萇雨環(huán)，呂麗麗，李 曼，王夢格，張銘娟，葉國柳

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產科，安徽 蚌埠 233004）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMS）是一種多因素婦科疾病，其特征在于子宮腔外子宮內膜腺體和基質的生長，影響近10%～15%的育齡婦女，在不孕癥患者中，發(fā)病率約為40%～50%［1］。它是一種雌激素依賴性疾病，與慢性炎癥過程、慢性盆腔疼痛、痛經和不孕密切相關，極大地降低了育齡女性的生活質量［2］。子宮內膜異位癥與惡性腫瘤有很多相似之處，特別是它們的侵入性以及有著觸發(fā)其他組織重塑，血管形成和神經支配的能力［3］。炎癥是子宮內膜異位癥的重要病理生理機制［4］，有研究報道炎癥反應可通過促進炎性因子的釋放從而增加異位子宮內膜細胞的黏附與增殖特性［5］。因此深入探究該疾病炎癥方面的發(fā)病機制和治療靶點具有重要的臨床意義。

細胞焦亡（Pyroptosis）是一種伴隨炎癥反應的細胞程序性死亡［6］，是近年來炎癥研究方面的焦點。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號通路在細胞焦亡發(fā)生過程中發(fā)揮著關鍵作用，且細胞焦亡在不同的炎癥性疾病中扮演著不同的角色［7，8］?；谏鲜鲅芯勘尘埃緦嶒瀸⑻接懠毎雇鱿嚓P因子GSDMD，Caspase-1，NLRP3，IL-1β，IL-18 及PI3K/AKT 信號通路在炎癥性疾病子宮內膜異位癥中的表達及其相關性，從而進一步探究子宮內膜異位癥發(fā)病機制，并為臨床治療提供具體靶點和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

選取2022 年1 月～2023 年1 月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科行子宮內膜異位癥卵巢囊腫剝除術患者的異位囊腫組織50 例為子宮內膜異位癥組。另選取同期在該院行宮腔鏡手術患者的正常內膜組織55 例作為對照組，且術中排除子宮內膜異位癥患者。病例組年齡20～41 歲，平均年齡（37.6 ±5.7）歲，對照組年齡21～43 歲，平均年齡（38.3 ±7.8）歲。兩組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：（1）3 個月內未給予性激素藥物治療；（2）術中取得標本組織均經病理學檢查確診；（3）標本的收集均經患者及家屬同意。排除標準：（1）心、肝、腎等嚴重功能障礙者及患有其他嚴重婦科疾病者；（2）患惡性腫瘤，精神疾病者；（3）患免疫及內分泌系統(tǒng)疾病者。術中所取所有組織標本均儲存于-80 ℃冰箱以備研究使用。本研究符合人體實驗倫理標準并已通過蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院機構倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 提取及實時定量PCR 用TRIzol（天根，中國）試劑提取卵巢子宮內膜異位囊腫組織及對照組正常內膜組織的總RNA，經無核酸酶水洗之后，用Nanodrop ND-1000 分光光度計檢測其純度和濃度。根據(jù)逆轉錄和實時定量PCR 試劑盒（近岸，中國）說明書合成cDNA 模板，并進行熒光定量PCR 擴增反應。反應條件：95 ℃預熱1 min，95 ℃變性20 s 和60 ℃延伸1 min。所有樣品設置3 個副孔，使用2-△△CT法計算焦亡相 關因子，PI3K/AKT 信號通路在兩組研究對象中mRNA 表達的相對水平。焦亡相關因子及PI3K/AKT 通路的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物系列Tab 1 Primer series for qRT-PCR

