莫皓然，黃名正,，張 群，唐維媛,2，李婷婷,2，許存賓,，劉曉柱，于志海，李 鑫

（1.貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州貴陽 550003；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院，教育部環(huán)境污染監(jiān)測與疾病控制重點實驗，貴州貴陽 550025）

無籽刺梨（Rosa sterilis），也稱金刺梨，是薔薇科薔薇屬植物，是貴州特有的刺梨資源，在貴州多地都有分布，其中在安順地區(qū)種植較多，超過25 萬畝[1-2]。無籽刺梨果含有VC[3-6]、多酚[7]、黃酮[8]、多糖[9]和超氧化物歧化酶（SOD）[10]等多種營養(yǎng)物質和生理活性成分，具有極高的藥食兩用價值。無籽刺梨與刺梨（Rosa roxburghiiTratt）兩者具有非常近的親緣關系[4,11-12]，因此營養(yǎng)成分相似但有所差異[3,5]，無籽刺梨的含糖量高于刺梨，其果實口感也優(yōu)于刺梨，在食品行業(yè)中，無籽刺梨可作為刺梨的替代品或與刺梨果實混用[13]。

食品風味是食品重要的品質之一，無籽刺梨具有獨特濃郁的香氣，目前對無籽刺梨的研究聚焦在其營養(yǎng)成分的分析，鮮有文獻對其香氣進行研究，已有文獻報道了無籽刺梨精油揮發(fā)性成分[13-15]，付慧曉等[15]用固相微萃取技術和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，對刺梨和無籽刺梨的香氣成分進行了分析；張丹等[16-17]分別對安順普定刺梨與無籽刺梨的營養(yǎng)成分及香氣物質比較及貴州不同產(chǎn)地無籽刺梨的基本營養(yǎng)成分及香氣物質比較進行了研究，香氣成分提取方法為頂空固相微萃?。℉S-SPME）；林靈等[18]對金刺梨的風味物質經(jīng)過發(fā)酵處理前后的變化進行了研究，采用了頂空固相微萃?。℉S-SPME）提取風味物質?，F(xiàn)有研究主要采用頂空固相微萃取（HS-SPME）法提取無籽刺梨中揮發(fā)性成分，液液萃取（LLE）聯(lián)合溶劑輔助風味蒸發(fā)（SAFE）法應用較少。

測定食品中的風味成分組成復雜，不同香氣提取方法具有不同的效果，目前常用的揮發(fā)性成分提取方法有頂空固相微萃?。℉S-SPME）、同時蒸餾萃取法（SDE）、液液萃?。↙LE）聯(lián)合溶劑輔助風味蒸發(fā)（SAFE）等。HS-SPME 是集采樣、濃縮、進樣為一體的處理技術[19]，且在處理過程中不會造成揮發(fā)性成分的損失和分解等優(yōu)勢。HS-SPME 能有效避免一些大分子的干擾，具有操作簡單、樣品用量少、重現(xiàn)性好、靈敏度高、可實現(xiàn)選擇性吸附等優(yōu)點，但對沸點較高的揮發(fā)性成分提取效果較差[20]。SDE 法操作簡便，萃取效率較高，但需要使用化學溶劑，萃取溫度高，對一些熱敏性香氣組分影響較大[21]。LLE-SAFE能有效分離復雜基質中的揮發(fā)性物質，因為分離條件一般為低溫、高真空，能減少熱敏性揮發(fā)性成分的損失，可以較好保留萃取物原有的自然風味[22]，此方法更加適用于水果、蔬菜等的香氣成分的分析[23]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，將HS-SPME 與LLE-SAFE 兩種提取方法結合，能夠較全面地剖析刺梨樣品中揮發(fā)性成分的組成[24]。

本研究根據(jù)課題組在刺梨揮發(fā)性成分研究中建立的方法[25-27]，以無籽刺梨為研究對象，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）、液液萃取聯(lián)合溶劑輔助風味蒸發(fā)（LLE-SAFE）來提取揮發(fā)性成分，通過氣質聯(lián)用（GC-MS）進行揮發(fā)性成分的鑒定，并通過分析香氣活性值（Odor Active Value，OAV），來全面分析無籽刺梨揮發(fā)性成分及其呈香貢獻，為無籽刺梨的香氣品質控制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無籽刺梨 10 月份采于貴州安順市，已達到商業(yè)成熟度，新鮮無霉爛變質；環(huán)己酮 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；CH2Cl2、NaCl、無水Na2SO4分析純，薩恩化學技術（上海）有限公司；正構烷烴（C7～C30）色譜純，默克（北京）有限公司。

