李偉暢,朱國平,王雪輝,林龍山,李 淵,杜飛雁

(1.上海海洋大學 海洋科學學院,上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,廣州 510300; 3.自然資源部第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)實驗室,廈門 361005;4.上海海洋大學 極地研究中心,上海 201306;5.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室極地海洋生態(tài)系統(tǒng)研究室,上海 201306;6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋牧場重點實驗室,廣州 510300;7.國家數(shù)字漁業(yè)(海洋牧場)創(chuàng)新分中心,廣州 510300)

鲹科(Carangidae)隸屬輻鰭亞綱(Actinopterygii)、鱸形目(Perciformes),廣泛分布于東海、南海、印度洋和西太平洋等海域,是南海漁業(yè)的重要捕撈對象之一[1-2]。鲹科魚類屬中上層洄游性魚類,在春、夏季進行產(chǎn)卵洄游,但不作長距離游動,僅限于在深水和淺水之間[3]。由于南海海域廣闊、生存條件適宜,鲹科魚類成為我國南海重要的漁業(yè)資源[4]。

魚類內(nèi)耳中存在3對耳石,分別為矢耳石(sagittae)、星耳石(asteriscus)和微耳石(lapillus),位于囊狀結構內(nèi)[5]。矢耳石為大多數(shù)硬骨魚中最大的耳石,已被廣泛用于研究魚類的種類鑒定、種群判別和年齡與生長等方面[6]。耳石形態(tài)差異一直被認為是確定魚類種群的有效工具[7],并成功用于各種小型中上層魚類如沙丁魚(Sardinesspp.)、歐洲鳀(Engraulisencrasicolus)、大西洋鯡魚(Clupeaharengus)、鮐(Scomberjaponicus)、大西洋鮭(Salmosalar)等的種群鑒定[8-9]。此外,耳石形狀分析也有助于描述一定地理范圍內(nèi)同種魚類的耳石變化。如魏聯(lián)等[10]分析發(fā)現(xiàn)南設得蘭群島外側水域的次南極電燈魚(Electronacarlsbergi)耳石分為4種類型,且左、右耳石類型存在差異;李史民等[11]研究發(fā)現(xiàn)南設得蘭群島南極電燈魚(Electronaantarctica)耳石的生長更趨向于厚度的增加。目前,利用耳石外型進行物種鑒別主要有傳統(tǒng)形態(tài)測量法和幾何形態(tài)測量法。傳統(tǒng)形態(tài)測量法具有操作簡便、容易掌握、不需要復雜工具等特點,而幾何形態(tài)測量法可較好地提取和分析耳石形狀信息,其主要采用橢圓傅里葉分析。橢圓傅里葉分析法可提供耳石形狀的正弦和余弦形式的函數(shù)[12],在區(qū)分群體單位和獲取重要信息方面快速、客觀。此外,高質(zhì)量圖像和形狀信息獲取技術的快速發(fā)展,以及統(tǒng)計能力的快速提升[13],使快速而又準確地采集大量耳石數(shù)據(jù)成為可能。

