陳慧玲,沈浩天,姜 晨,李憲臻,郭小宇

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 微生物資源與催化實(shí)驗(yàn)室,大連 116033)

蔗糖作為一種易于吸收的營(yíng)養(yǎng)素,能夠?yàn)橛袡C(jī)體快速提供能量,但過(guò)量攝入蔗糖容易引起肥胖及糖尿病等健康問(wèn)題。因此,蔗糖的健康替代品——異麥芽酮糖引起了研究者的關(guān)注。與蔗糖相比,異麥芽酮糖具有耐酸性高、吸濕性低、非致齲齒性和安全性高,在血液中分解緩慢,不刺激胰島素分泌,避免脂肪過(guò)度積累等優(yōu)點(diǎn)[1]。異麥芽酮糖在自然界中含量低,且難以使用化學(xué)方法合成,主要利用微生物轉(zhuǎn)化法及酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。但微生物轉(zhuǎn)化法存在分離提取較困難、生產(chǎn)強(qiáng)度弱等缺點(diǎn),工業(yè)上一般采用酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)異麥芽酮糖[2]。酶轉(zhuǎn)化法的關(guān)鍵是蔗糖異構(gòu)酶(SIase),該酶亦稱(chēng)異麥芽糖合酶、蔗糖α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和海藻糖合酶。蔗糖異構(gòu)酶主要通過(guò)微生物發(fā)酵獲得,如非食品安全級(jí)菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)、食品安全級(jí)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等。與非食品安全級(jí)菌株相比,食品安全級(jí)菌株不存在熱原和內(nèi)毒素等安全問(wèn)題,其表達(dá)的酶制劑、抗體等可直接用于食品藥物,所以利用食品安全級(jí)菌株進(jìn)行蔗糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)備受關(guān)注[3]。本文總結(jié)了近十年的文獻(xiàn)報(bào)道和最新進(jìn)展,系統(tǒng)闡述了蔗糖異構(gòu)酶的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制和在食品安全菌株中的異源表達(dá)進(jìn)展。

1 蔗糖異構(gòu)酶概述

1.1 蔗糖異構(gòu)酶的來(lái)源微生物及性質(zhì)

蔗糖異構(gòu)酶來(lái)源菌株的篩選及分離工作始于20世紀(jì)50年代,Ralf等[4]從甜菜廠排放的廢水中第一次篩選并分離出可以產(chǎn)生蔗糖異構(gòu)酶的紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)。經(jīng)過(guò)60多年的研究,已經(jīng)分離獲得多種能夠合成蔗糖異構(gòu)酶的微生物[4],如分散泛菌(Pantoeadispersa)、紅色精朊桿菌(Protaminobacterrubrum)、腸桿菌(Enterobactersp.)、大黃歐文氏菌(Erwiniarhapontici)、嗜中酸假單胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)、普城沙雷氏桿菌(Serratiaplymuthica)、克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)和放射性土壤桿菌(Agrocbacteriumradiobacter)。將這些生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的微生物按照其生產(chǎn)的蔗糖異構(gòu)酶的催化主產(chǎn)物進(jìn)行分類(lèi),主要分為兩類(lèi)微生物[5]:(1)以催化主產(chǎn)物為異麥芽酮糖的異麥芽酮糖產(chǎn)生菌,主要以P.dispersaUQ68J、Klebsiellasp.LX3為代表,該類(lèi)生產(chǎn)菌的異麥芽酮糖的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到60%～90%;(2)以催化主產(chǎn)物為海藻酮糖的海藻酮糖產(chǎn)生菌,主要以P.mesoacidophilaMX-45、A.radiobacterNX-232為代表,該類(lèi)生產(chǎn)菌的海藻酮糖的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到80%～95%。

不同微生物來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶都是單亞基分子,蛋白分子質(zhì)量大部分集中在62～70 ku,其等電點(diǎn)大多小于7.0,屬于酸性蛋白質(zhì),S.plymuthicaATCC15928的蔗糖異構(gòu)酶等電點(diǎn)偏高,為9.0。蔗糖異構(gòu)酶反應(yīng)的最適溫度在30～40 ℃,最適pH在5.0～6.0,如表1所示。蔗糖異構(gòu)酶與蔗糖反應(yīng)的溫度和pH對(duì)產(chǎn)物組成有一定的影響,P.dispersaUQ68J蔗糖異構(gòu)酶與底物的反應(yīng)溫度從20 ℃升到40 ℃時(shí),異麥芽酮糖與其他產(chǎn)物比例從21∶1降低至8∶1;當(dāng)pH 3.0時(shí),K.planticolaUQ14S蔗糖異構(gòu)酶無(wú)異構(gòu)活性,但隨著pH值的增加,異麥芽酮糖成為主要產(chǎn)物。此外,不同來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶的底物親和力存在較大差異,E.rhaponticiNX-5的Km達(dá)到257 mmol/L,而P.dispersaUQ68J的Km僅為40 mmol/L。

