李 英，茅燕萍，王億平，張 磊

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN） 是最常見的一種成人腎病綜合征，病因不明的患者約為80%，為特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）或稱為原發(fā)性膜性腎?。≒MN），其余患者發(fā)病與藥物（如非甾體抗炎藥）或其他疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎或惡性腫瘤等）有關(guān)［1］，稱為繼發(fā)性膜性腎?。╯econdary membranous nephropathy，SMN）。西醫(yī)認(rèn)為MN 屬于自身免疫性疾病，其主要病理特征是上皮下免疫復(fù)合物的沉積，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管壁增厚并形成釘突；免疫復(fù)合物IgG 的沉積和由此引起的補(bǔ)體系統(tǒng)激活、膜攻擊復(fù)合物C5b-9 的產(chǎn)生，最終造成足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜的損傷和蛋白尿的形成［2］，此為MN 的重要發(fā)病機(jī)制。MN 主要臨床特征為不同程度的蛋白尿，其中約60%的患者表現(xiàn)為腎病綜合征；患者預(yù)后差異很大，約1/3 的患者經(jīng)歷自發(fā)緩解，1/3 的患者保持不同水平的蛋白尿，其余1/3 進(jìn)展為晚期腎衰竭［3］。在大多數(shù)情況下，MN 患者病程長，治愈相對困難，未緩解患者臨床表現(xiàn)為持續(xù)性的腎病綜合征，若得不到及時(shí)治療可引起血栓栓塞、心血管事件風(fēng)險(xiǎn)、腎功能衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后［3］，最終30%～40%的患者將在5～15 年內(nèi)出現(xiàn)腎衰竭，需要透析或腎移植［2］。

三七，具有散瘀止血、消腫定痛、補(bǔ)血益氣之效［4］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)三七化學(xué)成分種類豐富，具有止血、抗血栓、降血糖、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［5］，臨床應(yīng)用廣泛。曹恩澤教授系全國名中醫(yī)，從事中西醫(yī)結(jié)合治療各種腎臟病工作55 年余，經(jīng)驗(yàn)豐富，擅用三七來治療膜性腎病，常用劑量為3～4 g，研粉吞服，療效顯著。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討三七治療膜性腎病的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，并利用分子對接技術(shù)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為后續(xù)的研究提供理論參考。

1 方法

1.1 藥物有效活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫［6］，以“三七”為關(guān)鍵詞，以藥代動力學(xué)為原則，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug like，DL）≥0.18 為條件進(jìn)行初步篩選，以獲取三七的有效活性成分及其對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，并下載mol2 結(jié)構(gòu)文件（此為后續(xù)分子對接所用的小分子配體）；使用Uni-Prot 數(shù)據(jù)庫［7］，將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.2 MN 疾病基因篩選

在GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫［8］中 以“membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞，以獲取得到目前已知的與MN相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。利用Venny2.1 平臺，獲取三七治療MN 的潛在作用靶點(diǎn)，即獲取二者交集靶點(diǎn)。

1.3 核心靶點(diǎn)的篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將三七與MN 的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入至STRING 數(shù)據(jù)庫［9］，物種選擇為“Homo sapiens”，靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的置信度設(shè)置為最高“highest confidence（0.900）”，其余設(shè)置均為默認(rèn)，剔除未參與蛋白互作的靶點(diǎn)，獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并導(dǎo)入至Cytoscape3.9.1 軟件中，利用插件Centiscpae2.2 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以度值（degree）、接近中心性（closeness centrality）與節(jié)點(diǎn)中心性（betweenness centrality）三者為參數(shù)，以大于各自的閾值為篩選條件，取三者交集得到核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

打開David 數(shù)據(jù)庫［10］，物種選擇為人類，按“P＜0.01”設(shè)置閾值，對參與蛋白互作的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 信號通路富集分析。將分析后的數(shù)據(jù)信息按照P值大小排序，KEGG 信號通路篩選出前20 名導(dǎo)入微生信平臺繪制KEGG 富集氣泡圖；GO 分析中生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function， MF）三者各篩選出前10 名繪制GO 功能三合一柱狀圖。

1.5 分子對接

將篩選出的三七主要活性成分與主要核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。從pdb 數(shù)據(jù)庫［11］中下載靶點(diǎn)蛋白的pdb 結(jié)構(gòu)文件（即受體蛋白），利用PyMol 軟件進(jìn)行去水、去配體等處理后，利用AutoDock 軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等，輸出為pdbqt 格式文件；小分子配體（mol2 結(jié)構(gòu)文件）經(jīng)AutoDock 軟件處理后也輸出為pdbqt 格式文件。對受體蛋白與配體進(jìn)行分子對接操作并獲取二者的結(jié)合能，再利用PyMol軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 三七的有效活性成分

