王蕾,李文菁,楊東林,陳勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

酶制劑在飼料、食品、造紙、醫(yī)藥及生物能源等多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,從環(huán)境中篩選酶的基因資源一直都是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。反芻動(dòng)物瘤胃是高效降解植物纖維的“發(fā)酵罐”,其中纖維降解菌及其產(chǎn)生的纖維素酶和半纖維素酶發(fā)揮著重要作用[1]。瘤胃中的纖維素降解菌包括瘤胃球菌(Ruminococcus)、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和梭菌(Clostridium)等[2]。其中黃色瘤胃球菌(R.flavefaciens)和白色瘤胃球菌(R.albus)是瘤胃中主要的纖維降解菌[3]。黃色瘤胃球菌可編碼糖苷水解酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶等多種酶,通過(guò)產(chǎn)生木聚糖酶復(fù)合體、多種內(nèi)切葡聚糖酶以及外切葡聚糖酶來(lái)降解纖維素。黃色瘤胃球菌甚至能降解那些通常難以降解的、堅(jiān)韌的棉花纖維[2],這說(shuō)明黃色瘤胃球菌纖維素及半纖維素基因資源的獨(dú)特性及其潛在的應(yīng)用價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn),黃色瘤胃球菌FD-1基因組共有101個(gè)糖苷水解酶基因,分布在25個(gè)糖苷水解酶家族中。黃色瘤胃球菌FD-1基因組中共有12個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8,簡(jiǎn)稱木聚糖酶),其中有2個(gè)ORF編碼雙功能木聚糖酶[4]。另一黃色瘤胃球菌17至少有 4個(gè)編碼木聚糖酶的基因,其中xynA和xynD編碼雙功能酶;xynA基因編碼的雙功能酶由2個(gè)不同的木聚糖酶結(jié)構(gòu)域組成,并由1個(gè)非常規(guī)連接區(qū)連接;xynD基因編碼的雙功能酶由1個(gè)木聚糖酶和1個(gè)β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73,簡(jiǎn)稱葡聚糖酶)結(jié)構(gòu)域組成[5]。由于植物性飼料中含豐富的葡聚糖和木聚糖,添加木聚糖酶與葡聚糖酶具有提高飼料的消化利用率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用。因此,通過(guò)基因工程技術(shù)異源表達(dá)xynD基因生產(chǎn)重組木聚糖酶和葡聚糖酶具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。在大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α中,xynD基因的表達(dá)產(chǎn)物可降解燕麥木聚糖和地衣多糖,不降解羧甲基纖維素,其木聚糖酶和葡聚糖酶比活性分別為95.5和83.2 IU·mg-1,如此低的酶活性限制了該木聚糖酶和葡聚糖酶的進(jìn)一步應(yīng)用。與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比,酵母表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)水平更高、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、可分泌表達(dá)等優(yōu)點(diǎn),還可以使重組蛋白適當(dāng)折疊并以Kex2作為信號(hào)肽酶分泌至細(xì)胞外[6]。因此,在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)xynD基因有望獲得更高的酶活性。

本研究在不改變氨基酸序列的情況下對(duì)來(lái)源于黃色瘤胃球菌的雙功能酶xynD基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,再在畢赤酵母中表達(dá)并對(duì)其酶學(xué)特征進(jìn)行研究,為重組工程菌應(yīng)用到飼料工業(yè)中提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPIC9K均為本課題組保存。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;地衣多糖、大麥β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖購(gòu)自Megazyme公司;4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖、燕麥木聚糖購(gòu)自Sigma公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。畢赤酵母GS115使用的培養(yǎng)基為酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BioFlo?115發(fā)酵罐和Centrifuge 5810R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf生命科學(xué)公司),Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士TECEN集團(tuán)公司),ECM399型電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)HAVARD公司的BTX子公司),My Cycler梯度PCR儀和Gel Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司),Frac-920半自動(dòng)部分收集器(美國(guó)Amersham公司),SHZ-88水浴恒溫振蕩器(上海金怡醫(yī)療科技有限公司),ZHWY200B氣浴搖床(上海智城分析儀器制造有限公司),Gene Quant型核酸蛋白儀(德國(guó)GE公司)等。

1.3 黃色瘤胃球菌雙功能酶xynD基因的優(yōu)化與合成

根據(jù)黃色瘤胃球菌xynD基因序列(GenBank ID:S61204.1),使用SignalP 4.1 Server在線分析基因的信號(hào)肽編碼序列。為提高重組蛋白的表達(dá)水平,去除xynD的信號(hào)肽編碼區(qū)(93 bp)以及催化模塊間的連接序列(393 bp)。根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性消除稀有密碼子,降低mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能和調(diào)整GC含量,消除限制酶切位點(diǎn),在不改變氨基酸序列的情況下利用Optimum GeneTM對(duì)xynD基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,優(yōu)化后的基因命名為xynDm,以進(jìn)一步提高重組蛋白表達(dá)水平。將xynDm序列送至GenScript?公司合成。合成的xynDm和表達(dá)載體pPIC9K經(jīng)SnaB Ⅰ/AvrⅡ雙酶切,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-xynDm并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α,經(jīng)培養(yǎng)后采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切初步鑒定后分別由GenScript公司和Sangon Biotech公司重復(fù)測(cè)序。