表1 不同來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶的相關(guān)性質(zhì)[2]

1.2 蔗糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)

為探索不同蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖的主產(chǎn)物不同的原因,對(duì)多種蔗糖異構(gòu)酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行X射線衍射解析。經(jīng)蔗糖異構(gòu)酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn)各種轉(zhuǎn)化蔗糖形成不同主產(chǎn)物的蔗糖異構(gòu)酶三級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度相似性,都是由N-結(jié)構(gòu)域、C-結(jié)構(gòu)域和亞結(jié)構(gòu)域組成的單亞基分子,如圖1所示[2,6-9]。其中,N-結(jié)構(gòu)域是一個(gè)(β/α)超二級(jí)結(jié)構(gòu),是蔗糖異構(gòu)酶最重要的部分。在N-結(jié)構(gòu)域中,Asp241、Glu295、Asp369、His145和His368(編號(hào)參照于1M53)這5個(gè)高度保守的氨基酸構(gòu)成蔗糖異構(gòu)酶的催化口袋,參與底物的催化[6-9],Glu295可以作為酸催化劑使蔗糖α1-β1糖苷鍵的氧質(zhì)子化導(dǎo)致底物水解,Asp241親核攻擊異頭碳的氫原子形成葡萄糖基-酶中間體,Asp369與葡萄糖基的O2和O3形成氫鍵,His145和His368分別與O6、O2形成氫鍵[7]。在活性位點(diǎn)附近存在一個(gè)保守的序列,該序列與酶的特異性有關(guān),在蔗糖異構(gòu)化過(guò)程中影響產(chǎn)物的比例。主產(chǎn)物為異麥芽酮糖的蔗糖異構(gòu)酶其保守的序列為RLDRD序列,而主產(chǎn)物為海藻酮糖的蔗糖異構(gòu)酶的序列為RYDRA,與RLDRD相比存在兩個(gè)堿基的差異[8]。

(a)主產(chǎn)物為異麥芽酮糖的蔗糖異構(gòu)酶三維結(jié)構(gòu);(b)主產(chǎn)物為海藻酮糖的蔗糖異構(gòu)酶三維結(jié)構(gòu)。

1.3 蔗糖異構(gòu)酶的反應(yīng)機(jī)理

進(jìn)一步探索蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖的主產(chǎn)物不同的原因,研究了蔗糖異構(gòu)酶生成異麥芽酮糖或海藻酮糖的機(jī)理。Véronèse等[10]從沙雷菌ATCC 15928中純化了蔗糖異構(gòu)酶并提出了分子內(nèi)重排的設(shè)想。Ravaud等[7]以來(lái)源于P.mesoacidophilaMX-45的蔗糖異構(gòu)酶作為研究對(duì)象提出兩步雙置換機(jī)制。Véronèse等[11]基于動(dòng)力學(xué)分析提出蔗糖異構(gòu)酶作用原理為乒乓機(jī)制。對(duì)蔗糖異構(gòu)酶活性位點(diǎn)反應(yīng)機(jī)制預(yù)測(cè)為(1)蔗糖異構(gòu)酶與蔗糖結(jié)合形成復(fù)合物;(2)酶活性位點(diǎn)的Glu的羧基離子作為酸催化劑,使蔗糖α1-βα1糖苷鍵的氧質(zhì)子化;活性位點(diǎn)的Asp攻擊蔗糖的C1氫原子,使C1氫原子脫質(zhì)子,形成葡萄糖基-酶中間體[7];(3)果糖基異構(gòu)形成異麥芽酮糖或海藻酮糖[7,11];(4)蔗糖水解生成果糖和葡萄糖。催化過(guò)程如圖2所示。蔗糖異構(gòu)酶催化機(jī)理的研究為后續(xù)蔗糖異構(gòu)酶分子改造提供理論基礎(chǔ)。

