、Pigm/Pi54和Pigm/Pi33組合表現(xiàn)廣譜抗性,且對(duì)其他農(nóng)藝性狀沒(méi)有明顯影響[50]。另外,Pita和Pi3/Pi5/Pii聚合,以及Pita和Pia聚合也能產(chǎn)生較強(qiáng)的穗瘟抗性[51]。然而,雖然聚合Pib、Pi25和Pi54 能夠顯著提高稻瘟病抗性,但同時(shí)嚴(yán)重影響產(chǎn)量[52]。因此,抗病基因聚合的應(yīng)用價(jià)值還需評(píng)價(jià)其綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。通過(guò)選用優(yōu)良骨干親本作為共同遺傳背景,構(gòu)建不同單基因的精確滲入系,在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行聚合,是解決這一技術(shù)瓶頸的有效手段。

5.2 分子設(shè)計(jì)育種

隨著水稻全基因組測(cè)序的完成,功能基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的發(fā)展,分子設(shè)計(jì)育種成為引領(lǐng)水稻遺傳改良的關(guān)鍵技術(shù)。該技術(shù)在明確全基因組序列的基礎(chǔ)上,優(yōu)化選擇最佳親本基因組組合,通過(guò)雜交和分子標(biāo)記選擇等技術(shù),聚合大量?jī)?yōu)異基因,從而培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗和廣泛適用性的優(yōu)良新品種。分子設(shè)計(jì)育種能夠?qū)崿F(xiàn)從經(jīng)驗(yàn)育種到定向高效的精確育種轉(zhuǎn)變,大幅提高育種效率。Wei等根據(jù)報(bào)道的225個(gè)水稻QTL基因信息,結(jié)合等位變異的序列信息,將關(guān)鍵功能變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)到水稻基因組位置上,獲得包含348個(gè)變異位點(diǎn)和562個(gè)等位基因的圖譜,通過(guò)收集來(lái)自26個(gè)國(guó)家的404份種質(zhì)材料,獲得了覆蓋大部分等位基因(95.5%)的水稻材料[53],為水稻遺傳改良提供了豐富的供體資源。研究者從404份材料中發(fā)現(xiàn)7份材料中包含抗病基因Pi9,而Pi9位點(diǎn)的單堿基等位基因?qū)е聫?qiáng)的稻瘟病抗性,因此,含有這些等位基因的材料可作為育種應(yīng)用的重要供體[53]。另一方面,高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和抗病多性狀聚合是分子設(shè)計(jì)育種亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。通過(guò)對(duì)江蘇、浙江、山東等地大面積推廣應(yīng)用的200余份粳稻品種進(jìn)行重測(cè)序和全基因組分析,及關(guān)鍵性狀基因定位,發(fā)現(xiàn)控制千粒重和每穗粒數(shù)等關(guān)鍵性狀基因的強(qiáng)化選擇是促進(jìn)該區(qū)域粳稻品種產(chǎn)量提高的重要遺傳基礎(chǔ)。與此同時(shí),發(fā)現(xiàn)選育的高產(chǎn)水稻品種稻米的直鏈淀粉含量呈現(xiàn)顯著下降,稻瘟病抗性水平表現(xiàn)降低的趨勢(shì),表明稻米品質(zhì)和抗稻瘟病性狀存在顯著的負(fù)相關(guān)。通過(guò)全基因組連鎖圖譜的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)6號(hào)染色體Piz基因座感病等位基因連鎖是制約品種產(chǎn)量品質(zhì)抗病平衡的關(guān)鍵因素。以此為基礎(chǔ),利用基因組設(shè)計(jì)育種策略,通過(guò)選擇核心親本和打破關(guān)鍵基因累贅連鎖,利用抗病基因Piz-t和Pigm分別創(chuàng)制了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病新品系‘XY99’和‘JXY1’[54]。

5.3 感病基因編輯

水稻抗病基因賦予其對(duì)病原生理小種的垂直抗性,被育種家優(yōu)先應(yīng)用于水稻品種改良,但抗病基因的小種特異性使得其抗病譜較窄,限制了抗病品種的大面積推廣。感病基因是寄主植物中協(xié)助病原菌成功侵染的關(guān)鍵因子,隨著對(duì)稻瘟菌致病性的認(rèn)知和基因編輯技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)對(duì)感病基因的編輯可以阻止病原菌在寄主體內(nèi)完成侵染循環(huán),成為提高水稻抗病性的一種新策略。研究表明在‘日本晴’中敲除感病基因Pi21或Bsr-d1增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病的抗性,敲除感病基因Xa5增強(qiáng)了水稻對(duì)白葉枯病的抗性,同時(shí)敲除Pi21、Bsr-d1和Xa5 3個(gè)感病基因顯著提高了水稻對(duì)稻瘟病和白葉枯病的廣譜抗性,且敲除材料的株高和千粒重等農(nóng)藝性狀無(wú)明顯變化[55]。在雜交水稻骨干不育系‘隆科638S’中同時(shí)敲除感病基因Bsr-d1、Pi21和OsERF922顯著增強(qiáng)了對(duì)稻瘟病的抗性[56]。以上研究為稻瘟病育種提供了新的種質(zhì)資源。因此,通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)編輯水稻感病基因有望創(chuàng)制廣譜抗病新材料,對(duì)水稻抗病分子育種和其他作物抗病性改良具有重要指導(dǎo)意義。

