孫召朋，沈明月，唐昭娜，袁燦，王欣，彭秀娥，王翠，惠希武，劉伯寧，姚兵

1.石藥集團(tuán)巨石生物制藥有限公司，河北石家莊 050000；2.石藥集團(tuán)新型藥物制劑與輔料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050000

肝癌是一種常見的惡性腫瘤，乙型肝炎病毒感染是導(dǎo)致肝癌的一個(gè)重要因素，我國(guó)乙型肝炎病毒感染患者基數(shù)大，導(dǎo)致我國(guó)肝癌的發(fā)病率和死亡率形勢(shì)尤為嚴(yán)峻［1-3］。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican 3，GPC3）蛋白是硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）家族中的一員，是一類分布在細(xì)胞膜表面的蛋白聚糖，其通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨定在細(xì)胞外膜上［4］。GPC3蛋白在成人組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在肝癌組織中特異性高表達(dá)，可作為肝癌治療的靶點(diǎn)［5-6］。

抗體偶聯(lián)藥物（antibody-drug conjugate，ADC）兼具傳統(tǒng)小分子化療的殺傷效應(yīng)及抗體藥物的腫瘤靶向性［7-8］，在臨床應(yīng)用中體現(xiàn)了較好的安全性、有效性以及更寬的治療窗，成為腫瘤靶向治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要的發(fā)展方向［9-11］。定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)因其化學(xué)劑量比可控、同質(zhì)性更強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)得到了更大的發(fā)展［12-13］。

本研究通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備結(jié)合好、內(nèi)吞快的抗GPC3 單克隆抗體，并通過(guò)定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)將海兔毒素衍生物MMAE（monomethyl auristatin E）偶聯(lián)至抗體重鏈，獲得抗體藥物比（antibody drug ratio，DAR）為2的藥物分子，為GPC3免疫療法靶向?qū)嶓w瘤奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及質(zhì)粒 HEK293細(xì)胞購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司；CHO K1細(xì)胞購(gòu)自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0-Ag14、肝癌細(xì)胞Hep3b、HepG2 和pcDNA3.1 表達(dá)載體由石藥集團(tuán)巨石生物制藥有限公司保存；大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB／c 小鼠3 只，雌性，6 ～8 周齡，體質(zhì)量20 ～30 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-006。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，相關(guān)程序均根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)證協(xié)會(huì)（AAALAC）的指導(dǎo)。

1.3主要試劑及儀器 質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；LND1002 購(gòu)自聯(lián)寧（蘇州）生物制藥有限公司；mTgase 酶由石藥集團(tuán)巨石生物制藥有限公司生產(chǎn)，Luria-Bertani 培養(yǎng)基由該實(shí)驗(yàn)室配制；ProteinA 親和層析柱5 mL MabSelect Sure 購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare 公司；Ribi 免疫佐劑購(gòu)自美國(guó)Ribi Immnuochem Res-earch Inc；HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗人IgG、Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG均購(gòu)自北京Solarbio 科技有限公司；原研抗體GC33購(gòu)自瑞士Roche Holding AG 公司；重組人GPC3 抗原購(gòu)自中國(guó)ACRO Biosystems公司。

1.4抗原基因構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞系制備 從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取GPC3 的mRNA 序列（NM_004484.4）和氨基酸序列（NP_004475.1），將全長(zhǎng)GPC3基因克隆至pcDNA3.1 表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10 感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用無(wú)菌Luria-Bertani培養(yǎng)基，于37 ℃，220 r／min 培養(yǎng)16 ～24 h，離心收集菌體，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，測(cè)序無(wú)誤后分別電轉(zhuǎn)染HEK293和CHO K1 細(xì)胞，使用遺傳霉素硫酸鹽加壓篩選，獲得高表達(dá)GPC3的穩(wěn)定細(xì)胞系單克隆。HEK293-GPC3用于小鼠免疫，CHO K1-GPC3（4E1 克?。┯糜诤Y選檢測(cè)。DNA合成及測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.5動(dòng)物免疫 將1×107個(gè)HEK293-GPC3細(xì)胞與Ribi佐劑混勻并乳化，經(jīng)小鼠四肢內(nèi)側(cè)各皮下注射25μL，共100 μL，腹腔注射100 μL，共注射3 次，間隔7 d；第28 天經(jīng)尾靜脈采血；第28 和35 天各加強(qiáng)免疫1次：將5×106個(gè)HEK293-GPC3細(xì)胞與等體積PBS 混勻，經(jīng)小鼠四肢內(nèi)側(cè)各皮下注射25μL，共100μL，腹腔注射100 μL；第38 天無(wú)菌環(huán)境中取小鼠脾臟，分離淋巴細(xì)胞。