圖2 蔗糖異構(gòu)酶催化蔗糖的過(guò)程[11]

2 利用食品安全菌異源表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶的進(jìn)展

目前已有大量關(guān)于利用野生菌發(fā)酵生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的報(bào)道,但存在周期長(zhǎng)、發(fā)酵液成分復(fù)雜、分離純化復(fù)雜等缺點(diǎn),無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[1]。因此,利用工程菌異源表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)異麥芽酮糖是工業(yè)生產(chǎn)異麥芽酮糖的主流。

2.1 食品安全菌株概述

重組微生物在工業(yè)領(lǐng)域主要被用作表達(dá)宿主來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。用于食品和醫(yī)療領(lǐng)域的蛋白質(zhì)因其特殊性,在安全方面具有更高的要求,如不能包含或產(chǎn)生毒素、熱原和過(guò)敏源物質(zhì)等[12],因而需要采用食品級(jí)微生物進(jìn)行表達(dá)使其符合食品安全或醫(yī)藥安全標(biāo)準(zhǔn)。被一般公認(rèn)安全(Generally Recognized As Safe,GRAS)的微生物主要有真菌中的酵母菌、細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌和乳酸菌等。

2.1.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)

酵母是基因工程常用的底盤(pán)細(xì)胞,由于遺傳操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于各種小分子和大分子化合物的生產(chǎn)[13]。目前常用的酵母主要為畢赤酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。

畢赤酵母廣泛應(yīng)用于食品藥品生產(chǎn)。畢赤酵母具有強(qiáng)啟動(dòng)子AOX(醇氧化酶基因),可用甲醇嚴(yán)格調(diào)控異源表達(dá)的水平;發(fā)酵培養(yǎng)中不含蛋白,分離純化簡(jiǎn)單;外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易丟失[14]等優(yōu)點(diǎn)。目前,已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中得到成功表達(dá),如黃原膠內(nèi)切酶[15]。

解脂耶氏酵母是非常規(guī)半子囊酵母,被認(rèn)為是非致病性的,因其對(duì)pH、高鹽濃度和有機(jī)化合物有高耐受性;可以利用廉價(jià)碳源生長(zhǎng);有高效表達(dá)外源蛋白的能力,表達(dá)的外源蛋白不會(huì)被自身的蛋白酶降解;蛋白表達(dá)糖基化程度低等優(yōu)點(diǎn)[16],多種蛋白已成功在該系統(tǒng)中異源表達(dá),如葡萄糖氧化酶[17]。

釀酒酵母由于遺傳背景清楚、遺傳操作簡(jiǎn)單;可以進(jìn)行蛋白翻譯后修飾;發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單,成本低廉;能將外源蛋白分泌到培養(yǎng)基中;不攜帶病毒,在蛋白生產(chǎn)方面極具優(yōu)勢(shì),并被認(rèn)為是用于生產(chǎn)食品和保健產(chǎn)品的安全菌株[13]。因此,釀酒酵母是目前工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用較多的表達(dá)宿主,如細(xì)胞色素還原酶[18]等在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)高水平異源表達(dá)。

2.1.2 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)發(fā)酵歷史悠久,不產(chǎn)生毒素和致熱致敏原,故被歸為食品級(jí)微生物范疇[12]。枯草芽孢桿菌無(wú)密碼子偏好性,其蛋白分泌能力強(qiáng)且不易形成包涵體;本身?yè)碛懈咝У男盘?hào)肽和分子伴侶,可以將蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中,方便目的蛋白的分離和純化,可降低成本[19]。由于這些優(yōu)良特性,枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已被構(gòu)建用于各種蛋白的生產(chǎn)中,如淀粉酶[20]等。

橋石芽孢桿菌(Brevibacilluschoshinensis)作為食品與醫(yī)藥行業(yè)領(lǐng)域的商業(yè)食品安全菌株,發(fā)酵過(guò)程中無(wú)需純氧的補(bǔ)充,發(fā)酵成本低;蛋白表達(dá)量高、單位體積細(xì)胞產(chǎn)率高[21]。目前,橋石芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功用于多種外源蛋白的表達(dá),如磷脂酶D[22]等。

2.1.3 乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作為全球公認(rèn)安全的微生物,具有分泌蛋白能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物純化簡(jiǎn)單、非致病性等特點(diǎn),是異源蛋白表達(dá)和分泌的理想宿主[23]。隨著基因工程的發(fā)展,乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)被進(jìn)一步探索,通過(guò)多個(gè)誘導(dǎo)型和組成型啟動(dòng)子成功構(gòu)建乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)外源蛋白,如多銅氧化酶[24]。