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對三七進(jìn)行檢索，得到有效成分119 個，只有8 個有效成分符合藥代動力學(xué)特征，其中7 個有效成分具有相對應(yīng)的靶點(diǎn)（表1），1 個有效成分無相關(guān)蛋白，予以刪除。檢索這7 個有效成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，得到253 個預(yù)測作用靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范基因名并去重后得到184 個藥物作用靶點(diǎn)。

表1 三七成分信息Tab 1 Component information of Panax notoginseng

2.2 三七治療MN 的潛在靶點(diǎn)

在Gene cards 數(shù)據(jù)庫中以“membranous nephropathy”為關(guān)鍵詞共檢索到3 670 個膜性腎病相關(guān)作用靶點(diǎn)，與三七的184 個有效成分作用靶點(diǎn)取交集，得到共同作用靶點(diǎn)127 個，并繪制韋恩圖（圖1）。

圖1 三七與MN 的共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig 1 Veen diagram of intersection target of Panax notoginseng and membranous nephropathy

2.3 核心靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫中，將獲取的PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系導(dǎo)入到Cytoscape 3.9.1 軟件中，經(jīng)Analyze Network 分析并通過可視化處理得到圖2，圖中氣泡越大、相關(guān)連接愈粗且愈多的節(jié)點(diǎn)表明其在該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)中也愈重要。篩選后得到轉(zhuǎn)錄因子Jun（JUN）、腫瘤抑制基因p53（TP53）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）等23 個核心靶點(diǎn)，其相關(guān)拓?fù)鋮?shù)見表2。

圖2 三七治療膜性腎病的交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network diagram of intersection target of Panax notoginseng in the treatment of membranous nephropathy

表2 核心靶點(diǎn)相關(guān)信息Tab 2 Related information of core targets

2.4 富集分析結(jié)果

GO 分析共得到804 個條目，其中BP 相關(guān)條目有703 個，主要體現(xiàn)在RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)及DNA 模板化、基因表達(dá)的正向調(diào)控和細(xì)胞的凋亡過程及正、負(fù)調(diào)節(jié)等；CC 相關(guān)條目55 個，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞外間隙等部位；MF 相關(guān)條目121 個，主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等。根據(jù)P值大小排序，分別篩選出前10 名，利用微生信平臺進(jìn)行可視化處理后得到如下分析圖（圖3）。

KEGG 分析共得到171 條通路及其有關(guān)信息，其中癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體活化、人巨細(xì)胞病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、乙型肝炎、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、IL-17 通路和TNF 通路等與膜性腎病相關(guān)性較強(qiáng)，可能作為三七治療膜性腎病的重要通路，根據(jù)P值大小和富集基因數(shù)目篩選出前20 條顯著通路，利用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖如下（圖4）。

圖4 KEGG 富集分析氣泡圖Fig 4 KEGG enrichment analysis bubble diagram

2.5 “有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用cytoscape3.9.1 軟件構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，三七具有多種有效活性成分，每種有效成分對應(yīng)多個靶點(diǎn)蛋白，每個靶點(diǎn)又可連接多種成分、參與多條信號通路，體現(xiàn)了三七所含的多種有效成分，通過多靶點(diǎn)多通路干預(yù)治療膜性腎病。圖中節(jié)點(diǎn)面積越大、連接越多表明其對膜性腎病的影響越大。

圖5 “三七有效成分-靶點(diǎn)-通路”圖Fig 5 ' Panax notoginseng active ingredient-target-pathway ' diagram

2.6 分子對接驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)“有效成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖和PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，分別選擇出五種最重要的活性成分與排名前五的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接并計(jì)算出結(jié)合能，具體結(jié)果如下表（表3）。結(jié)合能小于-1.2 kcal/mol（1 kcal=4.184 kJ）表明對接結(jié)果良好，結(jié)合能越低，表明二者結(jié)合越穩(wěn)定。部分結(jié)合能較高的分子對接可視化展示圖見圖6。