5.4 抗病基因的病原誘導(dǎo)表達(dá)

病原菌侵染激活植株抗病基因及信號(hào)通路賦予植株抗病性,而抗病基因的組成型激活往往導(dǎo)致自我免疫,影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。例如,擬南芥的抗病關(guān)鍵調(diào)控因子NPR1通過(guò)調(diào)控水楊酸信號(hào)增強(qiáng)抗病性。在小麥和水稻中異源表達(dá)NPR1分別顯著提高對(duì)小麥紋枯病、水稻白葉枯病和稻瘟病的抗性。但NPR1的組成型激活影響農(nóng)作物的產(chǎn)量等性狀,限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。在水稻中,利用TBF1基因上游開(kāi)放閱讀框(uORF)在翻譯水平上精準(zhǔn)調(diào)控NPR1的表達(dá),使得在沒(méi)有病原菌侵染時(shí),NPR1蛋白處于低表達(dá)水平;而當(dāng)有病原菌侵染時(shí),NPR1蛋白快速高表達(dá),阻止病原菌的侵染。uORFTBF1-NPR1水稻材料對(duì)稻瘟病、白葉枯病和細(xì)菌性條斑病均有較好的抗性,并且不影響其他主要農(nóng)藝性狀[57]。類似地,病原菌誘導(dǎo)的PR1b啟動(dòng)子以及水稻乙醇脫氫酶5′-UTR的翻譯增強(qiáng)子共同驅(qū)動(dòng)WRKY45的表達(dá),顯著增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性[58]。因此,病原誘導(dǎo)以及在翻譯水平精準(zhǔn)調(diào)控抗病基因的表達(dá),能夠顯著提高作物對(duì)不同類型病原菌的廣譜抗性,同時(shí)不影響其他農(nóng)藝性狀。該技術(shù)在農(nóng)作物生產(chǎn)上具有潛在重要應(yīng)用價(jià)值。

5.5 基于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的抗病蛋白改造

NLR抗病蛋白的結(jié)構(gòu)解析使抗病機(jī)制研究有了突破性進(jìn)展,也為抗病蛋白的改造提供了重要參考。水稻中,稻瘟菌Avr1-CO39蛋白能與水稻R蛋白R(shí)GA5的HMA結(jié)構(gòu)域直接互作,參照Avr1-CO39與RGA5-HMA互作界面,基于Avr-Pib與Avr1-CO39結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),科研人員對(duì)RGA5的HMA結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造,設(shè)計(jì)出能識(shí)別非對(duì)應(yīng)無(wú)毒效應(yīng)蛋白Avr-Pib的新型抗病蛋白R(shí)GA5-HMA2,并證明含有RGA5-HMA2抗病蛋白的水稻對(duì)含有Avr-Pib的稻瘟菌具有抗性[59]。類似地,Pikm-1整合了HMA結(jié)構(gòu)域,研究發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)相鄰的氨基酸的突變拓展了對(duì)其他Avr-Pik效應(yīng)蛋白的識(shí)別[60]。近來(lái),研究者利用特異結(jié)合GFP的納米抗體序列替換Pikm-1的HMA結(jié)構(gòu)域獲得Pikm-1α-GFP,當(dāng)Pikm-1α-GFP和Pikm-2以及GFP共同在煙草中表達(dá)時(shí)能夠產(chǎn)生類似于Pikm-1,Pikm-2和AvrPiKD共表達(dá)產(chǎn)生的過(guò)敏反應(yīng)[61],該技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化完善有望在水稻中創(chuàng)制廣譜抗病新材料。通過(guò)改變抗病蛋白特定結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵氨基酸拓展抗病蛋白對(duì)效應(yīng)蛋白的識(shí)別,有望有效擴(kuò)展抗病基因的抗病譜。