2.2 利用食品安全菌異源表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶的研究進(jìn)展

由于食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)存在巨大應(yīng)用潛力,其已成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)[12]。故蔗糖異構(gòu)酶在食品安全級(jí)宿主中的異源表達(dá),如畢赤酵母(Pichiasp.)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、橋石芽孢桿菌(B.choshinensis)和乳酸乳球菌(L.lactis),取得突破性進(jìn)展。

2.2.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

Cao等[25]將來(lái)自Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因PalI構(gòu)建在畢赤酵母中,重組酶的酶活力為36.6 U/mL。羅科[26]將來(lái)源于紅色精朊桿菌的蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行突變獲得一個(gè)突變體PRSiQRY,將其構(gòu)建到pPICZA載體,表達(dá)載體pPicZa-PRSi-QRY轉(zhuǎn)入畢赤酵母X33獲得重組菌株,蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活力達(dá)到1 219 U/mL。宋蕾等[27]對(duì)Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因PalI進(jìn)行密碼子優(yōu)化,將優(yōu)化后的PalI成功在解脂耶氏酵母中異源表達(dá),酶活力達(dá)到916 U/mg。Zhang等[28]將P.dispersaUQ68J中編碼蔗糖異構(gòu)酶的基因構(gòu)建在解脂耶氏酵母中重組表達(dá),酶活力最高為7.43 U/mL,異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化效率高達(dá)97.8%。

2.2.2 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

Wu等[29]使用穿梭質(zhì)粒pHA01,將來(lái)自E.rhaponticiNX-5的蔗糖異構(gòu)酶首次在枯草芽孢桿菌WB800中過(guò)表達(dá),全細(xì)胞酶活力達(dá)到5.2 U/mL。王兵兵[30]將來(lái)源于Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因PalI構(gòu)建到pHT43質(zhì)粒上并于B.subtilisWB800中表達(dá),并通過(guò)定點(diǎn)誘變將459位Ser和452位Arg置換為Ala,導(dǎo)致50 ℃下蔗糖異構(gòu)酶的半衰期增加11倍,顯著提高了熱穩(wěn)定性,并略微改善了異麥芽酮糖的產(chǎn)物比。劉軍彤[21]將來(lái)源于P.dispersaUQ68J的蔗糖異構(gòu)酶基因成功在橋石芽孢桿菌中異源表達(dá),胞外蔗糖異構(gòu)酶酶活力達(dá)到138 U/mL。在此基礎(chǔ)上鄒亮[31]通過(guò)啟動(dòng)子優(yōu)化獲得最優(yōu)啟動(dòng)子Papr,其介導(dǎo)的重組菌BCpNapr-SI的胞外上清液酶活力最高,為85.1 U/mL。

2.2.3 乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶

Park等[32]首次報(bào)道了來(lái)自Enterobactersp.FMB-1的蔗糖異構(gòu)酶在乳酸乳球菌MG1363中的異源表達(dá),通過(guò)使用自誘導(dǎo)啟動(dòng)子(P170)和優(yōu)化的信號(hào)肽(SP310mut2),重組蔗糖異構(gòu)酶成功地在乳酸乳球菌胞外分泌表達(dá),異麥芽酮糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到72%。乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)已成為生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶的新興系統(tǒng),但其遺傳背景尚不清楚,需要進(jìn)一步探索。

