田亞賓

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

沈舒

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

劉東來(lái)

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

趙蘭青

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

石大偉

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

許四宏＊

中國(guó)食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室

宮頸癌是全球女性第四大常見癌癥。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年全球約有60.4 萬(wàn)例宮頸癌新發(fā)病例和34.2 萬(wàn)例死亡病例，其中約90%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在低、中等收入國(guó)家[1]。高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌的主要原因。由于HPV核酸檢測(cè)試劑盒具有較高的靈敏度，逐漸替代細(xì)胞學(xué)或與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測(cè)用于宮頸癌的篩查[2]。2021 年，WHO 更新了《宮頸癌癌前病變篩查和治療指南》，推薦HPV 核酸檢測(cè)作為宮頸癌初篩的首選方法[3]。目前，HPV 核酸（分型）檢測(cè)試劑盒眾多，涉及的方法學(xué)較多，包括常見的PCR 熒光法和PCR 反向雜交法，以及其他方法，如基因芯片法、酶切信號(hào)放大法、雜交捕獲法、測(cè)序法、飛行時(shí)間質(zhì)譜法等[4-5]。PCR 熒光法是檢測(cè)HPV 核酸應(yīng)用最廣的一種方法，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)擴(kuò)增靶區(qū)的引物和標(biāo)記不同熒光信號(hào)的特異性探針，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。由于PCR 熒光法不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，醫(yī)院及科研機(jī)構(gòu)等單位廣泛使用該類試劑盒。截至2023 年8月，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)（https://www.nmpa.gov.cn/）上輸入“人乳頭瘤病毒，PCR 熒光法”進(jìn)行檢索，統(tǒng)計(jì)檢出13 種高危型HPV 核酸檢測(cè)試劑盒，現(xiàn)有國(guó)產(chǎn)及進(jìn)口注冊(cè)證共46 個(gè)，涉及生產(chǎn)企業(yè)34 家，分別來(lái)自北京、上海、廣州、杭州、廈門等多個(gè)城市。HPV 核酸檢測(cè)試劑盒為第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品，其審評(píng)審批、生產(chǎn)監(jiān)管及市場(chǎng)監(jiān)管均按照我國(guó)第三類醫(yī)療器械產(chǎn)品的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行管理。目前，上市產(chǎn)品參照YY/T 1226—2022《人乳頭瘤病毒核酸（分型）檢測(cè)試劑盒》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定各自的產(chǎn)品技術(shù)要求[6]。由于產(chǎn)品檢測(cè)范圍不同，各企業(yè)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)亦不相同。為加強(qiáng)HPV 核酸檢測(cè)試劑盒的監(jiān)管，評(píng)價(jià)該類產(chǎn)品的質(zhì)量現(xiàn)狀，確保產(chǎn)品在臨床使用中安全有效和質(zhì)量可控，2022 年2 月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局組織開展了HPV 核酸檢測(cè)試劑盒抽檢工作[7]。本文將對(duì)2022 年度HPV 核酸檢測(cè)試劑盒抽檢情況匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料與儀器

1.1 樣品

抽檢相關(guān)產(chǎn)品的企業(yè)參考品和相關(guān)信息，由各生產(chǎn)企業(yè)提供。探索性研究評(píng)價(jià)用的國(guó)家參考品為第二代人乳頭瘤病毒全基因組分型國(guó)家參考品（370060-201901）和第二代人乳頭瘤病毒L1 基因分型國(guó)家參考品（370110-202201），由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；細(xì)胞質(zhì)控品為凍干樣品，由廣東凱普生物科技有限公司提供。國(guó)家參考品和細(xì)胞質(zhì)控品的具體組成詳見表1。其中，國(guó)家參考品覆蓋試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的所有型別，細(xì)胞質(zhì)控品覆蓋試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的部分型別。

表1 國(guó)家參考品和細(xì)胞質(zhì)控品的組成

1.2 試劑

人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ﹣?lái)自北京、上海、浙江、河南、江蘇、廣東、福建的不同企業(yè)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)，共15 批次產(chǎn)品。其中，國(guó)產(chǎn)13 批次、進(jìn)口2 批次。部分試劑盒為HPV16 和HPV18 分型，部分試劑盒為全分型，可分2～24 種型別。其中，核酸提取或純化試劑以及其他配套試劑均由企業(yè)及醫(yī)療機(jī)構(gòu)自行提供。

1.3 儀器

ABI7500 熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；SLAN-96S 全自動(dòng)熒光定量PCR 儀（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；GeneLight 9820 全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（廈門安普利生物工程有限公司）；cobas x 480 全自動(dòng)核酸分離純化儀（瑞士羅氏診斷公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效樣本分布統(tǒng)計(jì)