圖6 分子對接可視化展示圖Fig 6 Visual display of molecular docking

表3 分子對接結(jié)合能Tab 3 Molecular docking binding energy

3 討論

近年來，MN 的發(fā)生率呈顯著上升趨勢，且有超過IgA 腎病的趨勢，發(fā)病年齡上也逐漸年輕化［12］。改善全球腎臟疾病預(yù)后組織（KDIGO）提出，所有原發(fā)性膜性腎病和蛋白尿患者均應(yīng)接受最佳支持治療，對有進(jìn)行性腎損傷風(fēng)險(xiǎn)的患者應(yīng)進(jìn)行免疫抑制治療［13］。最常用的三種免疫抑制治療方案有激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺、利妥昔單抗或鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等［1］，但各自存在不良反應(yīng)多、停藥后易復(fù)發(fā)、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，治療存在一定的局限性。多項(xiàng)研究與名中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，中醫(yī)藥對本病的病因病機(jī)有獨(dú)到的認(rèn)識及不可替代的治療優(yōu)勢，中西醫(yī)結(jié)合治療本病具有更高的療效和安全性。

膜性腎病作為一病理形態(tài)學(xué)診斷名詞，中醫(yī)學(xué)并無特定關(guān)于此病的記載，由于患者臨床多表現(xiàn)為水腫、泡沫尿等，可將其歸屬為中醫(yī)“水腫”、“尿濁”、“虛勞”等范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便已認(rèn)識到其發(fā)病與肺、脾、腎相關(guān)［14］，如《素問·至真要大論》指出：“諸濕腫滿，皆屬于脾?！庇秩纭端貑枴に疅嵫ㄕ摗吩疲骸澳I者，胃之關(guān)也，關(guān)門不利，故聚水而從其類也。上下溢于皮膚，故為跗腫。跗腫者，聚水而生病也?！?“……故其本在腎，其末在肺，皆積水也。”《景岳全書》等也有相關(guān)論述。肺、脾、腎三臟虛損，臟氣不足，攝納無力，精微物質(zhì)外泄，即如巢元方《諸病源候論》所說：“勞傷腎虛，不能藏于精，故因小便而精微出也”，導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生。當(dāng)?shù)鞍茁┏鲞^多，且脾虛不能運(yùn)化水谷，導(dǎo)致精微物質(zhì)來源不足，則先后天均失養(yǎng)，久而形成虛勞。曹恩澤教授認(rèn)為，MN 患者普遍存在蛋白尿、低白蛋白血癥及高脂血癥，導(dǎo)致血液濃縮及高凝狀態(tài)，屬中醫(yī)“瘀血證”范疇，如《金匱要略·水氣病脈證并治》所論述“……經(jīng)為血，血不利則為水，名曰血分。”《血證論》亦曰：“瘀血化水，亦發(fā)水腫，是血病而兼水也?！币虼损鲅仁潜静〉牟±懋a(chǎn)物，又可成為新的致病因素，其貫穿病程始終，曹恩澤教授在治療MN 上多采用活血化瘀類中藥，并創(chuàng)立“活血通絡(luò)”為腎病辨治通用之法［15］，擅用三七消腫、活血兼補(bǔ)益之功，改善腎臟微循環(huán)、調(diào)整機(jī)體功能，益于膜性腎病的改善。