1.6雜交瘤細(xì)胞制備及篩選 將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0-Ag14 通過(guò)電融合方式進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞靜置10 min 后移入HAT 篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h；接種于96孔板，2×104個(gè)／孔，7 d后用Medium E 培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d后進(jìn)行檢測(cè)：用重組人GPC3抗原包被96孔板，1μg／孔，2 ℃孵育過(guò)夜；加入雜交瘤融合上清，100μL／孔，再加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶10 000 稀釋），通過(guò)ELISA 檢測(cè)挑選A450值高于2.0 的克隆孔進(jìn)行流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）篩選：將CHO K1-GPC3細(xì)胞加入96孔板，2×105個(gè)／孔，加入雜交瘤上清，50μL／孔，再加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶10 000 稀釋），通過(guò)流式細(xì)胞儀讀取熒光強(qiáng)度，挑取熒光強(qiáng)度最高的10 株進(jìn)行亞克隆，將亞克隆篩選到的陽(yáng)性克隆分別命名為4-22E10-G7、1-15C8-2H6、66B6-1A6、1E7-1D4、16C8-8E6，測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。將篩選到的5 個(gè)克隆可變區(qū)與人IgG1 恒定區(qū)構(gòu)建嵌合抗體，通過(guò)HEK293 瞬轉(zhuǎn)表達(dá)，利用ProteinA 親和層析柱純化抗體。

1.7嵌合抗體結(jié)合活性的檢測(cè)

1.7.1蛋白水平結(jié)合活性 采用ELISA法。用重組人GPC3抗原包被96孔板，1μg／孔，2 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗滌3次，加入10倍梯度稀釋的嵌合抗體，濃度分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001 和0.000 1 nmol／L，37 ℃孵育1 h；PBST 洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗人IgG（1∶10 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3次，避光條件下加入TMB 底物溶液顯色，避光孵育15 min；加入2 mol／L 硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值（A450）。試驗(yàn)重復(fù)2 次，計(jì)算平均值。

1.7.2細(xì)胞水平結(jié)合活性 采用FACS 法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高表達(dá)GPC3穩(wěn)轉(zhuǎn)株4E1克隆及GPC3抗原高表達(dá)肝癌細(xì)胞株Hep3b、HepG2 計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)／mL，接種于96孔板，100μL／孔，加入待測(cè)抗體，每個(gè)嵌合抗體設(shè)2個(gè)復(fù)孔，4 ℃孵育2 h；離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗人IgG（1∶10 000稀釋），4 ℃孵育1 h；離心，PBS洗滌3次，用100μL PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS讀數(shù)檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)2次，計(jì)算平均值。

1.8嵌合抗體內(nèi)吞的檢測(cè) 收集4E1細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基重懸，輕柔吹打至單細(xì)胞懸液，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)／mL，加入96孔板，100μL／孔，再加入待測(cè)抗體，每個(gè)嵌合抗體設(shè)2 個(gè)復(fù)孔，分別于4和37 ℃孵育3、6、24和48 h；離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌3 次，加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗人IgG（1∶10 000 稀釋），4 ℃孵育1 h；離心收集細(xì)胞，用PBS 洗滌3 次后，用100 μL PBS 重懸，F(xiàn)ACS 分別檢測(cè)4 與37 ℃細(xì)胞表面GPC3，并按下式計(jì)算內(nèi)吞率。

1.9ADC 的制備 將LND1002 25 μL／10 mg 抗體（LND1002 用DMSO 溶解為20 mmol／L）、10 × 反應(yīng)緩沖液、16C8-8E6 抗體、mTgase 酶、H2O 按順序用蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)入有彈性的乙烯-醋酸乙烯酯一次性反應(yīng)袋中，反應(yīng)袋密封混勻后置30 ～37 ℃反應(yīng)48 ～168 h。mTgase 酶可識(shí)別抗體重鏈第295 位谷氨酰胺作為反應(yīng)底物與LND1002 形成異肽鍵，反應(yīng)過(guò)程每24 h取樣，采用反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分析偶聯(lián)反應(yīng)修飾率，當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)修飾率達(dá)95%時(shí)，結(jié)束反應(yīng)，使用ProteinA 親和層析柱純化ADCs，采用RPHPLC 檢測(cè)DAR 值，尺寸排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）分析純度。