1.4 重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及篩選鑒定

用限制性內(nèi)切酶SalⅠ將pPIC9K-xynDm線性化,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化并回收,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。將電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞涂布于最小葡萄糖培養(yǎng)基(minimal dextrose medium,MD)平板上,29 ℃培養(yǎng)48 h。挑選生長(zhǎng)良好的菌落在MD平板和最小甲醇培養(yǎng)基(minimal methanol medium,MM)平板上進(jìn)行甲醇利用慢型(Muts)和甲醇利用正常型(Mut+)表型的篩選,再分別經(jīng)0、1、2和4 mg·mL-1遺傳霉素(geneticin)G418的抗性篩選得到高拷貝陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行YPD平板培養(yǎng),挑取單菌落液體培養(yǎng)12 h,提取重組酵母基因組DNA,以序列(5′-GCGACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′)和(5′-GGCAAATGGCATTCTGACATCCT-3′)為引物(由GenScript公司合成),采用PCR驗(yàn)證xynDm基因是否插入。

1.5 XynDm的逐級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)及活性測(cè)定

1.5.1 XynDm的試管、搖瓶表達(dá)及酶活性的定性和定量測(cè)定根據(jù)Invitrogen的畢赤酵母GS115表達(dá)手冊(cè),將抗4 mg·mL-1G418的21個(gè)轉(zhuǎn)化子從緩沖復(fù)合甘油培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium,BMGY)轉(zhuǎn)接至5 mL緩沖復(fù)合甲醇培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium,BMMY),使菌懸液的A600值為0.9～1.1,進(jìn)行試管甲醇誘導(dǎo)表達(dá),于29 ℃、220 r·min-1水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng),每24 h添加甲醇至終含量為0.5%,誘導(dǎo)表達(dá)48 h結(jié)束,采集樣品,經(jīng)低溫高速離心機(jī)以4 000 r·min-1離心30 min后取上清液用于測(cè)定葡聚糖酶和木聚糖酶活性。從上述轉(zhuǎn)化子中挑取酶活性最高的轉(zhuǎn)化子,在250 mL搖瓶中擴(kuò)大培養(yǎng),甲醇誘導(dǎo)144 h。搖瓶表達(dá)為每瓶100 mL BMMY培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件及樣品的處理和測(cè)定與試管培養(yǎng)一致。

分別取搖瓶中誘導(dǎo)培養(yǎng)36和72 h的GS115-pPIC9K和GS115以及分別誘導(dǎo)表達(dá)0、36和72 h的GS115-pPIC9K-xynDm的培養(yǎng)上清液,以高黏度阿拉伯木聚糖或大麥β-葡聚糖為底物,采用剛果紅平板染色法定性檢測(cè)XynDm的酶活性[7]。分別以高黏度阿拉伯木聚糖或大麥β-葡聚糖為底物,采用DNS法定量測(cè)定XynDm的木聚糖酶和葡聚糖酶活性[8-9],酶活性均測(cè)定3次。1個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)是以 8 mg·mL-1高黏度阿拉伯木聚糖為底物,在pH6.0、37 ℃條件下每分鐘分解木聚糖生成1 μmol還原糖所需的酶量。1個(gè)葡聚糖酶活性單位(IU)是以8 mg·mL-1大麥葡聚糖為底物,在pH6.0、55 ℃條件下每分鐘分解葡聚糖生成1 μmol還原糖所需的酶量。

1.5.2 XynDm在發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵表達(dá)及純化鑒定將工程菌劃線培養(yǎng)后挑取單克隆進(jìn)行液體培養(yǎng),當(dāng)菌液中菌濃度為108CFU時(shí),取3 mL菌液加入300 mL BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,得到的菌液為種子液(A600>2)。在裝有3 L FM22培養(yǎng)基[(KH2PO4、(NH4)2SO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O]的發(fā)酵罐中接種300 mL種子液,分別以甲醇或山梨醇/甲醇(體積比為1∶6)為碳源(單碳源和雙碳源的添加量均為60 μL·min-1,持續(xù)添加),誘導(dǎo)表達(dá)144 h。每12 h收集樣品10 mL,離心后取上清液用于酶活性的測(cè)定和SDS-PAGE及酶譜分析[10]。

