俞小娟，于傳飛，劉春雨，武剛，李萌，王文波，郭璐韻，付志浩，趙雪羽，王蘭

中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定及標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102629

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic Tlymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）和程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）均屬于目前研究較為成熟的免疫檢查點(diǎn)，也是抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)［1-2］。其中，PD-1 是存在于細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞表面的受體，在與腫瘤細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞中的PD-L1或PD-L2配體結(jié)合后，可誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的細(xì)胞耗竭，并引起Treg細(xì)胞增加，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的抑制［3］。CTLA-4 是Treg 細(xì)胞中組成性表達(dá)分子，可阻斷T 細(xì)胞中CD28 與抗原呈遞細(xì)胞CD80／CD86 受體的相互作用，降低后者的激活，從而抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖［4］。

抗PD-1 單抗的主要作用機(jī)制為與T 細(xì)胞表面的PD-1 相結(jié)合，以阻斷PD-1 與PD-L1 的相互作用，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)效應(yīng)型T細(xì)胞的抑制，激活T細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而抗CTLA-4單抗可解除CTLA-4 對(duì)T 細(xì)胞的抑制作用，上調(diào)T 細(xì)胞的活化增殖，從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)其抗腫瘤免疫反應(yīng)。在臨床使用中，PD-1單一抗體易產(chǎn)生耐藥性，為應(yīng)對(duì)該問(wèn)題，F(xiàn)DA 已經(jīng)批準(zhǔn)PD-1 與CTLA-4 單抗聯(lián)合應(yīng)用，但二者聯(lián)用時(shí)，會(huì)發(fā)生較高的免疫相關(guān)副作用，在臨床使用上受到限制［5］。因此，PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體的開(kāi)發(fā)成為全球藥企的選擇［6］，其具有單抗難以比擬的治療優(yōu)勢(shì)，但由于其分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制復(fù)雜，在前期研發(fā)或后期質(zhì)量控制方面均存在巨大挑戰(zhàn)。

為了對(duì)抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制，保證其安全、有效，并為后期其他雙特異性抗體的開(kāi)發(fā)和質(zhì)控提供指導(dǎo)，本研究結(jié)合該產(chǎn)品特點(diǎn)，采用國(guó)際先進(jìn)的分析手段，建立了重組人源化抗PD-1／CTLA-4雙特異抗體的質(zhì)控方法，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1供試品 重組人源化抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體（12.5 mg／mL）由本實(shí)驗(yàn)室留存，為抗PD-1的完整抗體C-端連接抗CTLA-4 的單鏈可變區(qū)片段（single chain antibody fragment，scFv）組合而成，可同時(shí)與細(xì)胞表面抗原PD-1及CTLA-4相互作用。

1.2細(xì)胞 Jurkat-CTLA-4-NFAT-luc（CTLA-4靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因測(cè)活效應(yīng)細(xì)胞）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；PD-1效應(yīng)細(xì)胞和PD-L1aAPC／CHPO-K1 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Promega公司；293T-CTLA4細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.3主要試劑及儀器 Bright-GloTMLuciferase Assay System 購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；hB7.1-hFc-Biotin 蛋白由中山康方生物醫(yī)藥有限公司提供；RPMI1640（Lglutamine and HEPES）培養(yǎng)基、Ham’s F-12培養(yǎng)基、Antibiotic G-418 Sulfate Solution、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶、丙酮酸鈉、MEM 非必須氨基酸、磷酸鹽緩沖液、BLasticidin、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；潮霉素B 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；牛血清白蛋白購(gòu)自德國(guó)VETEC 公司；FITC Streptavidin 購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；ATPlite試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；SDSMW 分析試劑盒（390953）、Beckman SDS-MW GelBuffer（A30341）、Beckman 毛細(xì)管（50 μm ID × 65 cm）、Beckman eCAP N-CHO 涂層毛細(xì)管、BeckmanPA800 plus毛細(xì)管電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；1%甲基纖維素溶液、pI marker 5.85 及9.22 自美國(guó)ProteinSimple 公司；Pharmalyte pH 3 ～10 和pH 5 ～8購(gòu)自美國(guó)GE 公司；2-AB 購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；流式細(xì)胞儀FACSCalibur購(gòu)自美國(guó)BD公司；Agilent TC C-18 色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；Acquity UPLC Glycan 300 A氨基柱（1.7μm，2.1 mm×150 mm）、XBridge BEH C18 XP（2.5μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱、WATERS 2695 HPLC 系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；TSK-G3000SWXL（5μm，300 ?，7.8mm ×300 mm）購(gòu)自東曹生物科技有限公司；10、30 kD 超濾管購(gòu)自德國(guó)Sartorius 公司；Spectra MaxGeminiXS 多功能酶標(biāo)儀及SoftMax 分析軟件購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices 公司；iCE280 成像毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦電泳系統(tǒng)購(gòu)自加拿大Protein simple公司。

1.4活性檢測(cè)