Shimadzu TQ8040NX 氣質譜聯(lián)用儀 島津（中國）有限公司；PAL 自動固相微萃取裝置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭 瑞士CTC 公司；TGL-16A 冷凍離心機 湖南平凡科技有限公司；GDSZ-2025 恒溫水浴系統(tǒng) 鞏義予華儀器有限公司；溶劑輔助風味蒸發(fā)裝置（定制）德國Glasbl?serei Bahr 公司；FF-100/110 分子渦輪泵 北京中科科儀股份有限公司；韋式蒸餾柱（定制）江蘇三愛思科學儀器有限公司；HN200 型氮吹儀 海能儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無籽刺梨汁的制備 無籽刺梨洗凈、破碎后榨汁，4 ℃下4500 r/min 離心5 min，取上清液在-20 ℃下凍藏備用。

1.2.2 液液萃取聯(lián)合溶劑輔助風味蒸發(fā)法 取200 mL無籽刺梨汁水浴25 ℃下解凍，加入10 μL 環(huán)己酮并移入500 mL 分液漏斗，50 mL 二氯甲烷萃取三次，待試液完全分層后再合并萃取液，加入無水硫酸鈉后過濾。SAFE 按圖1 方式安裝[22]，500 mL 圓底燒瓶為蒸餾瓶，水浴溫度為40 ℃，接收瓶和冷阱置于液氮中冷卻，SAFE 蒸餾頭夾層水浴溫度為40 ℃。在30 min 內將150 mL 萃取液用滴液漏斗緩慢、均勻加入到蒸餾瓶中，渦輪分子泵使系統(tǒng)壓力保持在10-4Pa。萃取液于室溫解凍，加入無水硫酸鈉干燥，韋式蒸餾濃縮至2 mL，氮吹至500 μL 備用[26]。

1.2.3 頂空固相微萃取法 參照文獻[25]的方法，將凍藏無籽刺梨汁水浴25 ℃下解凍，20 mL 頂空瓶中稱入1 g NaCl，加入8 mL 無籽刺梨汁，再加入50 μL環(huán)己酮作為內標。萃取條件為40 ℃下平衡15 min然后萃取30 min。解吸附條件為不分流模式，時間為2 min。

1.2.4 GC-MS 條件 氣相條件：色譜柱：InertCap Wax 毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持5 min，3 ℃/min 速度升至250 ℃，保持5 min；載氣流速為1.88 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流比5:1；溶劑延遲時間3.5 min。

(2)對分好的詞進行編碼，根據(jù)詞編碼，進一步生成每個句子的編號向量，向量采用固定長度，不足的位置補0。

質譜條件：電子電離（Electron Ionization,EI）；電離能量為70 eV；離子源溫度230 ℃；掃描范圍m/z 29～500。

1.2.5 化合物定性及定量 定性：美國國家標準與技術研究院（NIST17）質譜庫進行檢索，同時使用線性保留指數(shù)（retention index，RI）對比鑒定。保留指數(shù)（RI）按以下公式計算：

式中：n 為正構烷烴碳原子數(shù)；tx為待測物質保留時間，min；tn和tn+1是分別是正構烷烴Cn、Cn+1的保留時間，min。

定量：采用內標法定量，內標環(huán)己酮。按以下公式計算待測物質量濃度：

式中：As為內標物的峰面積；Ax為待測物的峰面積；ρs是內標物的質量濃度，μg/L。

1.2.6 香氣活性值計算 OAV 值按以下公式計算：

式中：ρi是揮發(fā)性成分的質量濃度，μg/L；OTi為其在水中的閾值，μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 無籽刺梨中揮發(fā)性成分的GC-MS 結果分析

總離子流圖如圖2 所示，兩種方法共計鑒定出115 種揮發(fā)性成分，相同的物質為21 種。HS-SPME提取檢測到59 種化合物，LLE-SAFE 提取檢測到75 種。圖3 和表1 結果顯示，HS-SPME 檢測到的揮發(fā)性成分以酯類（33.44%）、醛類（32.23%）及萜烯類（16.31%）為主，LLE-SAFE 以醇類（34.49%）和酸類（57.35%）為主。

表1 無籽刺梨汁中揮發(fā)性成分的定性定量結果及香氣活性值（OAVs）Table 1 Quantitative results and OAVs of volatile compounds in R.sterilis juice

圖2 無籽刺梨揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.2 Total ionic chromatogram of volatiles in R.sterilis

圖3 無籽刺梨汁中各類揮發(fā)性成分的數(shù)量及百分含量Fig.3 Quantities and percentage contents of various volatile components in R.sterilis