活性酶譜的凝膠配制與SDS-PAGE(120 g·L-1分離膠及濃縮膠:雙蒸水,30 g·L-1丙烯酰胺,1.5 mol·L-1Tris-HCl、pH8.0,1 mol·L-1Tris-HCl、pH6.8,100 g·L-1SDS,100 g·L-1過(guò)硫酸銨,5 μL四甲基乙二胺)相同,酶譜凝膠中分別加入8 g·L-1阿拉伯高黏度木聚糖和大麥低黏度葡聚糖,酶液與未加二硫蘇糖醇的2×SDS-PAGE上樣緩沖液(1 mol·L-1Tris-HCl、pH8.0,20 g·L-1SDS,1 g·L-1%溴酚藍(lán),100 g·L-1甘油)1∶1(體積比)混勻上樣電泳。取下凝膠置于洗滌液(10 mmol·L-1CaCl2、10 mmol·L-1NaCl、2.5% Triton X-100、Tris,pH7.5)中洗滌2次,每次15 min,以去除凝膠中的SDS,再置于孵育液(10 mmol·L-1CaCl2、10 mmol·L-1NaCl、Tris,pH7.5)中清洗3次,每次10 min,更換新的孵育液并將凝膠放入37和55 ℃中孵育1 h。將凝膠使用10 g·L-1的剛果紅染色30 min,用1 mol·L-1NaCl溶液脫色至出現(xiàn)清晰條帶。

取發(fā)酵上清液經(jīng)超濾濃縮后用葡聚糖凝膠G-100層析,選用長(zhǎng)為50 cm、直徑為1 cm的層析柱,使用0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液為洗脫液,以部分收集器每1 min收集1管,根據(jù)A280值繪制吸收曲線。合并同一吸收峰的組分,采用DNS法測(cè)定XynDm各吸收峰的木聚糖酶和葡聚糖酶活性并進(jìn)行SDS-PAGE。

1.6 XynDm酶學(xué)特性測(cè)定

1.6.1 XynDm的最適pH值及不同pH值下的穩(wěn)定性取純化后的XynDm與不同pH值的緩沖液(pH2.2、0.2 mol·L-1甘氨酸-鹽酸緩沖液,pH值2.5～8.0、0.2 mol·L-1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,pH值 8.5～10.5、0.2 mol·L-1甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)適當(dāng)稀釋,在pH 值2～11條件下,分別于37和55 ℃反應(yīng) 5 min 測(cè)定木聚糖酶和葡聚糖酶活性。每0.5個(gè)pH值為1個(gè)間隔,以酶活性最高為100%,以相對(duì)酶活性判斷XynDm的最適pH值。在pH值2～11條件下,將XynDm于37和55 ℃保持60 min后分別測(cè)定剩余的木聚糖酶和葡聚糖酶活性,以酶活性最高為100%,以相對(duì)酶活性判斷XynDm在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.6.2 XynDm的最適溫度及不同溫度下的穩(wěn)定性取純化后的XynDm,分別在10～90 ℃條件下于pH6.0反應(yīng)5 min,測(cè)定其酶活性,溫度間隔為10 ℃,以酶活性最高為100%,以相對(duì)酶活性判斷XynDm的最適溫度。取XynDm在上述溫度條件下放置60 min后于pH6.0條件下測(cè)定剩余酶活性,以酶活性最高為100%,以相對(duì)酶活性判斷XynDm在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.6.3 XynDm的底物特異性取純化后的XynDm,以濃度為8 mg·mL-1(終濃度為0.027 mmol·mL-1)的樺木木聚糖(BX)、燕麥木聚糖(OSX)、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖(MGX)、高黏度阿拉伯木聚糖(AXH)和對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)為底物,參考上述方法在最適條件下測(cè)定木聚糖酶的最適底物;以8 mg·mL-1的地衣多糖(Li)、低黏度大麥β-葡聚糖(BGL)、高黏度大麥β-葡聚糖(BGH)和羧甲基纖維素(CMC)為底物,在最適條件下測(cè)定葡聚糖酶的最適底物,以酶活性最高為100%。

1.6.4 金屬離子、螯合劑和表面活性劑對(duì)XynDm活性的影響測(cè)定取10 μL 10 mmol·L-1的雙蒸水配制的含金屬離子溶液(CaCl2、MgSO4、AlCl3、MnCl2、FeSO4、FeCl3、CuSO4、ZnSO4、AgNO3、BaCl2、CoCl2、LiCl、(NH4)2SO4、KCl、NaCl)和乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇(β-ME)、二硫蘇糖醇(DTT)(參與作用的金屬離子及試劑的濃度均為1 mmol·L-1)與90 μL酶液混勻后在室溫下保持 60 min,在pH6.0、溫度分別為37和55 ℃條件下測(cè)定木聚糖酶和葡聚糖酶活性,以加入10 μL雙蒸水的酶活性(對(duì)照)為100%計(jì)算各底物的相對(duì)酶活性。

1.6.5 XynDm酶解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定將酶液與不同質(zhì)量濃度(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mg·mL-1)和不同底物的溶液在最適條件下反應(yīng)并測(cè)定酶活性,使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算XynDm酶解反應(yīng)的米氏方程并計(jì)算米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃色瘤胃球菌xynD基因的密碼子優(yōu)化

優(yōu)化后的xynDm基因經(jīng)DNA測(cè)序,基因全長(zhǎng)1 863 bp,編碼621個(gè)氨基酸殘基,理論相對(duì)分子質(zhì)量為69.0×103,優(yōu)化前后DNA序列的一致性為78.37%,提交至GenBank后獲得的登錄號(hào)為MW290983。