1.2.2 蛋白質印跡法 配制RIPA 裂解緩沖液（碧云天），將50 mg 卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫組織或正常子宮內膜組織裝進500 μL RIPA 裂解液的勻漿管中，進行勻漿處理，4 ℃，12 000 ×g，離心20 min。將等量的變性蛋白通過SDS-PAGE 分離后轉移到PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h。隨即將PVDF 膜與一抗（多克隆抗-GSDMD；Caspase-1；NLRP3，1∶1 000 稀釋）在4 ℃冰箱中孵育過夜。用TBST 洗滌3 遍，再將膜與二抗（1∶1 000 稀釋）放至室溫2 h。再次洗滌三遍，根據(jù)BeyoECL 試劑盒（碧云天）說明書進行曝光顯影，最后結果用image J 軟件量化處理。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)處理，Graphpad Prism 9 軟件繪圖。用非配對t檢驗分析了細胞焦亡相關因子與PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常子宮內膜中的表達差異，并用Pearson 檢驗方法分析兩者在卵巢子宮內膜異位癥中相關性，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 焦亡相關因子及PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內膜異位癥中mRNA 水平顯著升高

采用RT-qPCR 方法比較焦亡因子GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 及信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常內膜中的表達。結果顯示，焦亡相關因子與信號通路PI3K/AKT 的表達在卵巢子宮內膜異位癥中顯著升高（P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 焦亡相關因子在卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常內膜中的mRNA 表達Fig 1 mRNA expression of pyroptosis-related factors in ectopic cysts of ovarian endometriosis versus normal endometrium

圖2 信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內膜異位癥中與正常內膜中的mRNA 表達Fig 2 mRNA expression of the signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis versus normal endometrium

2.2 焦亡相關因子及PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內膜異位癥中蛋白水平明顯升高

同時提取卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常內膜的蛋白，在Western Blot 實驗中驗證焦亡相關因子與PI3K/AKT 信號通路在兩組中的蛋白表達水平。結果顯示，焦亡相關因子及信號通路的蛋白表達水平在卵巢子宮內膜異位癥中明顯升高（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 焦亡相關因子在卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常內膜中蛋白水平的表達Fig 3 Expression of pyroptosis-related factors at the protein level in ovarian endometriosis ectopic cysts versus normal endometrium

圖4 信號通路PI3K/AKT 在卵巢子宮內膜異位癥異位囊腫與正常內膜中蛋白水平的表達Fig 4 Expression of the signaling pathway PI3K/AKT at the protein level in ectopic cysts of ovarian endometriosis compared with normal endometrium

2.3 在卵巢子宮內膜異位癥中焦亡相關因子與PI3K/AKT 的表達呈正相關

采用Pearson 相關性檢驗分析卵巢子宮內膜異位癥中焦亡相關因子和PI3K/AKT 信號通路mRNA 表達量的相關性。結果顯示焦亡相關因子與PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內膜異位癥中的表達水平呈正相關（P＜0.05）。見表2。

表2 卵巢子宮內膜異位癥細胞焦亡相關因子與信號通路PI3K/AKT 表達水平的相關性Tab 2 Correlation between pyroptosis-related factors and expression levels of signaling pathway PI3K/AKT in ovarian endometriosis cells

3 討論

子宮內膜異位癥（EMS）是一種常見的慢性炎癥性疾病，又被稱為“不死癌癥”。其復雜的癥狀給育齡女性的生理及心理均帶來了極大的痛苦。然而到目前為止，還沒有一種較完美的方法可以治療EMS?，F(xiàn)已推出的治療方法包括：（1）藥物療法；（2）保留子宮和卵巢的保守手術干預或切除子宮和卵巢的根治性手術干預；（3）期待療法［9］。但有研究表明無論方法如何，均有約50%的患者在5 年反復出現(xiàn)癥狀［1］。藥物只能用于治療已經有癥狀的患者，而手術不僅會影響卵巢卵泡的儲備功能，且復發(fā)率也高達50%［10］。目前對該疾病形成的因素，最合理的解釋是月經逆行假說，指含有可存活的細胞的子宮內膜異位癥碎片經輸卵管回流至骨盆，植入腹膜和腹部器官，并產生持續(xù)的炎癥與粘連。雖然此理論是被接受的，但無法解釋為什么90%的女性會出現(xiàn)月經逆行，但只有10% 的女性會發(fā)展為EMS［11］。因此解決子宮內膜異位癥這一難題，需以生理病理為基礎，充分了解子宮內膜異位癥的潛在分子發(fā)病機制，尋找新的治療靶點。