1.10ADC 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性影響的檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GPC3高表達(dá)的肝癌細(xì)胞Hep3b和HepG2經(jīng)胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度為1 × 105個(gè)／mL，加入96 孔黑色平底細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL／孔，再加入稀釋好的梯度濃度的供試品，20μL／孔，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育（66±3）h；加入刃天青鈉溶液（0.03%），20μL／孔，37 ℃作用3 ～4 h，酶標(biāo)儀550／610 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度值。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)無(wú)藥對(duì)照組和無(wú)細(xì)胞空白對(duì)照組，按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。利用Prism 或同類作圖軟件作圖，擬合出參考標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPadPrism 9 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，兩組間差異性比較采用Student's t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1嵌合抗體的結(jié)合活性

2.1.1蛋白水平結(jié)合活性 ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，4-22E10-G7、1-15C8-2H6、66B6-1A6、16C8-8E6 嵌合抗體及原研抗體GC33 的EC50分別為（2.12 ± 0.11）、（1.23±0.08）、（421±13）、（2.51±0.09）和（4.54±0.21）ng／mL，16C8-8E6嵌合抗體與原研抗體GC33的結(jié)合活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.08，P=0.10）。

2.1.2細(xì)胞水平結(jié)合活性 FACS檢測(cè)結(jié)果表明，16C8-8E6嵌合抗體對(duì)4E1、Hep3b、HepG2的結(jié)合能力明顯優(yōu)于其他嵌合抗體，且結(jié)合活性為原研抗體GC33的2 ～10 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為14.9、13.0 和12.9，P=0.025），見表1。

表1 不同克隆FACS親和力分析（熒光強(qiáng)度，±s，n=2）Tab.1 Affinity analysis of different clones by FACS（fluorescence intensity，±s，n=2）

表1 不同克隆FACS親和力分析（熒光強(qiáng)度，±s，n=2）Tab.1 Affinity analysis of different clones by FACS（fluorescence intensity，±s，n=2）

注：a表示與GC33抗體比較，P ＜0.05。

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2.2嵌合抗體的內(nèi)吞率 16C8-8E6 內(nèi)吞最快，3 h 內(nèi)吞率為45.6%，6 h 為54.2%，24 h 為68.9%，48 h 達(dá)73.9%；GC33 次之，各時(shí)間點(diǎn)其內(nèi)吞率均低于16C8-8E6，48 h內(nèi)吞率僅為66.2%；其他克隆內(nèi)吞較差，48 h內(nèi)吞率均低于60%。見圖1。因此選擇16C8-8E6（簡(jiǎn)稱8E6）制備ADC。

圖1 不同克隆的內(nèi)吞率Fig.1 Endocytosis rates of different clones

2.3ADC 結(jié)構(gòu)及表征 制備的ADC 結(jié)構(gòu)見圖2；修飾率達(dá)95%，見圖3；ADC 的DAR 值為2.04，見圖4；SEC-HPLC純度為98.2%，見圖5。

圖2 anti-GPC3-ADC結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic structure of anti-GPC3-ADC

圖3 RP-HPLC修飾率分析Fig.3 Analysis of modification rate by RP-HPLC

圖4 RP-HPLC DAR值分布分析Fig.4 Analysis of DAR value distribution by RP-HPLC

圖5 SEC-HPLC純度分析Fig.5 Purity analysis by SEC-HPLC

2.48E6 ADC 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響 8E6-ADC 和GC33-ADC 對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 和Hep3b 的增殖抑制作用均不明顯，可能由于這兩種細(xì)胞對(duì)MMAE不敏感。見圖6。

圖6 8E6-ADC 和GC33-ADC 對(duì)HepG2（A）和Hep3b（B）細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of 8E6-ADC and GC33-ADC on proliferation of HepG2（A）and Hep3b（B）cells

