液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)老酸奶和牛軋?zhí)侵腥矍璋返难芯?/h1>
2023-10-19 02:49劉超呂雪梅景贊
食品工業(yè) 2023年9期
劉超，呂雪梅，景贊
樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）
三聚氰胺，簡(jiǎn)稱三胺，俗稱蜜胺、蛋白精。三聚氰胺是一種白色的單斜晶體，幾乎無(wú)味，微溶于水，可溶于甲醇、吡啶、乙酸、甲醛、甘油等有機(jī)溶劑，不溶于醚類、丙酮。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，其主要用途可以用于生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹(shù)脂。由于三聚氰胺有毒，會(huì)對(duì)人體造成很大危害，因此在對(duì)于食品的加工環(huán)節(jié)時(shí)，三聚氰胺被禁止加入食品中。
乳制品中大多可能含有三聚氰胺，要想檢測(cè)出三聚氰胺，可采用氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等。
試驗(yàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，會(huì)產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除待測(cè)組分之外的其他組分（基質(zhì)），經(jīng)常會(huì)對(duì)待測(cè)組分的分析造成一定的干擾，會(huì)對(duì)待測(cè)組分的測(cè)定造成增強(qiáng)或者抑制。因此需對(duì)其產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采用外標(biāo)法或者內(nèi)標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行消除。
1 材料與方法
1.1 儀器與設(shè)備
LC-20UFLC/API3200液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；XH-C旋渦混合器（廣州前旗電子科技有限公司）；DVG-9076B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海巖硎儀器制造有限公司）；HSC-H氮吹儀（福建歡儀有限公司）；TGL16N高速冷凍離心機(jī)（廣西顧寧儀器有限公司）；LSPE-13固相萃取儀（福建葉翎儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（上海冠德精儀儀器有限公司）；KQ-700數(shù)控超聲波清洗器（上海雙旭電子有限公司）；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京娜維斯儀器有限公司）；HN-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（杭州尹思特諾儀器制造有限公司）。
1.2 材料與試劑
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度 99.0%，批號(hào) G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（Melamine-13 C3，100 μg/mL，CAS號(hào)1173022-88-2）；甲醇、乙腈（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；老酸奶、牛軋?zhí)牵ㄙ?gòu)于樂(lè)山家家樂(lè)超市）。
1.3 試驗(yàn)條件
色譜柱采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙酸銨溶液-乙腈（1︰1，V/V），乙酸調(diào)至pH 3；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣30 psi；輔助加熱氣30 psi；離子化溫度450 ℃。
表1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)
1.4 試驗(yàn)方法
樣品經(jīng)2.1的方法溶解后，參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》[14]第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）法中4.4.1.1提取方法進(jìn)行提取、4.4.2凈化方法進(jìn)行凈化。
1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的三聚氰胺儲(chǔ)備液。
三聚氰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取1 mL三聚氰胺內(nèi)標(biāo)溶液至10 mL容量瓶中，甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度10 μg/mL的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。
2 結(jié)果與分析
2.1 膠基的溶解
由于乳制品老酸奶、牛軋?zhí)侵芯心z基，無(wú)法直接提取三聚氰胺，需將老酸奶、牛軋?zhí)侵兴哪z基溶解后進(jìn)行三聚氰胺的提取。在對(duì)老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基進(jìn)行溶解的探究過(guò)程中，嘗試3種方法。稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠犯?份，置于50 mL塑料離心管中，分別用3 L純水、2 mL純水+2 mL 95%乙醇、3 mL 60%甲醇作溶劑[4]，在恒溫水浴鍋中加熱10 min后，觀察老酸奶、牛軋?zhí)堑葮悠返娜芙馇闆r，選出溶解膠基的最佳試劑，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 老酸奶、牛軋?zhí)侨芙馇闆r
由表2說(shuō)明：純水對(duì)老酸奶、牛軋?zhí)悄z基的溶解效果最好，原因可能是老酸奶、牛軋?zhí)侵芯忻髂z，明膠是一種大分子物質(zhì)并且易與水結(jié)合，雖然3種溶解試劑中均含有水，但明膠不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明膠遇到甲醛時(shí)，明膠成為不可逆的凝狀膠體，且不溶于水，3種溶解試劑中純水溶解效果較好。故后續(xù)試驗(yàn)采用3 mL純水作溶劑溶解乳制品老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基。
2.2 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)
采用提取后添加法測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)式（1）計(jì)算二者相對(duì)比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。
式中：A和B分別表示純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中分析物的峰面積；若B/A＞1，表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)；若B/A＜1，表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)；若B/A=1，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。B/A介于0.8～1.2時(shí)，可不用消除基質(zhì)效應(yīng)；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基質(zhì)效應(yīng)干擾強(qiáng)烈[5]，需要消除或降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
表3數(shù)據(jù)表明：試樣中基質(zhì)效應(yīng)均＜0.8，表明基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且因基質(zhì)效應(yīng)遠(yuǎn)小于0.8，表明基質(zhì)效應(yīng)的干擾強(qiáng)烈，需要消除或降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，否則試驗(yàn)結(jié)果偏差較大。