細胞焦亡是一種伴有炎癥因子產生和釋放的不同于細胞凋亡的一種特殊程序化細胞死亡，是近年來研究熱點。細胞焦亡信號通路包含依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（cystein-containing aspartat-specific protease-1，Caspase-1）的經典途徑和依賴Caspase-4/5/11 的非經典途徑［12］。在經典途徑中NOD 樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）與接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和效應蛋白Caspase-1（pro-Caspase-1）相互作用產生NLRP3 炎癥小體，在此過程中前體Caspase-1 被激活，活化的Caspase-1 不僅促進白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18 前體成熟激發(fā)炎癥反應，還切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）使其暴露具有打孔活性的N 端結構（GSDMD-N），GSDMD-N 在細胞膜上形成孔道，并釋放大量的IL-1β，IL-18 等炎癥物質引起炎癥級聯(lián)反應［13］。有研究報道，細胞焦亡的發(fā)生與經典PI3K/AKT 信號通路有關，且在不同的疾病中細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路發(fā)揮的作用不同［14，15］。最新一項研究表明，麥芽酚通過抑制PI3K/AKT 信號通路來阻斷NLRP3 炎癥小體形成，最終導致IL-1β，IL-18 等炎性因子減少從而達到抑制細胞焦亡來減輕椎間盤內炎癥的作用［14］。而另一項研究指出在BV2 小膠質細胞中紫杉葉素可以上調PI3K/AKT 信號通路來抑制細胞焦亡從而減輕脊髓損傷后的神經炎癥［8］。因此驗證以炎癥性疾病為特征的子宮內膜異位癥中細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路的作用。

近期研究顯示E3 泛素連接酶TRIM24 可負調控NLRP3/Caspase-1/IL-1β 介導的異位人子宮內膜間質細胞焦亡和遷移［16］。同時，Xu 等［17］的研究表明在原代子宮內膜基質細胞中，沉默長非編碼轉移相關肺腺癌轉錄本1（lnc-MALAT1）可改善NLRP3介導的焦亡和IL-1β 釋放，從而緩解TGF-β1 介導的纖維化。一致地，本研究檢測到焦亡相關因子GSDMD、Caspase-1、NLRP3、炎性因子IL-1β、IL-18 在卵巢子宮內膜異位癥囊腫組織中的表達均高于在正常子宮內膜中的表達，因此可以證實細胞焦亡這一炎癥反應參與子宮內膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展。在檢測焦亡相關因子的同時還檢測信號通路PI3K/AKT 的表達，實驗結果顯示PI3K/AKT 信號通路在卵巢子宮內膜異位癥囊腫組織中同樣較正常內膜組織高表達。PI3K/AKT 信號通路參與子宮內膜異位癥的發(fā)展早在之前的研究中被證實［18，19］。Takeuchi 等［20］近年來發(fā)現(xiàn)原始卵泡的過度激活會引起子宮內膜異位癥相關的卵巢儲備減少，并且這種激活是由PI3K-PTEN-AKT-Foxo3 途徑介導的。但至今還沒有研究關注細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路在子宮內膜異位癥中的關系。本研究采用Pearson 檢驗分析，得出結論卵巢子宮內膜異位癥囊腫組織中的焦亡相關因子mRNA 的表達水平分別與信號通路PI3K、AKT mRNA 表達水平呈正相關。在前人研究基礎上，結合本次研究推測細胞焦亡調控子宮內膜異位癥是通過激活PI3K/AKT 信號通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究首次在子宮內膜異位癥中將細胞焦亡與PI3K/AKT 信號通路聯(lián)系起來，有望進一步揭示子宮內膜異位癥的分子機制并為其提供新的治療靶點。本研究主要局限于組織學層面，因此驗證還不夠充分，后續(xù)還將從動物，細胞實驗多維度探索細胞焦亡經典/非經典途徑與PI3K/AKT信號通路在子宮內膜異位癥中的具體調控機制。

作者貢獻度說明：

萇雨環(huán)：課題的構思與實驗，撰寫文章；呂麗麗、李曼、王夢格、張銘娟：實驗數(shù)據(jù)整理，分析；葉國柳：論文指導與修改，經費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。