2.2 XynDm重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

從圖1可以看出:重組質(zhì)粒pPIC9K-xynDm經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切,電泳顯示有2條DNA條帶,相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期相符,初步說(shuō)明xynDm基因已插入到pPIC9K。從圖2可以看出:提取GS115-pPIC9K-xynDm、GS115和GS115-pPIC9K基因組DNA,經(jīng)PCR和電泳后GS115在2 200 bp左右出現(xiàn)1條帶,此條帶為野生型乙醇氧化酶(AOX1)基因擴(kuò)增產(chǎn)物;GS115-pPIC9K有2條帶分別在2 200和500 bp左右,分別為野生型AOX1基因和α-因子編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物;GS115-pPIC9K-xynDm的PCR產(chǎn)物在2 200和 2 400 bp 左右分別有2條帶,分別為野生型AOX1基因和α-因子及目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物,表明目的基因xynDm成功導(dǎo)入P.pastorisGS115基因組DNA。

圖1 雙酶切重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 Identification of expression plasmids bydouble enzyme digestionM. DL10000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品 DNA marker DL10000;1. 重組質(zhì)粒Recombinant plasmid;2. 經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切的重組質(zhì)粒Recombinant plasmid digested with BamHⅠand SalⅠ.

圖2 重組酵母鑒定Fig.2 Identification of recombinant Pichia pastorisM. DL2000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品DNA marker DL2000;1. GS115-pPIC9K基因組DNA GS115-pPIC9K genomic DNA;2. GS115基因組DNA GS115 genomic DNA;3. 重組畢赤酵母Recombinant P.pastoris.

圖3 XynDm在試管表達(dá)下的酶活性Fig.3 Enzyme activty of XynDm expressed in test tube

2.3 XynDm的逐級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)及酶活性

2.3.1 XynDm轉(zhuǎn)化子的初篩經(jīng)篩選共得到抗4 mg·mL-1G418的Mut+轉(zhuǎn)化子21個(gè)。在試管中,XynDm的木聚糖酶平均酶活性為21.14 IU·mL-1,XynDm的葡聚糖酶平均酶活性為9.05 IU·mL-1,其中338號(hào)轉(zhuǎn)化子的木聚糖酶活性為26.41 IU·mL-1,葡聚糖酶活性為24.93 IU·mL-1,木聚糖酶活性是平均活性的1.25倍,葡聚糖酶活性是平均活性的2.75倍。后續(xù)試驗(yàn)均選取338號(hào)轉(zhuǎn)化子。

2.3.2 XynDm在搖瓶中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)酶活性的定性測(cè)定338號(hào)轉(zhuǎn)化子的XynDm木聚糖酶經(jīng)誘導(dǎo) 0～36 h,隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),酶活性逐漸增加,在36 h的酶活性達(dá)到最大(36.20 IU·mL-1);之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)酶活性快速下降(圖4-A)。XynDm葡聚糖酶經(jīng)誘導(dǎo)0～72 h,隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng),酶活性升高,在誘導(dǎo)72 h時(shí),酶活性達(dá)到最大值(106.24 IU·mL-1);之后隨著時(shí)間延長(zhǎng)酶活性趨于穩(wěn)定(圖4-B)。

圖4 XynDm在搖瓶培養(yǎng)條件下的酶活性Fig.4 Enzyme activity of XynDm expressed in flask level

2.3.3 剛果紅平板染色法定性檢測(cè)XynDm活性從圖5-A可知,分別誘導(dǎo)12和36 h的酶液在含阿拉伯木聚糖的平板中產(chǎn)生直徑分別為18和20 mm的透明圈(a1、b1)。如圖5-B可知,分別誘導(dǎo)36和72 h的酶液在含大麥β-葡聚糖的平板中產(chǎn)生直徑分別為21和25 mm的透明圈(a2、b2),這表明XynDm在P.pastorisGS115中得到表達(dá),產(chǎn)生了木聚糖酶和葡聚糖酶。分別誘導(dǎo)36 h、72 h的P.pastorisGS115、轉(zhuǎn)化空表達(dá)載體pPIC9K的P.pastorisGS115以及338號(hào)未誘導(dǎo)時(shí)的發(fā)酵液均未產(chǎn)生透明水解圈,說(shuō)明它們沒(méi)有酶分泌。

圖5 阿拉伯木聚糖(高黏度,A)和大麥葡聚糖(低黏度,B)剛果紅瓊脂平板染色法測(cè)定XynDm酶活性Fig.5 Identification of bifunctional enzyme activity by Congo red staining on arabinoxylan(high viscosity,A)and barley β-glucan(low viscosity,B)agar platesa1、a2. 誘導(dǎo)12和36 h的GS115-pPIC9K-xynDm GS115-pPIC9K-xynDm induced for 12 and 36 h;b1、b2. 誘導(dǎo)36和72 h的GS115-pPIC9K-xynDm GS115-pPIC9K-xynDm induced for 36 and 72 h;c. 誘導(dǎo)前的GS115-pPIC9K-xynDm GS115-pPIC9K-xynDm before induced;d1、d2. 誘導(dǎo)36和72 h的畢赤酵母GS115 The host P.pastoris GS115 induced for 36 and 72 h);e1、e2. 誘導(dǎo)36和72 h的GS115-pPIC9K GS115-pPIC9K induced for 36 and 72 h.