續(xù)圖6 8E6-ADC 和GC33-ADC 對(duì)HepG2（A）和Hep3b（B）細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.6（Continued）Inhibitory effects of 8E6-ADC and GC33-ADC on proliferation of HepG2（A）and Hep3b（B）cells

3 討論

GPC3 是一種癌胚抗原，核心蛋白由40 KD 的N-端和30 KD 的C-端兩部分組成，具有14 個(gè)半胱氨酸的保守序列，可在分子內(nèi)形成二硫鍵，GPC3 蛋白C-端近細(xì)胞膜的區(qū)域含有兩條硫酸類肝素（heparin sulfate，HS）聚糖鏈，正常組織中幾乎未見GPC3 表達(dá)，但在70%～80%的肝細(xì)胞癌中表達(dá)，GPC3 參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡?；贕PC3 結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，其被認(rèn)為是肝癌治療的理想靶點(diǎn)。目前全球有多個(gè)靶向GPC3的藥物處于臨床研究階段，藥物形式為單抗、雙抗、CAR-T療法，但尚無(wú)ADC藥物的開發(fā)。進(jìn)展最快的是羅氏公司旗下中外制藥株式會(huì)社開發(fā)的Codrituzumab 單抗，靶向GPC3 的C-端524 ～563位氨基酸之間肽段，主要通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytoto-xicity，ADCC）發(fā)揮抗腫瘤藥效，臨床前實(shí)驗(yàn)表明可抑制肝癌裸鼠種瘤的生長(zhǎng)，但Ⅱ期臨床結(jié)果顯示，GC33 與安慰劑相比，并未明顯提升晚期肝細(xì)胞癌患者的總生存率和無(wú)進(jìn)展生存期。ADC 藥物以抗體靶向作用和小分子殺傷作用在腫瘤治療中展現(xiàn)優(yōu)勢(shì)，因此開發(fā)以GPC3 為靶點(diǎn)的ADC 藥物可填補(bǔ)臨床治療的空白。

本研究通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得抗GPC3單抗16C8-8E6，試驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)合和內(nèi)吞率方面，16C8-8E6抗體優(yōu)于原研抗體GC33，提示16C8-8E6抗體的研究可為闡述抗GPC3 ADC 的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為肝細(xì)胞癌的治療提供新的方式。篩選獲得的單抗經(jīng)蛋白水平檢測(cè)（ELISA），均有較好的結(jié)合（如1-15C-2H6），但細(xì)胞水平檢測(cè)（FACS）卻很差，由于表達(dá)純化的蛋白與細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白在構(gòu)象上的差異，ADC 藥物是作用于患者腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞水平的結(jié)果更接近真實(shí)情況，因此選擇在細(xì)胞水平結(jié)合較好的16C8-8E6 作為后續(xù)ADC 制備的候選抗體。與目前上市藥物采用的化學(xué)偶聯(lián)方法不同，本研究采用位點(diǎn)特異性酶法偶聯(lián)MMAE，該方法能夠有效避免傳統(tǒng)化學(xué)偶聯(lián)帶來(lái)的小分子毒素結(jié)合位置和數(shù)量不可控、穩(wěn)定性低以及不均一等問題。

本研究構(gòu)建的靶向GPC3 的ADC 藥物16C8-8E6 ADC 對(duì)GPC3 陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Hep3b 和HepG2 抑制生長(zhǎng)效果不佳，可能是由于HepG2 和Hep3b 細(xì)胞對(duì)MMAE 不敏感所致。FU 等［14］的研究也支持了該結(jié)果，F(xiàn)U 團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)9 000 個(gè)化合物進(jìn)行篩選，顯示微管抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效果較差，DNA 抑制劑PBD有較好的殺傷效果［14］，但PBD毒性太強(qiáng)，考慮到該靶點(diǎn)是靶向肝癌細(xì)胞，可能會(huì)引起更嚴(yán)重的肝毒性［15-16］。因此，靶向GPC3 的抗體藥物可嘗試偶聯(lián)大分子蛋白毒素或小分子免疫激動(dòng)劑來(lái)平衡其藥效和安全性。本研究驗(yàn)證了ADC形式的藥物對(duì)肝細(xì)胞癌可起到殺傷作用，為以GPC3 為靶點(diǎn)的ADC 藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。