關(guān)天越， 任怡琳，2， 管祺杰， 史勁松， 許正宏， 耿 燕*

(1. 江南大學(xué)生命科學(xué)與健康工程學(xué)院 江蘇 無錫 214122; 2. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 江蘇 無錫 214122;3. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 )

枸杞是茄科、枸杞屬植物，是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其中栽培范圍最廣的寧夏枸杞，主要分布在我國西北地區(qū)[1]。 枸杞果實(shí)是人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹饕糠諿2-3]。 枸杞多糖（LBP）是從果實(shí)中提取的枸杞最主要活性成分，具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、降血脂等功能[4-6]。 多糖作為一種大分子活性物質(zhì)往往不能在胃與小腸處分解，需經(jīng)腸道菌群的分解才能被人體利用[7]。 人體內(nèi)腸道微生物能夠協(xié)助宿主完成大量的生理生化功能，被稱為人體的另一大器官[8]，其數(shù)量約為人體細(xì)胞數(shù)量的10 倍。 因此，研究枸杞多糖對(duì)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響對(duì)探究枸杞多糖的藥理活性具有重要的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器

枸杞粗多糖：百瑞源公司產(chǎn)品；AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、DEAE -Sepharose Fast Flow 10/16 柱、Sephadex G-75 葡聚糖凝膠柱： 美國GE 公司產(chǎn)品；UPLC 系統(tǒng)（LC-30A）：日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 枸杞多糖的制備

將購置的枸杞粗多糖溶于蒸餾水中，并不斷攪拌使多糖充分溶解， 使最終料液質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL，設(shè)置提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為120 min，過濾濃縮后加入乙醇，多糖溶液與乙醇溶液體積比為1∶4，并在4 ℃的條件下靜置過夜，溶液離心取沉淀干燥后得實(shí)驗(yàn)用枸杞粗多糖[9-10]，再應(yīng)用Sevage法除蛋白質(zhì)。使用氯仿、正丁醇試劑以4∶1 的體積比配制Sevage 溶液，Sevage 溶液與糖溶液以1∶1 的體積比混合，攪拌4 h 后，上層溶液為多糖溶液，中間層為蛋白質(zhì)層，下層溶液為有機(jī)試劑，重復(fù)此操作3次至中間層無蛋白質(zhì)析出[11]。 再對(duì)上層多糖溶液進(jìn)行脫色處理，將大孔樹脂置于大燒杯中，使乙醇完全浸沒樹脂，并不斷攪拌，以除去氣泡，使之充分混合，靜置24 h；之后對(duì)樹脂進(jìn)行水洗、酸洗、堿洗；大孔樹脂洗凈后，以大孔樹脂和多糖溶液1∶20 的體積比加入多糖溶液，攪拌1 h，抽濾回收濾液，濾液冷凍干燥后，進(jìn)行下一步純化。

1.3 枸杞多糖的純化

使用AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)對(duì)多糖進(jìn)行純化處理[12-13]。 首先使用離子交換柱進(jìn)行分離，分離柱選擇DEAE-Sepharose Fast Flow 10/16 柱， 超純水（A洗脫液）和1 mol/L NaCl 溶液（B 洗脫液）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)收集器進(jìn)行收集。 用苯酚-硫酸法測定溶液中多糖的質(zhì)量濃度，繪制對(duì)應(yīng)的洗脫曲線，并合并同一洗脫峰下的各管洗脫液，旋蒸濃縮并冷凍干燥，得到不同組分的洗脫樣品[14]。之后利用相對(duì)分子質(zhì)量差異對(duì)已分離出的各組分再次進(jìn)行分離純化， 純化柱選擇Sephadex G-75 葡聚糖凝膠柱， 使用0.1 mol/L NaCl 溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，使用自動(dòng)收集器收集流出液。 用苯酚-硫酸法測定多糖的質(zhì)量濃度，并繪制對(duì)應(yīng)的洗脫曲線，合并同一洗脫峰下的各管洗脫液，旋蒸濃縮，透析48 h，每12 h 更換超純水，之后冷凍干燥得到純化后的枸杞多糖樣品。