2.1.1 酯類 酯類主要具有水果香韻，如濃郁的蘋果香、玫瑰花香和蜂蜜香，花香和果蔬香氣物質的氣味前體通常是支鏈和芳香族氨基酸、半胱氨酸和蛋氨酸[26-27]等。如表1 所示，兩種方法共檢測到酯類25 種，共同檢出的酯類有5 種。采用HS-SPME 檢測到15 種酯類，酯類在HS-SPME 中所有檢測化合物的含量占比最高，為33.44%，含量較高的三種酯類為2-乙酸庚酯、癸酸乙酯及2-乙酸戊酯，分別為16063.68、5698.71 和4145.66 μg·L-1，這與張丹等[17]研究發(fā)現(xiàn)酯類化合物是無籽刺梨整體香氣形成的重要組成部分的結論一致。LLE-SAFE方法檢測到酯類有14 種，但占比卻只有2.13%，含量最高的是乙酸苯乙酯，為44415.68 μg·L-1，占所檢測酯類總含量的一半以上。內酯一般具有椰子或堅果香味特征的環(huán)狀酯[28]，與我們對刺梨揮發(fā)性成分的研究類似[16-17]，在無籽刺梨中也檢測到γ-己內酯（2229.07 μg·L-1）、丁內酯（2129.00 μg·L-1）、己內酯（1486.74 μg·L-1）和丙位癸內酯（1363.53 μg/L）。

2.1.2 醇類 脂肪酸的氧化和氨基酸的降解是植物中醇類的主要來源[29]。兩種方法共檢測到27 種醇類，共有的醇類包括2-庚醇、己醇和苯乙醇3 種。HS-SPME 檢測到的6 種醇類中，（Z）-3-己烯醇含量較高，這類烯醇一般是在乙醇脫氫酶的作用下代謝生成的[30]，可貢獻新鮮的青草氣味和草本植物氣味。此外，含量較高的還有2-壬醇和2-庚醇。LLE-SAFE法萃取出26 種醇類，占比34.49%，含量較高的分別有異戊醇、（Z）-3-己烯醇、苯乙醇和己醇，并檢測到了含硫化合物3-甲硫基丙醇。兩種方法對醇類物質的提取分離效率差異明顯，LLE-SAFE 對醇類化合物的提取效率更佳，尤其是沸點較高的醇類。相較其他無籽刺梨的研究[14-17]，采用兩種提取方法檢測到更多的烯醇類物質，如2-甲基-3-丁烯-2-醇、1-戊烯-3 醇、3-戊烯-2-醇、（Z）-2-戊烯醇、3-甲基-4-戊烯-1-醇、（E）-3-己烯醇、（Z）-3-己烯醇、（E）-2-己烯醇、（Z）-3-辛烯醇，可能是由于烯醇具有相對較高的沸點所導致，LLE-SAFE 萃取更有效率。

2.1.3 醛、酮類 直鏈醛、酮主要來源于氨基酸代謝和脂肪酸的氧化。其中，脂肪酸廣泛存在于植物界，是揮發(fā)性成分重要的生源前體之一，脂肪酸代謝主要有三種路徑：α-氧化、β-氧化、脂氧合酶途徑[30]。兩種方法提取醛、酮類的種類和含量有較大差異，共檢測到25 種醛酮類物質，共有的僅有苯甲醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮。HS-SPME 提取到更多的醛類，而LLE-SAFE 提取到更多的酮類物質。HS-SPME 法萃取到11 種醛類和7 種酮類物質，含量最高的是2-己烯醛和2-壬酮，其濃度分別為36462.78、4754.93 μg·L-1，具有青香、果香。LLE-SAFE 法萃取到1 種醛類10 種酮類，酮類含量最高的是3-羥基-2-丁酮，其含量為152728.27 μg·L-1，占酮類總含量的77%，此化合物高度稀釋后有令人愉快的甜香、奶香、脂肪香氣。

2.1.4 酸類 揮發(fā)性酸主要來源是脂肪酸的氧化[30]。兩種方法共檢測到酸類18 種，HS-SPME 則只檢測到乙酸、己酸和辛酸3 種。LLE-SAFE 中檢測到18 種酸類，占比為57.35%，在所有檢測的種類中最高。己酸在兩種提取方法中均是含量最高的，分別為3853.72 和925047.56 μg·L-1，分別占到酸類總含量的63%和41%。LLE-SAFE 還檢測到了大量的（E）-3-己烯酸、辛酸、（E）-3-辛烯酸和癸酸，這與文獻[15-18]報道一致。酸類物質一般具有較高的沸點和弱揮發(fā)性[19,26]，因此，兩種方法所得酸類物質的種類和含量差異較大。