國內(nèi)對南海鲹科魚類的研究主要集中于其數(shù)量分布[14]、種群生物學[15-16]、產(chǎn)卵場[14]和漁業(yè)聲學資源評估[2]。在攝食生態(tài)學和系統(tǒng)分類學等領域,由于攝食動物胃含物中魚類外部形態(tài)無法識別,而耳石形態(tài)具有種間特異性、不易被消化和數(shù)據(jù)獲取簡單等特點,其常被用于胃含物中魚類的種類鑒定[17]。南海鲹科魚類矢耳石的形態(tài)特征也有過報道,但主要是根據(jù)其耳石形態(tài)建立對鲹科魚類的分類檢索表[18]。機器學習算法比傳統(tǒng)分類模型更靈活,能夠處理具有非線性關系或具有相互作用的生物數(shù)據(jù),在解決魚類物種和種群分類方面具有巨大的潛力[19]。然而,目前國內(nèi)機器學習分類在基于耳石形狀區(qū)分魚類物種和種群方面的應用是有限的?；诓煌瑱C器學習算法,對南海鲹科魚類矢耳石進行種群結構和種群分類的相關研究尚未有報道。運用主成分分析、線性判別分析和隨機森林算法已有相關研究報道[7,20]。而K-最近鄰算法是簡單和直觀的非參數(shù)分類過程,其優(yōu)勢之一是其對數(shù)據(jù)結構具有較高容忍度[21],可應用于多類問題的分析。通過選擇出最適的K值和計算訓練集與測試集特征值之間的距離,來選出K個距離最近的分類[22]。支持向量機能夠處理高維數(shù)據(jù)集并靈活地對各種數(shù)據(jù)源建模,該算法使用核函數(shù)將預測變量投影到更大維度的特征空間中,從而可以構建線性模型[23]。為此,本文通過形態(tài)學方法和傅里葉分析方法對兩種鲹科魚類的矢耳石形態(tài)特征進行研究,分析兩種鲹科魚矢耳石形態(tài)學參數(shù)差異,并對矢耳石各形態(tài)學參數(shù)與魚體叉長進行擬合,通過主成分分析、線性判別分析、隨機森林、支持向量機和K-最近鄰算法比較研究兩種鲹科魚矢耳石輪廓特征,并分析了這些方法對鲹科魚類矢耳石的分類效果,以期為日后在南海鲹科魚類耳石方面的深入研究積累基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本采集于2019年6—7月中國南海中南部海域,金帶細鲹(Selaroidesleptolepis)和長體圓鲹(Decapterusmacrosoma)共108尾。樣本冷凍保存后運回實驗室進行研究。測量其叉長(fork length,FL)、體質(zhì)量(total weight,TW)等數(shù)據(jù),其中,叉長精確至0.1 cm,體質(zhì)量精確至0.01 g,并利用鑷子和解剖刀將耳石取出。選取金帶細鲹共64尾,取得完整左耳石64枚,右耳石64枚;選取長體圓鲹共44尾,取得完整左耳石44枚,右耳石41枚。通過t檢驗發(fā)現(xiàn),兩種鲹科魚的左、右耳石均無顯著性差異(P>0.05),因此,選取左耳石進行分析。本研究魚類生物學數(shù)據(jù)如表1。

表1 金帶細鲹和長體圓鲹樣本生物學信息

1.2 耳石處理及形態(tài)測量

利用超純水和超聲波清洗機將魚體內(nèi)取出的矢耳石進行清洗,將耳石干燥后放入離心管內(nèi)保存。將左耳石放置在反射光下的黑色背景上,并調(diào)整方向以滿足R包“ShapeR”的要求[12]。根據(jù)耳石的大小調(diào)整立體顯微鏡的放大倍數(shù),在OLYMPUS SZ61型解剖鏡下進行拍照,利用Digimizer軟件測量耳石高(otolith height,OH)、耳石長(otolith length,OL)、耳石面積(otolith area,OA)和耳石周長(otolith perimeter,OP),結果精確到0.001 mm。

1.3 外型分析

1.3.1 形態(tài)指標分析

參考文獻[24-26],對金帶細鲹和長體圓鲹耳石的耳石高、耳石長、耳石面積和耳石周長等4個形態(tài)學參數(shù)進行測量,將4個形態(tài)學參數(shù)通過公式轉換為6個耳石形態(tài)指標,即環(huán)率(circularity)、圓度(roundness)、幅形比(aspect ratio)、形態(tài)因子(form factor)、矩形趨近率(rectangularity)和橢圓率(ellipticity)。