表3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)
2.3 外標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的消除
2.3.1 隨行加標(biāo)
分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，編號(hào)。樣品經(jīng)2.1的方法溶解后，分別加入一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照1.4進(jìn)行樣品處理，配制成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個(gè)標(biāo)樣。另取9個(gè)空白樣品，分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 外標(biāo)法加標(biāo)回收率、精密度（n=3） 單位：%
2.3.2 基質(zhì)配標(biāo)
設(shè)置1～6號(hào)空白試樣，分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，按2.1的方法溶解后，按1.4對(duì)老酸奶和牛軋?zhí)沁M(jìn)行樣品處理，配制成6個(gè)空白溶液，用空白溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個(gè)標(biāo)樣。進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀，測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積，以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，以三聚氰胺峰面積為縱坐標(biāo)，繪制得三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取9個(gè)空白樣品，分別設(shè)置成濃度2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
2.4 內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的消除
取6個(gè)10 mL容量瓶，分別加入一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)容量瓶中加入一定量的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)中間液，配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度為1，2，4，8，16和20 ng/mL的標(biāo)點(diǎn)，每份溶液含內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，三聚氰胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。另分別設(shè)置低、中、高3組試樣，每組試樣中取3個(gè)溶解后的樣品各加入20 μL三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物，低濃度2.434 μg/kg、中濃度5.079 μg/kg和高濃度10.16 μg/kg這3組試樣。每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定其平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 內(nèi)標(biāo)法加標(biāo)回收率、精密度（n=3） 單位：%
結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法所測(cè)得的三聚氰胺平均加標(biāo)回收率均在100%左右，均高于外標(biāo)法所測(cè)得的平均加標(biāo)回收率，表明內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確度好，徹底消除因基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。
2.5 方法學(xué)驗(yàn)證
2.5.1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖
如圖1～圖3所示，三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)母離子分別為127.1和130.2，三聚氰胺子離子特征離子峰選取68.0和85.0，三聚氰胺內(nèi)標(biāo)子離子特征離子峰為70.1和87.1。在此條件下，三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值最高。
圖1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)一級(jí)質(zhì)譜圖
圖2 三聚氰胺內(nèi)標(biāo)二級(jí)質(zhì)譜圖
圖3 三聚氰胺二級(jí)質(zhì)譜圖
2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍
準(zhǔn)確吸取不同體積的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液劑內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇水（1+1，V/V）配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL的標(biāo)點(diǎn)，每份溶液含內(nèi)標(biāo)濃度10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，三聚氰胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 單位：%
2.5.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度
分別設(shè)置低濃度、中濃度、高濃度3組試樣，每組試樣中分別加入一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物，配制濃度分別為低濃度2 μg/kg、中濃度5 μg/kg和高濃度10 μg/kg這3組試樣。低、中、高3組水平平行測(cè)定3次。以測(cè)定結(jié)果與理論加標(biāo)量的比值表示加標(biāo)回收率，以3次測(cè)定結(jié)果的SRSD值表示精密度，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 內(nèi)標(biāo)法測(cè)得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 單位：%
結(jié)果表明，試驗(yàn)方法測(cè)定老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋菲骄訕?biāo)回收率在100.7%～104.5%之間，SRSD在0.3%～2.9%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高、平行性好，方法成熟、可靠。
3 結(jié)論
采用液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)含乳型老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋泛?，因所選樣品中含有大量膠基，無(wú)法直接提取所含三聚氰胺，因此試驗(yàn)優(yōu)化樣品中膠基溶解的方法，考察樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。比較外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法降低液質(zhì)聯(lián)用儀在檢測(cè)中帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)影響，試驗(yàn)結(jié)果表明僅選用基質(zhì)加標(biāo)的方法無(wú)法徹底消除樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，基于此也無(wú)法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，試驗(yàn)選用內(nèi)標(biāo)法取得很好的效果。方法學(xué)驗(yàn)證表明，試驗(yàn)方法具有方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于對(duì)含乳型老酸奶、牛軋?zhí)堑群z基食品中三聚氰胺的測(cè)定。