1.4 體外模擬厭氧發(fā)酵

取6 名在3 個(gè)月內(nèi)未接受抗生素治療的健康人（男女志愿者各3 人）糞便樣本，在PBS 溶液中離心重懸，制備成腸道菌群種子進(jìn)行體外模擬厭氧發(fā)酵。 本實(shí)驗(yàn)已通過江南大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理審核（JNU20210618IRB19）。 厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基為8.0 g/L可溶性淀粉、4.5 g/L 酵母抽提物、3.0 g/L 胰蛋白胨、3.0 g/L 蛋白胨、0.4 g/L 膽鹽3 號(hào)、0.8 g/L L-半胱氨酸鹽、0.5 g/L 三氯化鐵紅霉素、4.5 g/L 氯化鈉、2.5 g/L 氯化鉀、0.45 g/L 六水合氯化鎂、0.2 g/L 六水合氯化鈣、0.4 g/L 磷酸二氫鉀、1.0 mL/L 吐溫80 和2.0 mL/L 微量元素溶液，調(diào)節(jié)pH 至6.5，121 ℃滅菌20 min。 在厭氧發(fā)酵瓶中靜置48 h 后進(jìn)行接種，其中，多糖組枸杞多糖加入量為2 g/L。 空白對(duì)照的厭氧發(fā)酵瓶與加入枸杞多糖的厭氧發(fā)酵瓶分別為9個(gè)，接種的菌種種子分別為6 名志愿者提供的單獨(dú)樣本與6 名志愿者樣本經(jīng)混合后的等微生物量的3個(gè)混合樣本。 其中，空白對(duì)照組為CTRL 組、混合種子空白對(duì)照組為CTRLMIX 組、 枸杞多糖組為LBP組、混合種子枸杞多糖組為LBPMIX 組。 CTRL 空白對(duì)照組與LBP 枸杞多糖組皆為6 名志愿者的樣本單獨(dú)放入?yún)捬醢l(fā)酵瓶進(jìn)行發(fā)酵（n=6）。 CTRLMIX 混合種子空白對(duì)照組與LBPMIX 混合種子枸杞多糖組，皆為6 名志愿者的樣本經(jīng)混合后等微生物量加入?yún)捬醢l(fā)酵瓶中發(fā)酵 （n=3）。 總空白對(duì)照組為TCTRL 組，總枸杞多糖組為TLBP 組（n=9）。

1.5 發(fā)酵液短鏈脂肪酸的測定

取接種后的腸道微生物體外模擬厭氧發(fā)酵液，于1 000 r/min 離心5 min， 吸取上清液并經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后4 ℃保存。 參照文獻(xiàn)[15]通過UPLC系統(tǒng)測定發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸濃度， 色譜柱為InertSustain AQ-C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm），流量0.5 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。 洗脫液A 液為20 mmol/L 的NaH2PO4溶液，B 液為乙腈。 UPLC 的洗脫程序?yàn)? min 時(shí)A 液體積分?jǐn)?shù)為95%， 在10 min 時(shí)A 液體積分?jǐn)?shù)線性下降至60%，之后不變至12 min，分析程序結(jié)束。

1.6 16S rRNA 基因高通量測序與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇菌群16S rRNA 基因的測序區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)。 取微生物基因組DNA 樣品與對(duì)應(yīng)的融合引物配制PCR 反應(yīng)體系，設(shè)置PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，之后使用Agencourt AMPure XP 磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化， 純化后完成cDNA 文庫的建立。 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對(duì)文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，使用HiSeq平臺(tái)測序。 應(yīng)用DADA2 聚類方法， 通過去噪的序列，并以100%的相似度聚類生成ASV 序列。

兩組之間顯著性差異比較應(yīng)用Wilcox Test 方法，3 組及以上比較用Kruskal Test 方法，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示實(shí)驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 通過華大基因公司的微生物擴(kuò)增子系統(tǒng)（http：//meta.bgi.com） 分析處理16S rRNA 基因測序數(shù)據(jù)。 并應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行繪圖與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 16S rRNA 基因測序數(shù)據(jù)匯交至國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫（https：//nmdc.cn/）。 生物項(xiàng)目正式編號(hào)為NMDC10017931，生物樣本正式編號(hào)為NMDC20029604。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖對(duì)腸道微生物群落多樣性的影響