本研究通過構(gòu)建“化合物-疾病-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)全面分析藥物三七的有效成分并系統(tǒng)分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中關(guān)鍵化合物是槲皮素、人參皂苷Rh2、扁桃醇、豆甾醇等。槲皮素因其廣泛的藥理作用而廣泛應(yīng)用于各種疾病，包括抗腫瘤、抗炎、抗臟器纖維化、抗氧化應(yīng)激等作用，有動物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素能夠通過NF-κB 和IRF1 信號抑制M5 巨噬細(xì)胞極化，從而改善腎損傷，還可抑制M2 巨噬細(xì)胞極化，因此可用于防治腎損傷和纖維化［16］。豆甾醇能有效抑制炎癥模型中炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的水平，并且升高抗炎因子IL-10 水平具有良好的抗炎作用外，還具有抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性［17］，與KEGG 富集分析得到的多條通路和核心靶點(diǎn)存在重合。人參皂苷Rh2 除了通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，廣泛應(yīng)用于各種癌癥的治療外，還具有抗炎、抗過敏、增強(qiáng)免疫力、抗缺氧等多種藥理作用［18］，故臨床還可用于防治腎臟纖維化，改善MN 預(yù)后。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，JUN、TP53、RELA、AKT1、MAPK1 等可能在三七治療膜性腎病中起關(guān)鍵作用。Jun 轉(zhuǎn)錄因子家族屬于激活劑蛋白-1（activating protein-1，AP-1）成員之一，其涉及廣泛的生物活動，如細(xì)胞分化、存活、凋亡、增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遷移，是包括癌癥和炎癥在內(nèi)的各種疾病的主要靶標(biāo)［19，20］，在MN 中主要通過參與IL-17 和TNF 等通路及其進(jìn)一步激活的NF-κB 和MAPK 通路等，對抗免疫炎癥反應(yīng)、抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡從而保護(hù)腎臟。TP53 基因是編碼腫瘤蛋白p53 的抑癌基因，它的活化對細(xì)胞凋亡通路起著至關(guān)重要的控制作 用［21］，參 與 了KEGG 前20 條 通 路 中 的15 條 信 號通路，在MN 中也顯得尤為重要。AKT 家族在調(diào)節(jié)生長、增殖、存活、代謝和其他細(xì)胞活動中起關(guān)鍵作用［22］，哺乳動物三種亞型中以AKT1 為主，且被其證實(shí)在急性腎損傷（AKI）到慢性腎臟?。–KD）進(jìn)展過程中，它的激活對腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管去分化中起到關(guān)鍵作用［23］，另有動物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，增強(qiáng)線粒體功能可以防止腎臟的缺血再灌注損傷，腎小管線粒體AKT1 的激活對AKI 和隨后的CKD 發(fā)展具有保護(hù)作用［24］。另外還有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過靶向調(diào)控MAPK1 的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲［25］，還能能夠調(diào)節(jié)炎癥和細(xì)胞凋亡介質(zhì)的 合 成［26］。RELA 是NF-κB 信 號 通 路 中 的 關(guān) 鍵 效應(yīng)物，它也參與了前20 條通路中的15 條信號通路，在調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)中具有重要的作用［27］。

癌癥已成為中國最常見的疾病之一，在三七治療MN 可能的作用機(jī)制預(yù)測中，癌癥通路涉及到54個靶點(diǎn)，主要關(guān)乎細(xì)胞凋亡和自噬，通過調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵的凋亡信號通路和靶點(diǎn)，例如TNF 相關(guān)配體及其受體、NF-κB 通路、TP53 等，將改善腎臟的遠(yuǎn)期預(yù)后［28］。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）與AGE 受體RAGE 的結(jié)合，在腎組織中結(jié)合從而誘發(fā)各種病理變化，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥（涉及信號通路NF-κB，PI3K / Akt 和MAPK / ERK 的激活），導(dǎo)致進(jìn)行性腎臟疾病［29］，即使沒有糖尿病，在MN 患者中，由于氧化應(yīng)激和清除受損導(dǎo)致AGEs 的產(chǎn)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致血管損傷，加重病情［30］，通過干預(yù)此通路可有效延緩患者慢性腎臟病的進(jìn)展。IL-17 是由CD4+T 細(xì)胞分泌的致炎細(xì)胞因子，與機(jī)體內(nèi)多種炎癥性疾病密切相關(guān)。當(dāng)表達(dá)IL-17 的細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，IL-17 可刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 和IL-6，進(jìn)一步激活NF-κB 信號通路［31］，NF-κB 調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，這些基因在腎損傷期間的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［32］；TNF 通路中TNF-α 可誘導(dǎo)許多基因的激活，涉及到NF-κB 通路和MAPK 通路等，二者在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞自身免疫和炎癥功能方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，有激活炎癥和發(fā)生腎臟纖維化的危險(xiǎn)［33，34］。

分子對接結(jié)果顯示，三七主要活性成分甘草素、槲皮素、扁桃醇、豆甾醇、人參皂苷rh2 等與核心靶點(diǎn)對接所需的結(jié)合能均小于-1.2 kcal/mol，具有很好的結(jié)合活性，說明上述成分在治療MN 中可能起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)三七治療MN，通過多條通路、多個靶點(diǎn)起作用，其中癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、IL-17 通路和TNF 等通路中的蛋白和下游蛋白表達(dá)常常是其他通路的啟動因子或其他通路中的關(guān)鍵因子，故應(yīng)尤為重視。本研究揭示了三七通過多條通路、多個靶點(diǎn)綜合調(diào)控干預(yù)治療MN的可能的作用機(jī)制，且經(jīng)過分子對接技術(shù)得以初步驗(yàn)證，但仍需進(jìn)一步通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李英：搜集、統(tǒng)計(jì)并處理數(shù)據(jù)，制作圖表并撰寫論文；茅燕萍：論文審核指導(dǎo)并修改；王億平：提供設(shè)計(jì)思路；張磊：方法指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。