1.3.2 橢圓傅里葉分析

橢圓傅里葉分析法原理是利用數(shù)學表達式系數(shù)來對耳石形態(tài)輪廓進行描述和分析,具體處理過程參見文獻[12]。其將耳石的閉合二維輪廓分解為一系列封閉曲線(即諧波),每個諧波由4個傅里葉描述子系數(shù)構成,即an、bn、cn、dn,其中n代表諧波數(shù)量,共產(chǎn)生4n個傅里葉描述子系數(shù)[27]。使用ShapeR軟件包讀取耳石圖片,提取了12組傅里葉諧波,由耳石整體形態(tài)輪廓中提取了48個橢圓傅里葉描述子系數(shù)。在系數(shù)提取過程中,第一組諧波的前3個值被設為定值,并以叉長作為協(xié)變量,利用協(xié)方差分析消除叉長對耳石形狀的影響。最終,本研究中每個耳石整體形態(tài)輪廓由44個橢圓傅里葉描述子系數(shù)構成,用于后續(xù)的主成分分析及判別分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對提取出的數(shù)據(jù)進行標準化,并利用Shapiro-Wilk(S-W)檢驗其正態(tài)性,對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進行均值相等性檢驗及單因子方差分析(ANOVA)檢驗。根據(jù)符合檢驗標準的耳石尺寸參數(shù),擬合耳石各個形態(tài)學參數(shù)與叉長的函數(shù)關系,R2值最大者為最適合函數(shù)[28-29]。并通過配對樣本t檢驗探究耳石各形態(tài)學參數(shù)和指標的差異性。對滿足檢驗標準的橢圓傅里葉系數(shù)進行主成分分析(principal component analysis,PCA),得出前20個主成分的貢獻率,再運用線性判別分析法(linear discriminant analysis,LDA)、隨機森林(random forest,RF)、支持向量機(support vector machines,SVM)和K-最近鄰(K-nearest neighbor,KNN)對兩種鲹科魚種耳石形態(tài)進行判別,得到正確率。將樣本分為訓練樣本和測試樣本,訓練樣本占總樣本的80%,測試樣本占總樣本的20%,其中隨機森林的分類樹為500,K-最近鄰的K值取2,支持向量機的核函數(shù)為linear。以上所有數(shù)據(jù)的分析處理及統(tǒng)計學研究使用R 4.1.0和Excel 2010軟件完成,PCA、LDA、RF、SVM和KNN分別采用R 4.1.0程序中的FactoMineR、MASS、RandomForest、e1071和class包實現(xiàn)。顯著性水平為P=0.05。除非另有說明,所有數(shù)據(jù)均以平均值±1倍標準差表示。

2 結果與分析

2.1 耳石與形態(tài)測量分析

2.1.1 耳石尺寸參數(shù)與叉長關系

金帶細鲹和長體圓鲹耳石的基葉和翼葉分化明顯,耳石形狀呈長橢圓形,并且隨著其叉長的增長而增長,耳石周圍存在較多脊突,裂溝與基葉和翼葉之間的主間溝清晰可見,裂溝從主間溝一直向后延伸并于耳石后部向下彎曲。由圖1(a)可知,金帶細鲹矢耳石周圍脊突發(fā)育明顯,耳石背部和耳石腹部發(fā)育表現(xiàn)為向外凸出,基葉和翼葉之間的主間溝發(fā)育不明顯,基葉發(fā)育呈現(xiàn)略短且粗壯,翼葉僅有一點小的突起。長體圓鲹耳石背部存在較多明顯脊突,基葉和翼葉之間有較為明顯的主間溝,基葉和翼葉發(fā)達且末端較尖銳[圖1(b)]。

(a)金帶細鲹;(b)長體圓鲹。

t檢驗結果顯示(表2),金帶細鲹和長體圓鲹的耳石高(OH)、耳石長(OL)、耳石面積(OA)與耳石周長(OP)這4項指標均存在極顯著性差異(P<0.01)。

表2 金帶細鲹及長體圓鲹耳石尺寸參數(shù)比較

金帶細鲹和長體圓鲹耳石各尺寸參數(shù)與叉長之間的關系均呈冪函數(shù)關系(表3),且顯示各形態(tài)尺寸與叉長間均存在極顯著的相關性 (P<0.01)。通過冪函數(shù)關系可以看出,金帶細鲹和長體圓鲹的耳石大小均會隨叉長、年齡的增長而增大。

表3 金帶細鲹和長體圓鲹叉長與耳石形態(tài)參數(shù)間的函數(shù)關系

2.1.2 耳石形狀指標

通過觀察耳石形狀指標統(tǒng)計結果(表4),金帶細鲹和長體圓鲹耳石形狀指標存在極顯著差異(P<0.01)。金帶細鲹耳石形狀比長體圓鲹更為規(guī)則,更趨近于圓,長體圓鲹的主間溝更為明顯。環(huán)率表示耳石外型輪廓趨于圓的程度,其值越小,耳石輪廓就越趨近于圓。金帶細鲹環(huán)率明顯低于長體圓鲹,在一定程度上表明金帶細鲹耳石更趨近于圓。形態(tài)因子表示耳石的規(guī)則程度,耳石輪廓越規(guī)則,形態(tài)因子參數(shù)值就越大。長體圓鲹的形態(tài)因子均值低于金帶細鲹,表明金帶細鲹耳石形狀更為規(guī)則。

表4 金帶細鲹和長體圓鲹耳石形態(tài)參數(shù)比較

2.2 主成分分析

PCA結果顯示,第一主成分和第二主成分因子的貢獻率分別為20.1%和13.3%。由主成分因子分布圖可以看出(圖2),金帶細鲹和長體圓鲹的耳石在第一因子上可進行很好地區(qū)分,僅少量重疊存在于第一因子和第二因子之間,具有比較好的區(qū)分效果。