經(jīng)AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)純化得到了LBP（見圖1 和圖2）。 利用人體腸道菌群體外發(fā)酵體系及16S rRNA 基因擴(kuò)增子測序， 研究LBP 對(duì)腸道微生物群落多樣性的影響。 首先利用Chao1 指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)來判斷LBP 對(duì)腸道微生物的α-多樣性的影響。 如圖3 所示，LBP組和LBPMIX 組的Chao1 指數(shù)與ACE 指數(shù)均顯著上升（P＜0.05），Shannon 指數(shù)也呈上升趨勢，Simpson指數(shù)則呈下降趨勢。以上結(jié)果表明LBP 能夠明顯提高腸道菌群的多樣性。

圖1 DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換柱色譜分離Fig. 1 Chromatographic separation of DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange column

圖2 Sephadex G-75 葡聚糖凝膠柱色譜分離Fig. 2 Chromatographic separation of Sephadex G-75 sephadex column

圖3 體外發(fā)酵的人體腸道微生物菌群的α-多樣性Fig. 3 α-Diversity of human gut microbiota produced by in vitro fermentation

為了研究腸道微生物的β-多樣性的差異，基于ASV 進(jìn)行主成分分析（PCA），結(jié)果如圖4 所示。枸杞多糖組與空白對(duì)照組分別位于PC1 的兩側(cè)，兩組的混合種子發(fā)酵樣本同樣在圖上分離明顯，并分別呈現(xiàn)聚集狀態(tài)。 其中CTRLMIX 組和LBPMIX 組組的樣本分別顯示了很好的聚集， 但未與CTRL 組和LBP 組明顯分開，說明將志愿者樣本的混合處理雖提高了菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性但并沒有與單獨(dú)發(fā)酵的樣本有顯著差異，但是含LBP 的體外發(fā)酵顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

2.2 枸杞多糖對(duì)腸道微生物物種差異的影響

利用線性判別分析 （linear discriminant analysis effect size，LEfSe 分析），研究添加LBP 后與空白對(duì)照組相比具有差異性的腸道微生物。 如圖5所示，TLBP 組在屬水平上具有顯著性差異（LDA＞2，P＜0.05）的有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、布勞特氏菌屬（Blautia）、多爾氏菌屬（Dorea）、毛螺菌屬 （Lachnospiracea_incertae_sedis）、 腸單胞菌屬（Intestinimonas）、羅氏菌屬（Roseburia）等。而豐度降低的有小桿菌屬 （Dialister） 、 氨基酸球菌屬（Acidaminococcus）與有害的腸道致病菌屬克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等[16]。

2.3 枸杞多糖對(duì)腸道菌群功能差異的預(yù)測分析

通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路功能預(yù)測含LBP 的體外發(fā)酵對(duì)腸道菌群功能差異的影響。 如圖6 所示，LBP 添加到腸道菌群體外發(fā)酵體系后，顯著影響了菌群與初級(jí)和次級(jí)膽汁酸代謝（primary and secondary bile acid biosynthesis）、蛋白質(zhì)的消化吸收（protein digestion and absorption）、亞油酸代謝（linoleic acid metabolism） 和多糖代謝（other glycan degradation）等方面的功能（P＜0.05）。

圖6 腸道菌群的功能差異分析Fig. 6 Functional difference analysis of gut microbiota

2.4 枸杞多糖對(duì)腸道微生物代謝物短鏈脂肪酸（SCFAs）生成的影響

SCFAs 對(duì)于腸道健康有著重要的作用[17]，也是多糖在腸道內(nèi)發(fā)酵的產(chǎn)物[18]。 通過超高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸進(jìn)行檢測，并將腸道內(nèi)含量最豐富的SCFAs（如乙酸、丙酸與丁酸）的濃度進(jìn)行比較。 TLBP 組的乙酸、丙酸與丁酸單獨(dú)組分濃度和總短鏈脂肪酸濃度與TCTRL 組相比都具有顯著性差別，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸（SCFAs）濃度Fig. 7 Concertation of short-chain fatty acids (SCFAs) in the fermentation broth