2.3.4 XynDm在發(fā)酵罐中表達(dá)的酶活性如圖6-A所示:以甲醇為碳源時(shí),XynDm木聚糖酶活性在誘導(dǎo)36 h時(shí)達(dá)到最大值,為265.32 IU·mL-1,比活性最高為468.36 IU·mg-1,之后隨著時(shí)間增加而平穩(wěn)下降;而以甲醇/山梨醇為碳源表達(dá)時(shí)木聚糖酶活性隨著時(shí)間的增加而上升,在144 h達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定,酶活性為267.27 IU·mL-1,比活性僅為154.65 IU·mg-1。如圖6-B所示:XynDm葡聚糖酶活性在以甲醇以及以甲醇/山梨醇為碳源時(shí)變化曲線基本一致,酶活性隨著時(shí)間的增加而上升并在72 h達(dá)到最大,分別為 2 260.87 和3 547.39 IU·mL-1,且比活性也達(dá)到最大,分別為3 208.31和2 563.51 IU·mg-1;單碳源時(shí)的酶活性隨著時(shí)間增加趨于平穩(wěn),雙碳源時(shí)的酶活性有較明顯的波動(dòng)。

圖6 在發(fā)酵罐中XynDm木聚糖酶(A)和葡聚糖酶(B)的酶活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的變化Fig.6 Changes of xylanase(A)and glucanase(B)enzyme activity of XynDm with induction time in fermentor

2.4 XynDm的SDS-PAGE分析及酶譜分析

如圖7所示:發(fā)酵上清經(jīng)SDS-PAGE,在66.2×103～97.4×103與31.0×103～42.7×103出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶。由于0 h時(shí)在66.2×103左右有1條條帶,而0 h幾乎沒(méi)有酶活性,因此該條帶應(yīng)當(dāng)為非目的條帶。

圖7 不同時(shí)間發(fā)酵上清液的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of fermentation supernatantsharvested at different timeM. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Protein marker;1～8. 誘導(dǎo)0、12、24、36、48、60、72和84 hInduced 0,12,24,36,48,60,72 and 84 h.

如圖8-A所示:對(duì)36和72 h的搖瓶酶液和發(fā)酵罐酶液進(jìn)行酶譜分析,泳道1和2為搖瓶表達(dá)72和36 h的葡聚糖酶活性,在85.0×103左右出現(xiàn)條帶;泳道3和4為發(fā)酵罐表達(dá)葡聚糖酶活性,在35.0×103左右出現(xiàn)條帶;泳道5由于搖瓶中的木聚糖酶活性在72 h很低,因此未出現(xiàn)條帶,可能由于發(fā)酵罐高密度表達(dá)后的酶活性較高,也有可能是在35.0×103左右時(shí)具有2種酶活性。

圖8 XynDm的酶譜(A)及不同酶譜組分的SDS-PAGE(B)Fig.8 Zymogram(A)and SDS-PAGE(B)of different chromatographed fractionsA. 1～2. 在搖瓶中72和36 h的葡聚糖酶譜72 and 36 h glucanase zymogram in flask;3～4. 在發(fā)酵罐中72和36 h的葡聚糖酶譜72 and 36 h glucanase zymogram in fermentor;5～6. 在搖瓶中72和36 h的木聚糖酶譜72 and 36 h xylanase zymogram in flask;7～8. 在發(fā)酵罐中72和36 h的木聚糖酶譜72 and 36 h xylanase zymogram in fermentor.B. M. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品Protein marker;1、2. 36和72 h的濃縮上清液36 and 72 h concentrated supernatants;3、6. 72和36 h的組分1 72 h and 36 h fractions 1;4、7. 72和36 h的組分272 h and 36 h fractions 2;5、8. 72和36 h其他酶譜組分 72 h and 36 h other chromatographed fractions.

如圖8-B所示:對(duì)72和36 h的酶液進(jìn)行層析純化,得到3個(gè)組分,其中組分1和組分2均含有蛋白質(zhì)且具有酶活性。經(jīng)測(cè)定,組分1具有葡聚糖酶活性,組分2具有木聚糖酶活性及葡聚糖酶活性,組分3無(wú)蛋白質(zhì)且不具有酶活性,有可能是培養(yǎng)基的成分。對(duì)比圖8-A與圖8-B,可以推斷具有酶活性的條帶如同圖7所指位置,分別為具有葡聚糖酶活性的條帶出現(xiàn)在85.0×103左右和35.0×103左右,均具有木聚糖酶活性的條帶出現(xiàn)在35.0×103左右。