本次抽檢的15 批次HPV 核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ﹣?lái)自北京、上海、浙江、河南、江蘇、廣東和福建（圖1）。涉及注冊(cè)證共13 張，占HPV 核酸檢測(cè)試劑盒注冊(cè)證總數(shù)的28%。其中，國(guó)產(chǎn)注冊(cè)證12 張，進(jìn)口注冊(cè)證1 張。涉及生產(chǎn)企業(yè)共12 家，占HPV 核酸檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)企業(yè)總數(shù)的35%。其中，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)11 家（產(chǎn)品13 批次），國(guó)外生產(chǎn)企業(yè)1 家（產(chǎn)品2 批次）。15 批次試劑中8 批次來(lái)自使用環(huán)節(jié)，7 批次來(lái)自生產(chǎn)環(huán)節(jié)。上述結(jié)果顯示，抽檢覆蓋率較低。抽檢的試劑盒大多數(shù)可分型，為HPV16/HPV18 分型和全分型。檢測(cè)操作的自動(dòng)化程度上，大多數(shù)試劑盒自動(dòng)化程度較低。

圖1 15 批次HPV 核酸檢測(cè)試劑盒基本信息

2.2 性能檢驗(yàn)

本次檢驗(yàn)項(xiàng)目選擇準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)限和精密度4 個(gè)關(guān)鍵性能指標(biāo)評(píng)價(jià)，具體內(nèi)容見表2。按照各生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品技術(shù)要求進(jìn)行檢測(cè)，其中12 批次使用企業(yè)參考品檢測(cè)，3 批次使用國(guó)家參考品檢測(cè)。結(jié)果合格產(chǎn)品數(shù)量為13 批次，占比為87%；不合格產(chǎn)品數(shù)量為2 批次，占比為13%，均來(lái)自生產(chǎn)環(huán)節(jié)（圖2）。13 批次試劑盒檢測(cè)上述性能指標(biāo)均符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，不同型別之間無(wú)交叉反應(yīng)。2 批次試劑盒檢測(cè)結(jié)果不合格，其中1 批次試劑盒的陰性對(duì)照不成立，檢測(cè)內(nèi)標(biāo)通道無(wú)循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct 值）或Ct 值大于32，不符合試劑盒聲稱的質(zhì)量控制要求；另1 批次試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照不成立，PCR 反應(yīng)液E 孔檢測(cè)HPV39、HPV45 和HPV68 通道無(wú)Ct 值或Ct 值大于26，不符合試劑盒聲稱的質(zhì)量控制要求。由于質(zhì)控體系不符合要求，造成實(shí)驗(yàn)無(wú)效，從而無(wú)法判定參考品的檢測(cè)結(jié)果。推測(cè)可能的原因?yàn)樯a(chǎn)環(huán)節(jié)中陰性、陽(yáng)性對(duì)照的配制或者出廠檢驗(yàn)結(jié)果判定存在問(wèn)題。

圖2 15 批次HPV 核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果

表2 檢驗(yàn)項(xiàng)目及性能要求

2.3 探索性研究

2.3.1 檢測(cè)限評(píng)價(jià)

為了有效評(píng)估不同試劑盒檢測(cè)新一代國(guó)家參考品的檢出能力，使用11 批次試劑盒檢測(cè)稀釋至最低檢測(cè)限的國(guó)家參考品。結(jié)果顯示，2 批次試劑盒無(wú)法檢出HPV68a 或 HPV68b（表3），提示企業(yè)需要補(bǔ)充完善企業(yè)參考品，并進(jìn)一步評(píng)估其準(zhǔn)確性性能。4 批次試劑盒不符合產(chǎn)品技術(shù)要求聲稱的檢測(cè)限，其余試劑盒符合相應(yīng)要求。通過(guò)比較企業(yè)參考品和國(guó)家參考品的檢測(cè)結(jié)果（Ct值）發(fā)現(xiàn)，企業(yè)參考品的定量偏差較大，提示企業(yè)需要進(jìn)一步對(duì)最低檢測(cè)限作詳細(xì)評(píng)估。

表3 HPV 核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.3.2 細(xì)胞質(zhì)控品評(píng)價(jià)

為了有效評(píng)估細(xì)胞質(zhì)控品的準(zhǔn)確性和有效性，使用11 批次試劑盒檢測(cè)高濃度（106copies/ml）和低濃度（104copies/ml）的細(xì)胞質(zhì)控品。結(jié)果顯示，9 批次試劑盒均可以檢出不同型別的高濃度細(xì)胞質(zhì)控品（符合率為11/11），1 批次試劑盒無(wú)法檢出HPV16、HPV18 和 HPV52 型質(zhì)控品，另外1 批次試劑盒無(wú)法檢出HPV6 型（表4）。分析檢測(cè)不同型別符合率為11/11 的9 批次試劑盒的Ct 值結(jié)果，發(fā)現(xiàn)同一型別HPV 細(xì)胞質(zhì)控品的Ct 值差異較大，提示檢測(cè)結(jié)果的強(qiáng)弱不同（圖3），這可能與各試劑盒配套的核酸純化試劑的提取效率不同有關(guān)。對(duì)于低濃度細(xì)胞質(zhì)控品，11 批次試劑盒的檢出能力差異較大，且檢測(cè)不同型別的符合率較低，造成這種差異的原因可能與不同檢測(cè)試劑盒的分析靈敏度有關(guān)。