2.5 討論

腸道微生物是位于腸道內(nèi)部的龐大微生物群，腸道菌群的細(xì)胞數(shù)達(dá)100 萬億以上，種群至少存在1 000 種以上， 是人體擁有的最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[19]。而且它是一個(gè)對(duì)宿主健康至關(guān)重要生物反應(yīng)器。 這些微生物在體內(nèi)參與了宿主的營養(yǎng)代謝活動(dòng)，并作為宿主代謝的重要參與者提供許多宿主所不能合成的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)機(jī)體的生化生理狀態(tài)[20]。腸道菌群的相對(duì)豐度與菌株豐富度與人的健康息息相關(guān)，膳食調(diào)節(jié)被認(rèn)為是改變微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要方式[21]。許多中草藥對(duì)腸道菌群有顯著促進(jìn)作用，其對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)能力可能是其藥理作用的來源[22]。多糖作為一種活性物質(zhì)具有改善腸道功能，枸杞多糖有可能以改變腸道微生物結(jié)構(gòu)的方式發(fā)揮其藥理功能[23]。

通過對(duì)模擬人類腸道微生物體外厭氧發(fā)酵體系進(jìn)行測序分析來研究枸杞多糖對(duì)腸道微生物的作用。 菌群多樣性數(shù)據(jù)顯示了在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入枸杞多糖后，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，枸杞多糖提高了腸道菌群的豐度與多樣性，并且混合種子樣本的菌群豐度高于單一樣本的菌群豐度。 從主成分分析可知，對(duì)菌群種子樣本的混合可以提高發(fā)酵后腸道微生物的豐度與促進(jìn)菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。 并且枸杞多糖作為一種大分子活性物質(zhì)可以有效影響人類的腸道微生物結(jié)構(gòu)。 從兩組的功能差異可以看出，腸道微生物的改變使一系列代謝相關(guān)的功能上調(diào)，改善了腸道的消化能力。

多糖代謝往往由多種微生物共同作用[24]。 根據(jù)LDA 值，在具有顯著性的差異物種中，總枸杞多糖組的乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是著名的益生菌菌屬，還有瘤胃球菌屬、布勞特氏菌屬、多爾氏菌屬、毛螺菌屬和羅氏菌屬與多糖代謝、SCFAs 生成有關(guān)，這些菌在屬水平上豐度的升高對(duì)腸道起到了調(diào)節(jié)作用。 乳酸桿菌是一種能夠發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的益生菌， 通過拮抗有害微生物來維持腸道菌群平衡，并且是一種能夠產(chǎn)生SCFAs 的益生菌[25-26]。雙歧桿菌同樣是能夠產(chǎn)生有機(jī)酸的益生菌，促進(jìn)人體對(duì)一系列營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并具有抗菌、抗癌、抗衰老、保護(hù)肝臟等功能[27]。這些益生菌影響人體的消化與健康[28-29]。 多糖在腸道代謝的終產(chǎn)物為SCFAs，其可以調(diào)節(jié)腸道生理功能，如維持腸道系統(tǒng)的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能、發(fā)揮抗炎作用并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、作為能量來源并改變菌群組成[30-31]。TLBP 組的SCFAs 顯著性增加， 表明LBP 可能通過提高腸道SCFAs 的濃度發(fā)揮其藥理作用[18，32]。 除產(chǎn)生SCFAs 外，枸杞多糖對(duì)腸道微生物結(jié)構(gòu)及其功能的影響仍有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語

綜上所述，枸杞多糖能夠提高人類腸道微生物的多樣性，提高益生菌的豐度，降低腸道內(nèi)致病菌的豐度， 并促進(jìn)碳水化合物代謝菌產(chǎn)生短鏈脂肪酸，最終調(diào)節(jié)機(jī)體的健康。