6 挑戰(zhàn)和展望

6.1 種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及優(yōu)異等位基因發(fā)掘

從豐富的水稻種質(zhì)資源中挖掘抗稻瘟病基因是創(chuàng)新種質(zhì)的有效途徑?？茖W(xué)家從82個(gè)國(guó)家收集了413份不同水稻種質(zhì),利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)鑒定種質(zhì)資源庫(kù)中的核心抗稻瘟病基因[62]。用5個(gè)稻瘟菌小種對(duì)413份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行抗病鑒定,利用GWAS技術(shù)鑒定到具有稻瘟病抗性功能的新基因LABR_64[63]。我國(guó)科學(xué)家開(kāi)展了代表78萬(wàn)份水稻種質(zhì)資源95%遺傳多樣性的3 010份亞洲栽培稻基因組研究,建立了核心種質(zhì)的基因型和重要農(nóng)業(yè)性狀表型數(shù)據(jù)庫(kù),為開(kāi)展水稻全基因組分子設(shè)計(jì)育種提供基因來(lái)源和遺傳信息,為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗水稻新品種奠定基礎(chǔ)[64]。Shang等組裝了具有基因型和表型變異代表性的251份亞洲栽培稻核心種質(zhì)材料的基因組。利用泛基因組圖譜通過(guò)整合NLRs注釋信息,構(gòu)建了水稻泛NLRome,確定了泛NLRs家族基因的共線性,為抗病基因功能和進(jìn)化研究提供了重要基礎(chǔ)[65]。

6.2 利用抗性蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)通路挖掘新基因

水稻蛋白質(zhì)互作組能夠?yàn)榈鞍拙W(wǎng)絡(luò)和功能研究提供寶貴信息。Wierbowski等將帶條形碼接頭與核酸分子相連接,獲得了覆蓋2 300個(gè)基因的水稻ORFeome,構(gòu)建了由289個(gè)蛋白質(zhì)之間的322對(duì)相互作用組成的高質(zhì)量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作組圖譜[66]。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控水稻生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)鍵分子,科學(xué)家構(gòu)建了包括1 683個(gè)水稻轉(zhuǎn)錄因子的文庫(kù),覆蓋水稻轉(zhuǎn)錄因子總量的70%左右[67],為水稻轉(zhuǎn)錄因子互作組的研究奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)。水稻基因組包含1 515個(gè)E3泛素連接酶基因,近來(lái)研究者通過(guò)PCR擴(kuò)增和大規(guī)?；蚝铣色@得了1 499個(gè)E3泛素連接酶的全長(zhǎng)編碼序列(覆蓋E3泛素連接酶的98.94%),并以此創(chuàng)制了均一化的水稻E3泛素連接酶酵母文庫(kù)(UbE3文庫(kù))。利用水稻E3泛素連接酶文庫(kù)發(fā)現(xiàn) F-box類型E3泛素連接酶OsFBK16是OsPAL1～OsPAL7的核心E3泛素連接酶[68]。水稻ORFeome文庫(kù)、轉(zhuǎn)錄因子文庫(kù)和水稻E3泛素連接酶文庫(kù)的相繼建立為構(gòu)建水稻蛋白互作組調(diào)控稻瘟病抗性奠定了重要基礎(chǔ)。

遺傳篩選也是闡述抗性基因信號(hào)通路的重要方式。例如,水稻U-box類型E3泛素連接酶SPL11負(fù)調(diào)控稻瘟病和白葉枯病抗性。通過(guò)人工誘變得到了spl11突變體的一系列抑制子,其中抑制子SDS2編碼單子葉植物特異的SD-1類型的受體激酶。有趣的是,SPL11可以促進(jìn)SDS2的泛素化降解,負(fù)調(diào)控水稻免疫,而SDS2能夠磷酸化類受體胞質(zhì)激酶OsRLCK118,進(jìn)而磷酸化修飾NADPH氧化酶OsRbohB促進(jìn)ROS產(chǎn)生正調(diào)控水稻先天免疫[69]?？共∠嚓P(guān)基因抑制子的遺傳篩選是遺傳水平上解析抗病信號(hào)通路的重要途徑,遺傳篩選與蛋白質(zhì)互作鑒定有利于抗病相關(guān)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。