2.5 XynDm酶學(xué)性質(zhì)研究

2.5.1 XynDm的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性從圖9可知:在10～37 ℃,隨著溫度的升高,木聚糖酶活性迅速升高,在37 ℃時(shí)酶活性到達(dá)最高,之后隨著溫度升高酶活快速下降;木聚糖酶在37～40 ℃保持 60 min,相對(duì)酶活性均>80%;隨后酶活性迅速降低。因此,木聚糖酶最適溫度為37 ℃,并在37～40 ℃較穩(wěn)定。在10～50 ℃,隨著溫度的升高,葡聚糖酶活性逐漸提高,并在55 ℃時(shí)酶活性達(dá)到最高,之后隨著溫度升高酶活性逐漸下降;葡聚糖酶在各溫度下保持60 min,40～55 ℃相對(duì)酶活性均>80%,之后酶活性迅速下降。因此,葡聚糖酶最適溫度為55 ℃,并在40～55 ℃熱穩(wěn)定較好。

圖9 XynDm的最適溫度及溫度穩(wěn)定性Fig.9 Optimum temperature and temperature stability of XynDm

2.5.2 XynDm的最適反應(yīng)pH值及pH穩(wěn)定性由圖10可知:木聚糖酶在pH3.5時(shí)相對(duì)酶活性為23.88%;在pH值4.5～6.5時(shí),相對(duì)酶活性均在80%以上;在pH10時(shí),相對(duì)酶活性僅為11.32%。將其在各pH值下保持60 min,在pH3.5時(shí)剩余酶活性為35.67%;在pH值4.5～6.5時(shí)酶活性均大于80%;當(dāng)pH值升高至10.0時(shí),木聚糖酶的剩余酶活性僅為18.49%。因此,木聚糖酶最適反應(yīng)pH值為6.0,在pH值4.5～6.5的條件下較穩(wěn)定。葡聚糖酶在pH4.0的相對(duì)酶活性為15.66%;在pH值5.5～9.0時(shí),相對(duì)酶活性均在80%以上;在pH11.0時(shí)相對(duì)酶活性僅為11.20%。將其在各pH值下保持60 min,在pH4.0時(shí)剩余酶活性為 7.97%;在pH值5.5～9.0時(shí)酶活性均大于80%;當(dāng)pH值升高至11.0時(shí)剩余酶活性僅為7.14%。因此,葡聚糖酶最適反應(yīng)pH值為6.0,在pH值5.5～9.0的條件下較穩(wěn)定。

圖10 XynDm酶活性的最適pH值及pH值穩(wěn)定性Fig.10 Optimum pH value and pH value stability of XynDm enzyme activity

2.5.3 XynDm的底物特異性從圖11可知:XynDm木聚糖酶對(duì)4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖(MGX)的水解作用最好,并以此為100%,對(duì)高黏度阿拉伯木聚糖(AXH)和樺木木聚糖(BX)的水解作用也較好,分別為94.67%和90.88%,對(duì)燕麥木聚糖(OSX)的水解作用為56.89%,對(duì)對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷(pNPX)的水解作用較弱,為3.36%。XynDm葡聚糖酶對(duì)大麥低黏度葡聚糖(BGL)水解作用最好,以此為100%,對(duì)大麥高黏度葡聚糖酶(BGH)具有較好的水解作用,為76.44%,對(duì)地衣多糖(Li)的水解作用較弱,為19.45%,幾乎不降解羧甲基纖維素(CMC)。

圖11 XynDm的底物特異性Fig.11 Substrate specificity of XynDmOSX:燕麥木聚糖Oat splet xylan;AXH:阿拉伯木聚糖(高黏度)Arabinoxylan(high viscosity);BX:樺木木聚糖birchwood xylan;MGX:4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸-D-木聚糖4-O-methyl-D-glucurono-D-xylan;pNPX:對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷p-nitrophenyl-β-D-xyloside;Li:地衣多糖 Lichenan;BGH:大麥葡聚糖(高黏度)Barley β-glucan(high viscosity);BGL:大麥葡聚糖(低黏度)Barley β-glucan(low viscosity);CMC:羧甲基纖維素Carboxymethyl cellulose.

圖12 金屬離子、螯合劑及表面活性劑對(duì)XynDm的影響Fig.12 The influence of metal ions,chelating agent and surfactant chemical reagent on XynDm*、**分別表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)*,**mean significant difference(P<0.05)and extremely significant differences(P<0.01)compared with black control。CK為空白對(duì)照CK means blank control;EDTA、DTT和 β-ME為螯合劑EDTA、DTT and β-ME are chelating agent;SDS為表面活性劑SDS is surfactant.

2.5.5 XynDm的動(dòng)力學(xué)參數(shù)如圖13-A所示,XynDm以高黏度阿拉伯木聚糖為底物時(shí),酶促反應(yīng)的米氏方程:1/V=0.0285(l/[S])+2.0×10-4,米氏常數(shù)Km為142.5 mg·mL-1,最大反應(yīng)速度Vmax為5×103mg·mL-1·min-1。如圖13-B所示,以大麥β-葡聚糖為底物時(shí),米氏方程:1/V=0.0019(l/[S])+1.0×10-5,米氏常數(shù)Km為190.0 mg·mL-1,最大反應(yīng)速度Vmax為1.0×105mg·mL-1·min-1。

圖13 XynDm以木聚糖(A)和β-葡聚糖(B)為底物時(shí)酶解反應(yīng)的1/V與1/[S]關(guān)系圖Fig.13 The relationship between 1/V and 1/[S] of XynDm with xylan(A)and β-glucan(B)as substrate