圖2 基于橢圓傅里葉諧波的金帶細鲹和長體圓鲹耳石第一和第二主成分因子分布圖

2.3 判別分析

根據(jù)符合檢驗標準的傅里葉描述子系數(shù)(均值相等性檢驗,單因素方差分析,P<0.05),對金帶細鲹和長體圓鲹的矢耳石進行判別分析。從判別結果來看,隨機森林的判別效果是最好的,對鲹科魚類耳石形態(tài)的判別正確率達到100%,效果最差的是支持向量機,原因是在測試集中有3個樣本被錯誤分類,但總體判別效果較好,訓練樣本的判別正確率達到了100%,測試樣本的判別正確率為86.67%(表5)。

表5 金帶細鲹和長體圓鲹耳石整體形態(tài)的判別分析結果

3 討論與結論

3.1 耳石形態(tài)學

通過對兩種鲹科魚類的矢耳石形態(tài)進行分析,金帶細鲹和長體圓鲹的耳石形狀均呈長橢圓形,具有較發(fā)達的基葉和翼葉,且隨著其叉長的增長而增長,耳石周圍存在較多脊突,裂溝與基葉和翼葉之間的主間溝清晰可見。其他科魚種如阿拉斯加狹鱈(Gaduschalcogrammus)矢耳石的形態(tài)呈橢圓形,主間溝不較為明顯,而翼葉與基葉比較發(fā)達[27];南極小帶腭魚(Cryodracoantarcticus)的矢耳石形狀較規(guī)則,趨近于矩形,背部和腹部邊緣較光滑平整[28]。以上耳石研究說明本研究中的兩種同科魚類耳石形態(tài)在某種程度上具有一定的相似性,而相較于非此科魚類的耳石形態(tài),兩者具有明顯差異。

通過測量和計算金帶細鲹和長體圓鲹耳石的4種形態(tài)學參數(shù)和6個形態(tài)指標,對兩種鲹科魚類的耳石形態(tài)進行分析。結果表明,兩種鲹科魚類的耳石高、長、面積、周長和各項形態(tài)指標均呈極顯著性差異:金帶細鲹耳石形狀更規(guī)則,更趨近于圓,耳石基葉發(fā)育呈現(xiàn)為略短且粗壯,翼葉僅有一點突起;長體圓鲹主間溝明顯,基葉和翼葉發(fā)達且末端較尖銳。研究表明,除了遺傳因素外兩種魚類的生活習性不同也是造成以上差異的原因。長體圓鲹在開放水域聚集或成群洄游,棲息水深一般為20～170 m,而金帶細鲹主要棲息于近海大陸架區(qū)域(水深50～70 m),并于松軟地質(zhì)的水域成群洄游[29-31]。

耳石在魚類年齡與生長等方面的應用廣泛,然而耳石大小與魚體大小的關系在不同魚類之間具有特異性[6]。本研究結果表明,兩種鲹科魚類耳石高、長、面積、周長均隨叉長的增長而增長或變大。在耳石形態(tài)學參數(shù)與魚類叉長的擬和過程中,冪函數(shù)為各個耳石形態(tài)學參數(shù)與長體圓鲹叉長的最適擬和函數(shù),并且擬合效果較好(R2>0.5)。歐利國等[32]對南海東沙群島海域的56尾長體圓鲹耳石測量后表明,其耳石長與叉長的關系式為FL=30.065OL-54.293(R2=0.433),其樣本叉長范圍為16.4～24.6 cm。上述結果與本文研究結果雖有所不同,但可得出長體圓鲹耳石長隨叉長的增長而增長。

魚類耳石形態(tài)受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響,棲息于不同地區(qū)的同種魚耳石形態(tài)受到的影響主要來自于環(huán)境因素[33-34]。魚類外型對耳石形態(tài)也有一定的影響,南海鲹科魚類從秋季到春季洄游,每到繁殖期(一般為春夏季),鲹科魚類會洄游到特定海域產(chǎn)卵,可能在此因素的影響下一些魚體的外形為流線型,并促使其耳石整體也呈現(xiàn)流線型[35],鲹科魚類矢耳石形態(tài)特征可能是遺傳因素和生活環(huán)境共同作用的結果。