2.1.5 萜烯類 萜烯類的前體是二甲基烯丙基焦磷酸和異戊二烯基焦磷酸[23]，萜烯類物質一般以糖苷形式存在，在酸或酶的水解作用下形成游離態(tài)具有揮發(fā)性的香氣物質，從而夠賦予其果香和花香。萜烯類化合物的香氣閾值較低，即使是在較低的濃度下也對物質有較大的呈香貢獻，而且有助于形成特殊的香氣。兩種方法共檢測到萜烯類物質14 種，共有的為β-環(huán)檸檬醛和2-冰片烯。HS-SPME 檢測到13 種萜類，含量較高的有3,5,11-桉葉三烯、γ-Selinene、α-沉香呋喃、β-二氫沉香呋喃。（Z）-β-羅勒烯、β-石竹烯、β-環(huán)檸檬醛等在先前對無籽刺梨及刺梨的研究中均有報道[8,10,12]。LLE-SAFE 檢測到4 種萜類，分別是Intermedeol、（Z）-氧化芳樟醇、2-冰片烯和β-環(huán)檸檬醛。本研究中檢測到的萜烯類化合物的種類與其他文獻有所差異[16-17]，這可能與產(chǎn)地、提取方法及檢測方法的差異相關[26]。

2.1.6 其他類 兩種方法共檢測到其他類物質6 種。HS-SPME 檢測到4 種物質，含量最高是茶香螺烷，文獻[16-17]也有報道，具有草本香和茶香。LLESAFE 中檢測到大量的苯乙烯，具有甜香、汽油味的香韻。

2.2 無籽刺梨汁中揮發(fā)性成分的OAV 分析

香氣的貢獻大小由揮發(fā)性成分的濃度及其氣味閾值決定，香氣活性值（odor activity value，OAV）是評估呈香貢獻的常用指標之一，當揮發(fā)性成分的濃度大于閾值，該物質才能被嗅覺感知，即當OAV≥1時[31]，該成分對樣品總體氣味有明顯呈香貢獻，稱其為氣味活性物質。如表1 所示，有79 種化合物的氣味閾值查自文獻，其余化合物因未查到其氣味閾值故未計算OAV，結果顯示，HS-SPME 中有32 種化合物的OAV≥1，LLE-SAFE 中有44 種，共有的化合物有9 種。LLE-SAFE 中對無籽刺梨整體香氣具有較大貢獻的化合物比HS-SPME 中多，LLE-SAFE 對無籽刺梨香氣貢獻較大的化合物主要是醇類和酸類，HS-SPME 對無籽刺梨香氣貢獻較大的化合物主要是酯類。

酯類化合物中，HS-SPME 中OAV≥1 的物質有13 種，較高的有乙酸乙酯（707）、丁酸乙酯（567）、己酸乙酯（414）、2-乙酸戊酯（276）、乙酸異戊酯（177）和辛酸乙酯（169）。在LLE-SAFE 中OAV≥1 的物質有10 種，己酸乙酯（1352）、乙酸異戊酯（524）、丙位癸內酯（273）和辛酸乙酯（153）的香氣貢獻較大。酯類物質一般具有濃郁的花香、果香，貢獻了無籽刺梨突出的果香、甜香及花香氣味，與對無籽刺梨及刺梨的香氣輪廓研究的結果較為一致[8,17,24]。

醇類中，OAV≥1 的香氣活性物質分別有3 種和14 種，賦予了無籽刺梨青味、草本味和脂肪味。其中，HS-SPME 中為2-壬醇（51）、2-庚醇（41）和（Z）-3-己烯醇（1），LLE-SAFE 中是異戊醇（3491）、己醇（196）、2-庚醇（177）、（Z）-3-己烯醇（118），苯乙醇（114）和（E）-3-己烯醇（71）。

兩種方法檢測到OAV≥1 的醛類共有5 種，HS-SPME 中OAV 最大的為2-己烯醛（1215），具有青味和杏仁味。此外，己醛（289）也有較高的呈香貢獻。LLE-SAFE 中只有苯甲醛具有呈香貢獻，OAV為4。具有香氣貢獻的酮類共有7 種，分別為α-紫羅酮、2-壬酮、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-羥基-2-丁酮、苯乙酮和2-己酮，賦予無籽刺梨果香、花香、甜香和草本香。