3 討論

對(duì)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化是提高異源蛋白表達(dá)水平的主要途徑之一。Lu等[11]基于P.pastoris密碼子使用偏愛(ài)性對(duì)芽胞桿菌木聚糖酶基因XynHBN188A進(jìn)行優(yōu)化,G-C含量從39.60%提高至42.41%,酶活力提高39.5%?；騼?yōu)化主要針對(duì)密碼子的特性、G-C含量及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行。楊玉霞等[12]將產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的β-聚糖酶基因FsGLU進(jìn)行密碼子優(yōu)化后在畢赤酵母中表達(dá),表達(dá)的重組酶活性達(dá)到 6 424 U·mg-1;而經(jīng)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的酶活性僅為3.3 IU·mg-1[13]。本試驗(yàn)為提高黃色瘤胃球菌xynD基因在畢赤酵母中的表達(dá)水平(由于目前對(duì)催化模塊間的連接區(qū)域功能尚不知曉,因此將催化模塊間的連接區(qū)域去除),經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后,xynD的G-C含量從47.19%降低至41.96%,密碼子適應(yīng)指數(shù)(codon adaptation index,CAI)從0.70升高到0.86,使mRNA結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定,更有利于XynDm基因的表達(dá)。

在本試驗(yàn)中,XynDm由621個(gè)氨基酸殘基組成,理論分子質(zhì)量69.0×103,圖5中所示有1條略高于理論分子質(zhì)量的條帶,可能是由于XynDm表達(dá)后發(fā)生了磷酸化、糖基化等翻譯后修飾,導(dǎo)致條帶遷移率下降;還有1條低于理論分子質(zhì)量的條帶,可能是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),畢赤酵母本身產(chǎn)生的蛋白酶降解XynDm所致;也可能由于蛋白前體在進(jìn)行加工時(shí),Kex2蛋白酶將蛋白前體剪切,導(dǎo)致酶蛋白分子質(zhì)量降低。

本試驗(yàn)中的雙功能酶由于其對(duì)木聚糖和葡聚糖均具有較高的催化效率而受到關(guān)注。李曉麗等[14]從嗜熱子囊菌(ThermoascuscrustaceusJCM12803)中表達(dá)了木聚糖酶和纖維素酶TcXyn10A雙功能酶基因,其中木聚糖酶和纖維素酶比活性分別為1 480.0和7.4 U·mg-1。Qiao等[15]研究的2個(gè)嵌合基因表達(dá)產(chǎn)物XynA-Bs-Glu-1和XynA-Bs-Glu-2,具有木聚糖酶和葡聚糖酶的活性,XynA-Bs-Glu-1的比活性分別為303.5和377.1 IU·mg-1,XynA-Bs-Glu-2的比活性分別為102.0和303.5 IU·mg-1。謝晨等[16]從黑酵母(Hortaeawerneckii)中得到的糖苷水解酶HwXYL10A基因在畢赤酵母中表達(dá),以櫸木木聚糖、甘蔗木聚糖和玉米芯木聚糖為底物測(cè)得比活性分別是3 260、3 160和3 870 U·mg-1,10 mmol·L-1Mn2+對(duì)Hortaeawerneckii的HwXYL10A木聚糖酶活性有一定的抑制作用,而Ca2+和K+的促進(jìn)效果更明顯。Kiribayeva等[17]從BacillussonorensisT6菌株中表達(dá)木聚糖酶基因rXynT6,并在大腸桿菌(rXynT6-E)和畢赤酵母(rXynT6-P)中表達(dá)。rXynT6-E和rXynT6-P表達(dá)的木聚糖酶的比活性分別為1 030.2和873.8 U·mg-1。Liu等[18]從氧化節(jié)桿菌G6-4B中純化葡聚糖酶,經(jīng)過(guò)陰離子交換層析,葡聚糖酶成功純化了32.25倍,比活性為288.62 U·mg-1,葡聚糖酶活性被Ni+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Co2+等金屬離子顯著抑制。本試驗(yàn)中xynD基因在畢赤酵母中表達(dá)后,表現(xiàn)出木聚糖酶和葡聚糖酶的雙酶活性,且比活性分別達(dá)到468.36和3 208.31 IU·mg-1,比已報(bào)道的雙功能酶的活性高,相較于單功能酶,其能達(dá)到2種酶的效果,且酶活性也相對(duì)較高。