6.3 利用新技術(shù)創(chuàng)制抗病材料

以CRISPR-Cas9為主的基因編輯技術(shù)為水稻突變體材料的創(chuàng)制和功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。2013年該技術(shù)首次應(yīng)用到水稻中,能夠在水稻基因組特定位置使DNA雙鏈斷裂,利用細(xì)胞內(nèi)源修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生隨機(jī)的數(shù)個(gè)堿基插入或刪除,達(dá)到基因敲除的目的[70]。單堿基編輯技術(shù)的發(fā)展實(shí)現(xiàn)了特定堿基的高效精準(zhǔn)替換,而引導(dǎo)編輯在不引入雙鏈斷裂和供體DNA模板的前提下實(shí)現(xiàn)小片段DNA的精準(zhǔn)插入,缺失以及堿基的多種形式突變,提升了基因組編輯的精準(zhǔn)性[71]。此外,通過(guò)將供體片段進(jìn)行硫代修飾和磷酸化修飾后,實(shí)現(xiàn)了中等片段包括增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的靶向敲入[72]。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)重復(fù)片段介導(dǎo)的同源重組方法實(shí)現(xiàn)中等片段的替換和原位蛋白標(biāo)簽的精準(zhǔn)融合[72]。近年來(lái),科學(xué)家開(kāi)發(fā)了能夠?qū)崿F(xiàn)5 kb及以上大片段DNA精準(zhǔn)插入的PrimeRoot系統(tǒng),將稻瘟病抗病基因PigmR精準(zhǔn)插入到水稻基因組上實(shí)現(xiàn)快速抗病育種[73]。這些基因編輯系統(tǒng)的升級(jí)改造將為水稻分子抗病育種提供有力的技術(shù)支撐。

6.4 葉瘟和穗瘟抗病機(jī)制差異

稻瘟病可以在水稻整個(gè)生育期以及水稻不同組織發(fā)生,其中葉瘟影響水稻的生長(zhǎng)和發(fā)育,穗瘟直接影響水稻灌漿和產(chǎn)量。苗期的葉瘟接菌體系成熟,在溫室易于操作,而穗瘟的抗病分析需要在抽穗期進(jìn)行,接菌條件和表型調(diào)查易受環(huán)境的影響。因此稻瘟病抗性分析往往從葉瘟研究入手。然而,水稻對(duì)葉瘟和穗瘟的抗性往往不完全一致。比如含有廣譜抗稻瘟病基因Pi2、Pi9、Pi40、Piz-t和Piz的近等基因系材料的葉瘟與穗瘟抗性存在顯著差異[74]。在水稻中超量表達(dá)14-3-3蛋白編碼基因OsGF14b增強(qiáng)對(duì)穗瘟抗性,但對(duì)葉瘟更敏感[75]。因此,葉瘟抗性效應(yīng)好的抗病基因?qū)λ胛量剐孕?yīng)有待進(jìn)一步分析,葉瘟和穗瘟抗病分子機(jī)制的差異還需要進(jìn)一步研究。

6.5 稻瘟病抗性與水稻生長(zhǎng)發(fā)育等的平衡

植物抗病過(guò)程激發(fā)了免疫相關(guān)的激素信號(hào)和代謝防御信號(hào)通路,是消耗能量的過(guò)程。植物需要權(quán)衡抗病與生長(zhǎng)過(guò)程的能量分配,在病原菌侵染時(shí)減緩生長(zhǎng)發(fā)育增強(qiáng)抗病性。免疫反應(yīng)的激活往往影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,如何平衡植物抗病性與生長(zhǎng)發(fā)育是作物高產(chǎn)抗病育種的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。近來(lái)研究表明,作物能夠通過(guò)多種形式達(dá)到既高產(chǎn)又抗病的目的。比如,1)對(duì)生長(zhǎng)信號(hào)通路抑制的解除。水稻rbl功能缺失突變體具有稻瘟病廣譜抗病性但具有嚴(yán)重的類病斑,影響水稻產(chǎn)量。而RBL基因定點(diǎn)缺失12個(gè)核苷酸的植株表現(xiàn)抗病性但只在成株期呈現(xiàn)微弱的類病斑表型[35]。2)關(guān)鍵防御基因的特異性誘導(dǎo)表達(dá)。利用uORF1在翻譯水平上精準(zhǔn)調(diào)控NPR1的表達(dá),使得只有在病原菌侵染時(shí),NPR1蛋白才能快速高表達(dá),從而阻止病原菌的侵染,增強(qiáng)水稻的抗病性,但不影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量[57]。類似地,病原誘導(dǎo)表達(dá)導(dǎo)致IPA1的磷酸化增強(qiáng)免疫而不影響產(chǎn)量[36]。3)感病基因的敲除。同時(shí)敲除Pi21、Bsr-d1和Xa5 3個(gè)感病基因顯著提高了水稻對(duì)稻瘟病和白葉枯病的廣譜抗性而不影響其他農(nóng)藝性狀。4)優(yōu)化自然變異位點(diǎn)平衡植物的抗性和生長(zhǎng)。水稻Bsr-d1和ROD1的優(yōu)異自然變異位點(diǎn)能夠折中并平衡水稻的抗性和生長(zhǎng)使得增加抗性不影響產(chǎn)量[31-32]。這些材料的鑒定為實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)抗病材料的創(chuàng)制提供了很好的范例,有助于水稻抗病性改良,實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)抗病新材料的創(chuàng)制。