OAV≥1 的酸類共有10 種，雖然LLE-SAFE 提取到了大量的酸類物質，但酸類閾值較高，對無籽刺梨汁的特征氣味貢獻有限。其中，OAV 較高的是己酸（356）、辛酸（122）、庚酸（19）和癸酸（11），這些物質都具有脂肪氣味和酸臭味。OAV≥1 的萜烯類共有6 種，β-環(huán)檸檬醛、（Z）-β-羅勒烯和（Z）-氧化芳樟醇具有較大的呈香貢獻，賦予無籽刺梨草本香和花香。此外，2-乙基呋喃具有豆香、烤面包的焦香香氣，苯乙烯也具有濃郁果香香氣，兩者的OAV 分別為405、321。

綜上，結合OAV 分析，鑒定出對無籽刺梨整體香氣具有較大貢獻的化合物30 種。其中，酯類中有7 種，分別是己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、2-乙酸戊酯、丙位癸內酯和辛酸乙酯；醇類有8 種，分別是異戊醇、己醇、2-庚醇、（Z）-3-己烯醇，苯乙醇、（E）-3-己烯醇、2-壬醇和2-庚醇；醛、酮類物質有6 種，分別是2-己烯醛、己醛、α-紫羅酮、2-壬酮、3-羥基-2-丁酮、苯乙酮；酸類有4 種，分別是己酸、辛酸、庚酸和癸酸；萜烯類中只有β-環(huán)檸檬醛、（Z）-β-羅勒烯和（Z）-氧化芳樟醇3 種具有較高的呈香貢獻；此外，2-乙基呋喃和苯乙烯對無籽刺梨也有香氣貢獻。

3 討論

通過采用HS-SPME 法和LLE-SAFE 法提取無籽刺梨中的揮發(fā)性物質，提取方法的差異會導致無籽刺梨提取物中揮發(fā)性物質種類及含量的變化。結果表明，酯類、醇類和醛酮類是無籽刺梨中最主要的揮發(fā)性物質，這與付慧曉等[15]的研究結果相似。HSSPME 對酯類物質通常表現(xiàn)出較LLE-SAFE 更好的提取效果[32]，無籽刺梨中的酯類物質往往閾值較低，對無籽刺梨的呈香尤其是花果香具有顯著貢獻，例如無籽刺梨中OAV 較高的乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯，表明乙酯類對無籽刺梨的香氣做出很大貢獻，其中己酸乙酯是兩種提取方式均提取到的物質，這些酯類物質賦予了其果香、甜香以及類似菠蘿香的香氣特征。與酯類物質不同的是，醇類多具有較高的閾值，對比發(fā)現(xiàn)HS-SPME 對醇類物質提取效果較差，但通過SAFE 提取鑒定出了多達20 種醇類物質，其中異戊醇OAV 高達3492，賦予無籽刺梨果香的香氣特征，趙榮飛的研究也表明異戊醇是無籽刺梨中重要的一大物質[33]。醛酮類物質在無籽刺梨中的含量較刺梨而言較低，但以2-己烯醛（1215）、己醛（289）和2-庚酮（238）為代表的醛酮類物質也具有較高的OAV 值，有較大的呈香貢獻，賦予了無籽刺梨青草香以及類似奶酪和肉桂的香氣特征。除酯類、醇類和醛酮類外，無籽刺梨中還鑒定出了酸類、芳香族類和其他類物質，兩種提取方式對這些物質的提取表現(xiàn)出較大差異，其中兩種方式共同提取出的物質包括，乙酸、己酸、辛酸、2-冰片烯、β-環(huán)檸檬醛、茶香螺烷。本研究通過GC-MS 分析鑒定，確定了無籽刺梨中的揮發(fā)性物質組成，通過計算OAV 對揮發(fā)性物質的呈香貢獻做出了分析，主要的呈香貢獻物質包括異戊醇、2-己烯醛、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己醛和己酸等，這些物質通過各自的香氣特征，助力無籽刺梨風味的形成，并對無籽刺梨的香氣做出重要的貢獻。

4 結論

采用兩種提取方法結合的方式，對無籽刺梨揮發(fā)性成分進行較為全面的分析，共鑒定出115 種物質，HS-SPME 方法檢測到59 種，LLE-SAFE 方法檢測到75 種，其中酯類25 種，醇類27 種，醛類11 種，酮類14 種，酸類18 種，萜烯類14 種，其他類6 種；兩種提取方法因對不同沸點物質的提取效率不同，所得揮發(fā)性成分的種類及含量有明顯差異，共同檢測到化合物只有21 種，HS-SPME 提取分離到更多種類的酯類、醛類和萜烯類物質，而LLE-SAFE 提取到更多的醇類、酸類和酮類。通過OAV 分析，共計有30 種化合物對無籽刺梨的香氣有主要貢獻作用，但這些物質的呈香貢獻還需進一步的精準定量并使用分子感官科學相關技術來開展深入的研究。