圖3 9 批次試劑盒檢測(cè)不同型別HPV 細(xì)胞質(zhì)控品的Ct 值匯總

表4 不同型別細(xì)胞質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果符合率匯總

3 討論

HPV 核酸檢測(cè)試劑盒因其具有較高的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，在臨床上應(yīng)用較廣。其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性對(duì)于宮頸病變及宮頸癌的篩查具有重要臨床意義[8]。由于該類試劑盒種類較多，涉及多種方法學(xué)，試劑盒的質(zhì)量參差不齊。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YY/T 1226—2014）自2015 年7 月1 日實(shí)施以來(lái)，提升了該類試劑盒的質(zhì)量，但依然存在一些問(wèn)題。2013 年和2015 年國(guó)家藥品監(jiān)管部門開展了HPV 檢測(cè)試劑盒抽檢工作，發(fā)現(xiàn)存在HPV 型別交叉反應(yīng)現(xiàn)象及部分試劑盒缺少內(nèi)控的現(xiàn)象[9-11]。2022 年，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局再次開展該類試劑盒的抽檢工作，評(píng)價(jià)其質(zhì)量現(xiàn)狀[7]。然而，本次抽檢工作可能受疫情影響，整體覆蓋率不高。共抽檢15 批次產(chǎn)品，2 批次產(chǎn)品不合格，不合格檢出率為13%，抽檢產(chǎn)品的總體質(zhì)量一般。

本次抽檢的檢驗(yàn)依據(jù)為企業(yè)各自的產(chǎn)品技術(shù)要求，考察項(xiàng)目為準(zhǔn)確性、特異性、檢測(cè)限和精密度4 個(gè)項(xiàng)目。通過(guò)資料審核、檢驗(yàn)檢測(cè)和探索性研究，發(fā)現(xiàn)了以下問(wèn)題及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)：①試劑盒的質(zhì)量控制不符合要求，包括陰陽(yáng)性對(duì)照不成立、未設(shè)置內(nèi)對(duì)照或陰性對(duì)照未參與樣品處理和檢測(cè)全過(guò)程。由于實(shí)驗(yàn)操作中質(zhì)量控制對(duì)監(jiān)測(cè)整個(gè)檢測(cè)體系至關(guān)重要，質(zhì)控體系的無(wú)效直接影響臨床檢驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[12]。②試劑盒未能檢出檢測(cè)范圍內(nèi)的亞型型別，如HPV68a 或HPV68b 型。這可能與企業(yè)參考品的設(shè)置不夠完善有關(guān)。分析各企業(yè)的產(chǎn)品技術(shù)要求，發(fā)現(xiàn)用于出廠或型式檢驗(yàn)的企業(yè)參考盤中準(zhǔn)確性參考品和最低檢測(cè)限參考品未覆蓋檢測(cè)范圍內(nèi)的所有型別，無(wú)法全面評(píng)估試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度。性能評(píng)估的局限會(huì)影響該類試劑盒的質(zhì)量，在臨床應(yīng)用中可能會(huì)造成漏檢。③用于評(píng)估試劑盒靈敏度的檢測(cè)限參考品量值準(zhǔn)確性差異較大。由于各企業(yè)參考品的定量標(biāo)準(zhǔn)不一，且上一代國(guó)家參考品量值的局限性，造成不同企業(yè)最低檢測(cè)限的可比性較差。在臨床應(yīng)用時(shí)，造成不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用不同試劑盒或在同一機(jī)構(gòu)使用不同試劑盒，檢測(cè)結(jié)果的一致性較差[13]。④參考品亟需更新?lián)Q代。現(xiàn)有國(guó)家參考品均為質(zhì)粒樣品，無(wú)法評(píng)估核酸提取環(huán)節(jié)。在本次抽檢中，使用細(xì)胞質(zhì)控品進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)控品可以有效評(píng)估試劑盒的檢測(cè)能力，可作為下一代HPV 國(guó)家參考品的候選樣品。然而，對(duì)于如何有效評(píng)估試劑盒核酸提取效率對(duì)試劑盒性能的影響及細(xì)胞質(zhì)控品的定量準(zhǔn)確性，需要進(jìn)一步研究。

為了提升HPV 核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量，確保臨床檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，針對(duì)本次抽檢作出以下建議：①加大抽檢力度，完善和優(yōu)化抽樣模式，保證抽檢的覆蓋面廣，更加合理評(píng)估試劑盒的現(xiàn)狀。②督促各企業(yè)針對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行深入分析，促使企業(yè)進(jìn)行改進(jìn)或者變更，以達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量這一目的。③建議標(biāo)準(zhǔn)管理部門加強(qiáng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)宣貫，企業(yè)及時(shí)關(guān)注行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)更新動(dòng)態(tài)，并根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及時(shí)完善產(chǎn)品技術(shù)要求。④不斷優(yōu)化更新國(guó)家參考品，更加科學(xué)合理地評(píng)價(jià)各試劑盒的檢測(cè)性能?？傊?，本次抽檢工作為HPV 核酸檢測(cè)試劑盒的科學(xué)監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支撐。積極解決抽檢工作中的問(wèn)題，在一定程度上有助于提高HPV 核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量，使其更好地服務(wù)于臨床應(yīng)用。