2.3 利用食品安全菌株異源表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶存在的問(wèn)題

目前,各種來(lái)源的蔗糖異構(gòu)酶已成功在多種食品級(jí)安全菌株中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá),但工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)上仍存在一些影響因素:(1)游離的蔗糖異構(gòu)酶穩(wěn)定性差、易被降解和污染、重復(fù)使用率低、發(fā)酵培養(yǎng)基中成分復(fù)雜、背景蛋白多、分離純化繁瑣復(fù)雜,導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)成本增加,并且胞內(nèi)的蔗糖異構(gòu)酶需要離心破碎,步驟多,損耗大,因而后續(xù)可以研究蔗糖異構(gòu)酶的固定化;(2)現(xiàn)有的食品級(jí)重組菌株蔗糖異構(gòu)酶的表達(dá)水平依舊達(dá)不到工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的要求,導(dǎo)致大批量工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)格過(guò)高,因而構(gòu)建高效的食品級(jí)基因工程菌仍是蔗糖異構(gòu)酶大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵;(3)蔗糖異構(gòu)酶與蔗糖反應(yīng)生成異麥芽酮糖或海藻酮糖的同時(shí)還伴隨葡萄糖和果糖等副產(chǎn)物的生成,為了進(jìn)一步提高蔗糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化效率,需要分析關(guān)鍵區(qū)域?qū)φ崽钱悩?gòu)酶催化性能的影響,提高底物轉(zhuǎn)化的特異性,通過(guò)分子生物學(xué)方法改造蔗糖異構(gòu)酶編碼基因中的相關(guān)區(qū)域,提高其轉(zhuǎn)化效率。

3 提高食品安全菌中蔗糖異構(gòu)酶表達(dá)的優(yōu)化策略

由于利用食品級(jí)安全菌株工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)蔗糖異構(gòu)酶存在限制因素,因而提出多種優(yōu)化策略提高食品安全菌中蔗糖異構(gòu)酶的表達(dá)水平,如將游離酶固定化、優(yōu)化啟動(dòng)子和信號(hào)肽、優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。但由于食品級(jí)安全菌轉(zhuǎn)化效率低、篩選方法繁瑣、無(wú)法進(jìn)行簡(jiǎn)易的高通量篩選等因素,直接在食品級(jí)安全菌株中進(jìn)行的蔗糖異構(gòu)酶蛋白質(zhì)工程還未涉及。

3.1 蔗糖異構(gòu)酶在食品安全菌的固定化

近年來(lái),蛋白質(zhì)展示技術(shù)取得巨大進(jìn)展。Lee等[33]使用錨定蛋白的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定附著信號(hào)序列,將來(lái)自腸桿菌FMB-1的蔗糖異構(gòu)酶成功展示在釀酒酵母EBY100的細(xì)胞表面,與游離酶相比,釀酒酵母EBY100細(xì)胞表面的蔗糖異構(gòu)酶熱穩(wěn)定性顯著增強(qiáng);Li等[34]將P.dispersa的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因,以細(xì)胞壁蛋白Pir1為錨蛋白,成功地在解脂耶氏酵母細(xì)胞表面表達(dá),其異麥芽糖轉(zhuǎn)化率為93%,且重復(fù)使用12次后轉(zhuǎn)化效率仍能達(dá)到80%;吳琦等[35]將錨定蛋白Pir1與Klebsiellasp.LX3的蔗糖異構(gòu)酶編碼基因融合,在解脂耶氏酵母細(xì)胞表面展示,酶活力達(dá)到4 694.6 U/g細(xì)胞干重。固定在細(xì)胞表面的蔗糖異構(gòu)酶有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,其二糖產(chǎn)物與單糖副產(chǎn)物的比例可達(dá)到91∶9;Zhang等[36]使用枯草芽孢桿菌的孢子外膜蛋白CotX作為錨定蛋白將來(lái)自E.rhaponticiNX-5的蔗糖異構(gòu)酶顯示在B.subtilis168孢子上,被錨定的蔗糖異構(gòu)酶具有較高的生物活性和穩(wěn)定性,對(duì)從農(nóng)業(yè)殘留物中、未經(jīng)處理的甜菜糖蜜和大豆粉經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)異麥芽酮糖,轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%;Zheng等[37]利用糖基磷脂酰肌醇(GPI)-細(xì)胞壁蛋白(CWP)錨定信號(hào)序列構(gòu)建P.dispersa蔗糖異構(gòu)酶表面展示載體,并成功地在解脂耶氏酵母細(xì)胞表面展示,其酶活力達(dá)到2 910.3 U/g細(xì)胞干重。與游離的蔗糖異構(gòu)酶相比,該酶有較好的熱穩(wěn)定性,且以低成本的甘蔗糖蜜為底物時(shí),經(jīng)過(guò)9批加工后,異麥芽糖的轉(zhuǎn)化率仍保持在85%。