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乳制品中大多可能含有三聚氰胺，要想檢測(cè)出三聚氰胺，可采用氣相色譜-質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等。
試驗(yàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，會(huì)產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)指樣品中除待測(cè)組分之外的其他組分（基質(zhì)），經(jīng)常會(huì)對(duì)待測(cè)組分的分析造成一定的干擾，會(huì)對(duì)待測(cè)組分的測(cè)定造成增強(qiáng)或者抑制。因此需對(duì)其產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并采用外標(biāo)法或者內(nèi)標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行消除。
1 材料與方法
1.1 儀器與設(shè)備
LC-20UFLC/API3200液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；XH-C旋渦混合器（廣州前旗電子科技有限公司）；DVG-9076B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海巖硎儀器制造有限公司）；HSC-H氮吹儀（福建歡儀有限公司）；TGL16N高速冷凍離心機(jī)（廣西顧寧儀器有限公司）；LSPE-13固相萃取儀（福建葉翎儀器有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（上海冠德精儀儀器有限公司）；KQ-700數(shù)控超聲波清洗器（上海雙旭電子有限公司）；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京娜維斯儀器有限公司）；HN-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（杭州尹思特諾儀器制造有限公司）。
1.2 材料與試劑
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度 99.0%，批號(hào) G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（Melamine-13 C3，100 μg/mL，CAS號(hào)1173022-88-2）；甲醇、乙腈（均為色譜純）；三氯乙酸（分析純）；老酸奶、牛軋?zhí)牵ㄙ?gòu)于樂(lè)山家家樂(lè)超市）。
1.3 試驗(yàn)條件
色譜柱采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換與C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙酸銨溶液-乙腈（1︰1，V/V），乙酸調(diào)至pH 3；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；掃描方式ESI+；離子噴霧電壓4 500 V；氣簾氣30 psi；霧化氣30 psi；輔助加熱氣30 psi；離子化溫度450 ℃。
表1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)
1.4 試驗(yàn)方法
樣品經(jīng)2.1的方法溶解后，參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》[14]第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）法中4.4.1.1提取方法進(jìn)行提取、4.4.2凈化方法進(jìn)行凈化。
1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的三聚氰胺儲(chǔ)備液。
三聚氰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確吸取1 mL三聚氰胺內(nèi)標(biāo)溶液至10 mL容量瓶中，甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度10 μg/mL的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。
2 結(jié)果與分析
2.1 膠基的溶解
由于乳制品老酸奶、牛軋?zhí)侵芯心z基，無(wú)法直接提取三聚氰胺，需將老酸奶、牛軋?zhí)侵兴哪z基溶解后進(jìn)行三聚氰胺的提取。在對(duì)老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基進(jìn)行溶解的探究過(guò)程中，嘗試3種方法。稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠犯?份，置于50 mL塑料離心管中，分別用3 L純水、2 mL純水+2 mL 95%乙醇、3 mL 60%甲醇作溶劑[4]，在恒溫水浴鍋中加熱10 min后，觀察老酸奶、牛軋?zhí)堑葮悠返娜芙馇闆r，選出溶解膠基的最佳試劑，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 老酸奶、牛軋?zhí)侨芙馇闆r
由表2說(shuō)明：純水對(duì)老酸奶、牛軋?zhí)悄z基的溶解效果最好，原因可能是老酸奶、牛軋?zhí)侵芯忻髂z，明膠是一種大分子物質(zhì)并且易與水結(jié)合，雖然3種溶解試劑中均含有水，但明膠不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明膠遇到甲醛時(shí)，明膠成為不可逆的凝狀膠體，且不溶于水，3種溶解試劑中純水溶解效果較好。故后續(xù)試驗(yàn)采用3 mL純水作溶劑溶解乳制品老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分兴z基。
2.2 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)
采用提取后添加法測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)式（1）計(jì)算二者相對(duì)比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。
式中：A和B分別表示純?nèi)軇┡c基質(zhì)溶液中分析物的峰面積；若B/A＞1，表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)；若B/A＜1，表示基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)；若B/A=1，表示不存在基質(zhì)效應(yīng)。B/A介于0.8～1.2時(shí)，可不用消除基質(zhì)效應(yīng)；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基質(zhì)效應(yīng)干擾強(qiáng)烈[5]，需要消除或降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
表3數(shù)據(jù)表明：試樣中基質(zhì)效應(yīng)均＜0.8，表明基質(zhì)對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)，且因基質(zhì)效應(yīng)遠(yuǎn)小于0.8，表明基質(zhì)效應(yīng)的干擾強(qiáng)烈，需要消除或降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，否則試驗(yàn)結(jié)果偏差較大。
表3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)
2.3 外標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的消除
2.3.1 隨行加標(biāo)