3.2 耳石傅里葉分析

耳石由碳酸鈣和其他無機鹽構成,結構較為穩(wěn)定,通常形成后就不易發(fā)生改變。耳石易受到魚類所在環(huán)境和棲息地強烈影響,并且在測量時具有數(shù)據(jù)易獲取、數(shù)據(jù)處理過程簡單等優(yōu)點,因此,耳石傳統(tǒng)形態(tài)測量學被廣泛用于魚類種群的識別和捕食者食性分析。然而,傳統(tǒng)形態(tài)測量學并不是保證所有魚類物種正確分類的好方法[36]。第一,形狀指標由形態(tài)學參數(shù)通過公式轉換得到,因此,大多數(shù)形狀指標具有強相關性,這就導致了多重共線性問題。形態(tài)指標之間的強多重共線性會限制分析過程中變量的數(shù)量,從而降低分類模型的準確度。第二,形狀指標并不一定意味著對象的真實描述,在個體發(fā)育過程中,耳石形狀會在剖面或整個輪廓上具有或多或少的突出和改變[37]。當突出和改變較小時,形狀指數(shù)可能保持不變。因此,與肉眼明顯不同的耳石可能會具有相似的形狀指數(shù)值。

故本文利用幾何形態(tài)測量法的橢圓傅里葉分析對耳石輪廓進行提取,使其在形態(tài)學上的分析更加具體和形象,并對兩種鲹科魚類進行種類判別。耳石外型輪廓提取出的前12組傅里葉諧波很好描述了耳石輪廓形狀。主成分因子分布圖顯示,金帶細鲹和長體圓鲹耳石形態(tài)的橢圓傅里葉描述子系數(shù)的前2個主成分的貢獻率分別為20.1%和13.3%,隨著主成分增加,低值的主成分對耳石整體形態(tài)輪廓變化產(chǎn)生的影響較大[38],由主成分因子的分布圖可以看出第一主成分和第二主成分間有部分重疊,且在第一因子方向上可進行較好區(qū)分,整體區(qū)分效果相對較好。耳石形態(tài)特征分析已成功用于黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)、大西洋鱒(Oncorhynchusketa)等魚類的種群判別,結果顯示研究耳石形態(tài)特征是鑒別魚類種群的一種有效方法[39]。同時由于耳石具有高特異性、易保存和不易被消化等特點,耳石形態(tài)分析也在捕食者食性分析、確定魚類的年齡和生長、古生態(tài)學、古生物地理學、系統(tǒng)發(fā)育,魚類的生活史和營養(yǎng)生態(tài)學研究等方面得到了廣泛運用[18,40]。雖然傅里葉分析法獲取數(shù)據(jù)比傳統(tǒng)形態(tài)學測量法更加復雜,但其在分析過程中可以盡量消除耳石位置、大小等差異和人工測量產(chǎn)生帶來的誤差,是一種更好的分析方法[35,39]。在本研究中,隨機森林的判別精度最高,達到了100%,并且其他模型也都具有較好的準確性,表明機器學習算法是一種有效的分類方法,其基于傅里葉分析在耳石形狀對物種和種群鑒定方面有著較好的效果。不同機器學習算法的性能依據(jù)具體情況而定,其效果隨數(shù)據(jù)集中類別數(shù)量、組間相似性和變量數(shù)量的不同而變化[19],因此,我們建議在判別研究中需測試一系列分類器,以提高判別的準確性。本文利用耳石形態(tài)對南海金帶細鲹和長體圓鲹兩種鲹科魚類進行研究并基于不同機器學習算法對其進行判別,為日后南海鲹科魚類耳石的種間差異及個體識別積累了基礎數(shù)據(jù),也為今后對南海鲹科資源的研究和保護提供了幫助。但目前對其種群結構的研究較少,在今后的研究中可結合年齡與生長和耳石微化學等方法開展對南海鲹科魚類的種群研究。

致謝：感謝王守信、陳盟基、黎紅、柯蘭香、符麗雅和王佳燕等在樣本生物學測定和耳石提取過程中的幫助。感謝魏聯(lián)、陳毓雯和曹丹在數(shù)據(jù)處理方面的幫助。感謝國家遠洋漁業(yè)工程技術研究中心、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)開發(fā)重點實驗室、中國水產(chǎn)科學研究院海洋牧場技術重點實驗室、廣東省海洋休閑漁業(yè)工程技術研究中心和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站提供樣本、實驗儀器和設施。