3.2 啟動(dòng)子和信號(hào)肽優(yōu)化

信號(hào)肽或啟動(dòng)子優(yōu)化是提高酶表達(dá)或分泌的常用方法。Guo等[38]采用半合理方法篩選出13個(gè)候選信號(hào)肽,比較其對(duì)KsLX3-SIase分泌的影響,結(jié)果表明,信號(hào)肽WapA最有效地引導(dǎo)KsLX3-SIase分泌到培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng)顯示其酶活力為23.0 U/mL;鄒亮[31]對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行優(yōu)化,考察了組成型啟動(dòng)子Papr、Pnpr、Pamy和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pxyl對(duì)蔗糖異構(gòu)酶在B.choshinensis的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子Papr調(diào)控的蔗糖異構(gòu)酶的胞外酶活力最高,達(dá)到85.1 U/mL;Zhang等[39]又利用強(qiáng)組成型TEF啟動(dòng)子,通過(guò)在解脂耶氏酵母中過(guò)度表達(dá)來(lái)自P.dispersionUQ68J的蔗糖異構(gòu)酶,獲得了高水平的分泌蔗糖異構(gòu)酶,其酶活力達(dá)到49.3 U/mL。

3.3 培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化

除啟動(dòng)子和信號(hào)肽優(yōu)化外,發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件的優(yōu)化也是提高酶活性或表達(dá)水平的常用策略。培養(yǎng)基優(yōu)化的重點(diǎn)是碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的組成和含量。劉軍彤[21]將改造過(guò)的蔗糖異構(gòu)酶克隆至宿主B.brevis中,并對(duì)該培養(yǎng)基氮源進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)?shù)礊?.5 g/L的多聚蛋白胨和8.5 g/L的牛肉浸膏時(shí),酶活力最高達(dá)138 U/mL,是優(yōu)化前TM培養(yǎng)基的2.7倍;張賀朋等[40]對(duì)培養(yǎng)基中的蔗糖含量進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)蔗糖含量為12%時(shí),發(fā)酵液中蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖的二糖產(chǎn)物與單糖副產(chǎn)物的比值達(dá)到92∶1;宋蕾等[27]對(duì)重組解脂耶氏酵母培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析,確定最優(yōu)條件為80 g/L果糖,2%含氮量的蛋白胨,0.5 mol/L NaCl,其酶活力達(dá)到251.96 U/mL,是優(yōu)化前的2.9倍。發(fā)酵條件如溶氧量、發(fā)酵溫度等也是影響蛋白表達(dá)以及催化產(chǎn)物組成的一大因素。劉軍彤[21]對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的攪拌速度進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí),蔗糖異構(gòu)酶的酶活力提高到190 U/mL;鄒亮[31]探究發(fā)酵溫度對(duì)重組菌B.choshinensis/pNCMO2-SI在3 L發(fā)酵罐中的菌體生長(zhǎng)濃度與酶活水平的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),30 ℃是最優(yōu)溫度,酶活力最高達(dá)到275 U/mL。

4 展望

目前,異麥芽酮糖作為一種安全的蔗糖替代品的市場(chǎng)需求迅速增長(zhǎng),蔗糖生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)異麥芽糖已取得重大進(jìn)展。然而,在工業(yè)生產(chǎn)中仍然存在一些問(wèn)題,如食品安全級(jí)菌株的分泌水平低、熱穩(wěn)定性弱、蔗糖異構(gòu)酶的應(yīng)用性能差。為了解決上述問(wèn)題,可以對(duì)表達(dá)宿主菌株和蔗糖異構(gòu)酶編碼基因分別進(jìn)行改造。在表達(dá)宿主菌株改造方面:(1)敲除宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白基因,防止外源蛋白被降解;(2)改造宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,提高外源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率;(3)對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行碳氮代謝調(diào)控優(yōu)化、基因組精簡(jiǎn)等新型策略;(4)提高基因轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定性。在蔗糖異構(gòu)酶編碼基因改造方面:(1)提高外源蛋白折疊效率;(2)利用蛋白質(zhì)工程,對(duì)蔗糖異構(gòu)酶進(jìn)行定向進(jìn)化或?qū)幋a基因如活性位點(diǎn)附近氨基酸殘基、底物結(jié)合相關(guān)氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變,提高蔗糖異構(gòu)酶的穩(wěn)定性、酶活力、特異性等;(3)蔗糖異構(gòu)酶的產(chǎn)物特異性不僅是保守序列RLDRD單獨(dú)決定的,還存在多個(gè)調(diào)控區(qū)域的協(xié)同作用[7],需要進(jìn)一步探索和修飾蔗糖異構(gòu)酶的關(guān)鍵位點(diǎn),提高蔗糖異構(gòu)酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用性能。