分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，編號(hào)。樣品經(jīng)2.1的方法溶解后，分別加入一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照1.4進(jìn)行樣品處理，配制成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個(gè)標(biāo)樣。另取9個(gè)空白樣品，分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 外標(biāo)法加標(biāo)回收率、精密度（n=3） 單位：%
2.3.2 基質(zhì)配標(biāo)
設(shè)置1～6號(hào)空白試樣，分別稱取1 g老酸奶、牛軋?zhí)菢悠分糜?支50 mL離心管，按2.1的方法溶解后，按1.4對(duì)老酸奶和牛軋?zhí)沁M(jìn)行樣品處理，配制成6個(gè)空白溶液，用空白溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL這6個(gè)標(biāo)樣。進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀，測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積，以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，以三聚氰胺峰面積為縱坐標(biāo)，繪制得三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取9個(gè)空白樣品，分別設(shè)置成濃度2，5和10 μg/kg的低、中、高3組水平，做三水平三平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。
2.4 內(nèi)標(biāo)法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的消除
取6個(gè)10 mL容量瓶，分別加入一定量的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)容量瓶中加入一定量的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)中間液，配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度為1，2，4，8，16和20 ng/mL的標(biāo)點(diǎn)，每份溶液含內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，三聚氰胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定對(duì)應(yīng)的峰面積，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。另分別設(shè)置低、中、高3組試樣，每組試樣中取3個(gè)溶解后的樣品各加入20 μL三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物，低濃度2.434 μg/kg、中濃度5.079 μg/kg和高濃度10.16 μg/kg這3組試樣。每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，測(cè)定其平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 內(nèi)標(biāo)法加標(biāo)回收率、精密度（n=3） 單位：%
結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法所測(cè)得的三聚氰胺平均加標(biāo)回收率均在100%左右，均高于外標(biāo)法所測(cè)得的平均加標(biāo)回收率，表明內(nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確度好，徹底消除因基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。
2.5 方法學(xué)驗(yàn)證
2.5.1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜圖
如圖1～圖3所示，三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)母離子分別為127.1和130.2，三聚氰胺子離子特征離子峰選取68.0和85.0，三聚氰胺內(nèi)標(biāo)子離子特征離子峰為70.1和87.1。在此條件下，三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值最高。
圖1 三聚氰胺及其內(nèi)標(biāo)一級(jí)質(zhì)譜圖
圖2 三聚氰胺內(nèi)標(biāo)二級(jí)質(zhì)譜圖
圖3 三聚氰胺二級(jí)質(zhì)譜圖
2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性范圍
準(zhǔn)確吸取不同體積的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液劑內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇水（1+1，V/V）配制成三聚氰胺質(zhì)量濃度1，2，4，8，16和20 ng/mL的標(biāo)點(diǎn)，每份溶液含內(nèi)標(biāo)濃度10 ng/mL。以三聚氰胺濃度為橫坐標(biāo)，三聚氰胺與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線 單位：%
2.5.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度
分別設(shè)置低濃度、中濃度、高濃度3組試樣，每組試樣中分別加入一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、三聚氰胺內(nèi)標(biāo)物，配制濃度分別為低濃度2 μg/kg、中濃度5 μg/kg和高濃度10 μg/kg這3組試樣。低、中、高3組水平平行測(cè)定3次。以測(cè)定結(jié)果與理論加標(biāo)量的比值表示加標(biāo)回收率，以3次測(cè)定結(jié)果的SRSD值表示精密度，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7 內(nèi)標(biāo)法測(cè)得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 單位：%
結(jié)果表明，試驗(yàn)方法測(cè)定老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋菲骄訕?biāo)回收率在100.7%～104.5%之間，SRSD在0.3%～2.9%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高、平行性好，方法成熟、可靠。
3 結(jié)論
采用液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)含乳型老酸奶、牛軋?zhí)侵腥矍璋泛?，因所選樣品中含有大量膠基，無(wú)法直接提取所含三聚氰胺，因此試驗(yàn)優(yōu)化樣品中膠基溶解的方法，考察樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。比較外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法降低液質(zhì)聯(lián)用儀在檢測(cè)中帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)影響，試驗(yàn)結(jié)果表明僅選用基質(zhì)加標(biāo)的方法無(wú)法徹底消除樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，基于此也無(wú)法獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，試驗(yàn)選用內(nèi)標(biāo)法取得很好的效果。方法學(xué)驗(yàn)證表明，試驗(yàn)方法具有方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于對(duì)含乳型老酸奶、牛軋?zhí)堑群z基食品中三聚氰胺的測(cè)定。
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