酶分子中的活性中心是由必需基團(tuán)所組成的特定空間結(jié)構(gòu),酶蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)隨著環(huán)境(如pH值、溫度和化學(xué)試劑等)改變導(dǎo)致雙功能酶蛋白結(jié)構(gòu)變化,會(huì)使其生物活性顯著變化甚至完全被抑制。StreptomycesthermocerradoensisI3固態(tài)發(fā)酵時(shí)分泌的雙功能木聚糖酶/內(nèi)切葡聚糖酶活性在70 ℃、pH6.0和55 ℃、pH6.0條件下,均表現(xiàn)出2種酶最佳活性,且均在pH值4.0～9.0時(shí)具有60%酶活性;木聚糖酶活性在60～80 ℃保持穩(wěn)定,葡聚糖酶在50～70 ℃下保持60%酶活性[19]。Mondal等[20]從黃色瘤胃球菌中得到的纖維素酶RfGH16基因,經(jīng)大腸桿菌BL21表達(dá)的RfGH16_21在pH值5.0～8.0和溫度50～70 ℃下均表現(xiàn)出穩(wěn)定的酶活性,在pH7.0和55 ℃達(dá)到最適和最大酶活性,RfGH16_21對(duì)大麥β-D-葡聚糖顯示最大酶活性(257 U·mg-1),其次是地衣多糖(247 U·mg-1),但對(duì)其他供試多糖均未表現(xiàn)出明顯活性,表明其具有特異性β-1,3-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶活性。Goyal等[21]從黃色瘤胃球菌得到的纖維素酶RfGH5,其N端結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)切葡聚糖酶活性的糖苷水解酶5家族基因GH5_4,C端結(jié)構(gòu)域是內(nèi)切甘露聚糖酶基因(GH5_7)。將GH5_7(RfGH5_7)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)并純化,表達(dá)產(chǎn)物RfGH5_7對(duì)刺槐豆半乳甘露聚糖酶的活性最高(298.5 U·mg-1),其次是對(duì)魔芋葡甘露聚糖酶(256.2 U·mg-1)和胡蘿卜半乳甘露聚糖酶(177.2 U·mg-1)。RfGH5_7的最適pH值為6.0,最適溫度為60 ℃。RfGH5_7在pH值6.0～9.0具有較好的穩(wěn)定性,在50 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好;10 mmol·L Ca2+使其酶活提高了33%。王小松等[22]將貴州木霉NJAU4742幾丁質(zhì)酶基因chi8表達(dá)至大腸桿菌,表達(dá)產(chǎn)物Chi8在30～40 ℃具有較好的熱穩(wěn)定性,但高于50 ℃時(shí)基本失去活性。本研究分別以高黏度阿拉伯木聚糖和大麥葡聚糖為底物,得到雙功能酶的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度37 ℃、最適pH值為6.0,在溫度37～40 ℃、pH值4.5～6.5下具有較好的穩(wěn)定性;葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度 55 ℃、最適pH值為6.0,在溫度40～55 ℃、pH值5.5～9.0下保持良好的穩(wěn)定性:證明XynDm的適宜活性pH值呈弱酸性至中性。不同菌種產(chǎn)生的雙功能酶不同,每種酶的結(jié)構(gòu)存在差異,因此最適條件和穩(wěn)定性不同,與黃色瘤胃球菌中的其他酶相比,pH值和溫度穩(wěn)定性具有一定的相似性,由于基因所在位置、催化結(jié)構(gòu)域以及不同的酶類型,最適條件和穩(wěn)定性也會(huì)存在差異。該試驗(yàn)中的XynDm雙功能酶在最適條件下,對(duì)高黏度阿拉伯木聚糖和大麥葡聚糖的降解作用均最強(qiáng),其次是低黏度阿拉伯木聚糖,對(duì)對(duì)硝基苯酚底物的降解活性較弱;另外葡聚糖酶對(duì)羧甲基纖維素和地衣多糖無(wú)降解作用或較弱。

金屬離子導(dǎo)致雙功能酶活性有不同的變化。Co2+、Mn2+和Zn2+對(duì)Bacillussp.CSB55的葡聚糖酶活性有激活作用,EDTA和Ca2+對(duì)其有抑制作用[23]。李凌波等[24]篩選表達(dá)了纖維素酶cell基因,Co2+、Mn2+、Ca2+對(duì)內(nèi)切纖維素酶活性有激活作用,Mn2+對(duì)外切纖維素酶活性有顯著激活作用,Zn2+、Fe3+具有抑制作用。PenicilliumchrysogenumP33的xyl1、xyl2、xyl3三種木聚糖酶活性被Na+和K+激活,而被Cu2+、Ag+和Fe3+抑制[25]。本試驗(yàn)中XynDm雙功能酶活性可被Cu2+、Zn2+和Co2+激活,可能是離子促進(jìn)了酶蛋白與底物的結(jié)合;Fe2+、Ag+、SDS和β-ME抑制雙功能酶活性,有可能是金屬離子、SDS和β-ME破壞了酶的空間結(jié)構(gòu),使酶活性下降或者失去。

綜上,優(yōu)化后的黃色瘤胃球菌雙功能酶基因xynD在畢赤酵母中得到表達(dá),在發(fā)酵罐中表達(dá)的XynDm的木聚糖酶與葡聚糖酶在36和72 h時(shí)酶活性和比活性均達(dá)到最大值,分別為265.32、468.36 IU·mL-1和2 260.87、3 208.31 IU·mg-1。XynDm的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為37 ℃和6.0,其葡聚糖酶最適反應(yīng)溫度和pH值分別為55 ℃和6.0。Cu2+、Zn2+和Co2+對(duì)雙功能酶有激活作用,Ag+和SDS使其活性明顯被抑制。