1.4.1細(xì)胞生物學(xué)活性（檢測(cè)PD-1靶點(diǎn)） 采用報(bào)告基因法。將PD-L1 aAPC／CHO-K1 細(xì)胞復(fù)蘇后，于Ham’s F-12 培養(yǎng)基（含10%FBS，200μg／mL Hygromycin B，250μg／mL Antibiotic G-418 Sulfate Solution）37 ℃，5%CO2培養(yǎng)；檢測(cè)前1天用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞密度至4×104個(gè)／孔，細(xì)胞活力不低于90%，鋪至96 孔板中，100μL／孔，培養(yǎng)過(guò)夜（貼壁時(shí)間要求≥8 h），檢測(cè)當(dāng)天，棄培養(yǎng)基待用。將PD-1／CTLA-4 單抗以2 000 nmol／L 的起始濃度進(jìn)行2.5 倍稀釋至3.28 nmol／L（8 個(gè)濃度）后，再進(jìn)行20 倍稀釋?zhuān)? 個(gè)濃度）至0.008 nmol／L，共10 個(gè)濃度梯度（2 000、800、320、128、51.20、20.48、8.19、3.28、0.16、0.008 nmol／L），加至96 孔板中，40 μL／孔，每個(gè)濃度設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。將PD-1 效應(yīng)細(xì)胞復(fù)蘇后，于RPMI1640 L-glutamine and HEPES 培養(yǎng)基（含10%FBS，200μg／mL Hygromycin B，500μg／mL Antibiotic G-418 Sulfate Solution，1mmol／L丙酮酸鈉，0.1 mmol／L MEM nonessential amino acids）37 ℃，5%CO2培養(yǎng)；于檢測(cè)當(dāng)天收獲細(xì)胞，用RPMI1640 L-glutamine and HEPES 培養(yǎng)基（含1%FBS）重懸，調(diào)整活細(xì)胞密度至5×104個(gè)／孔，加至96孔板中，40μL／孔，即每孔含80 μL 溶液，混勻，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育6 h；取出96孔板，平衡至室溫（22 ～25 ℃，5 ～10 min），加入Bright-Glo?，80μL／孔，室溫孵育20 min。上Perkin Elmer EnVision酶標(biāo)儀，檢測(cè)熒光素酶信號(hào)值（RLU）。獨(dú)立制備1 份樣品作為參比品，試驗(yàn)重復(fù)6 次。用SoftMax軟件對(duì)讀數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析。以抗PD-1／CTLA-4 單抗?jié)舛鹊膶?duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，RLU 值為縱坐標(biāo)，繪制四參數(shù)曲線(xiàn)。計(jì)算生物學(xué)活性的半數(shù)最大效應(yīng)濃度（concentration for 50%of maximal effect，EC50）及細(xì)胞生物學(xué)活性。該方法系統(tǒng)適用性要求為：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2≥0.90，平行復(fù)孔間RLU值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)≤30%。

1.4.2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性（檢測(cè)CTLA-4 靶點(diǎn)） 采用流式細(xì)胞熒光分選法。將293T-CTLA-4 細(xì)胞復(fù)蘇后于DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）37 ℃，5%CO2培養(yǎng)；檢測(cè)當(dāng)天用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，以（1.5 ～2）×105個(gè)／孔加至96孔板中，800×g離心，棄上清；將PD-1／CTLA-4單抗用1%BSA以200 nmol／L的起始濃度進(jìn)行1∶3稀釋?zhuān)?個(gè)濃度（200、66.66、22.22、7.4、2.46、0.82、0.28、0.10 nmol／L），加至96 孔板中，100μL／孔，混勻，冰上孵育30 min，即完成供試品與細(xì)胞的孵育過(guò)程；用1%BSA配制濃度為40 nmol／L 的hB7.1-hFc-Biotin 蛋白，加至96 孔板中，100μL／孔，混勻，冰上孵育60 min，即完成蛋白加入及孵育過(guò)程；5 ℃，1 000×g離心5 min，棄上清，加入1%BSA 溶液，100μL／孔，洗滌細(xì)胞，離心去上清，重復(fù)1次；加入FITC Streptavidin熒光二抗（1%BSA 1∶500稀釋?zhuān)?00μL／孔，混勻，冰上避光孵育40 min；低溫離心，棄上清，加入1% BSA 溶液，100μL／孔，洗滌細(xì)胞，離心去上清，重復(fù)1 次；加入1%BSA 重懸細(xì)胞，100μL／孔。上流式細(xì)胞儀FACSCalibur檢測(cè)。獨(dú)立制備1份樣品作為參比品，試驗(yàn)重復(fù)6次。將讀取的MFI值導(dǎo)入SoftMax軟件進(jìn)行分析。以抗PD-1／CTLA-4 單抗?jié)舛鹊膶?duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，MFI 值為縱坐標(biāo)，繪制四參數(shù)曲線(xiàn)。計(jì)算生物學(xué)活性的EC50及競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。該方法系統(tǒng)適用性要求為：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2≥0.950，平行復(fù)孔間RLU值的RSD應(yīng)≤30%。

1.5純度分析

1.5.1還原／非還原十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis-sodiumdodecylsulfonate，CE-SDS）法 將PD-1／CTLA-4 單抗用SDS-MW Sample Buffer稀釋成含蛋白約0.5（非還原CE-SDS）或1 mg／mL（還原CE-SDS）的溶液，均平行制備6份樣品，按20 ∶1的比例加入碘乙酰胺（非還原CE-SDS）或巰基乙醇（還原CE-SDS）溶液，混勻，70 ℃水浴孵育3 min；冷卻至室溫，10 000×g離心1 min；取上清，采用Beckman PA800 plus 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)上樣分析，其中非還原CE-SDS 采用10 kV 反相極性電動(dòng)進(jìn)樣40 s，還原CESDS 采用5 kV 反相極性電動(dòng)進(jìn)樣20 s，分離電壓15 kV，毛細(xì)管溫度25 ℃，樣品室溫度6 ℃，PDA 檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。試驗(yàn)重復(fù)6 次，還原CE-SDS計(jì)算輕鏈與重鏈峰面積之和百分比及RSD；非還原CE-SDS 計(jì)算主峰峰面積、片段及聚體峰峰面積百分比和RSD。該方法系統(tǒng)適用性要求為：電泳圖譜應(yīng)與提供的典型電泳圖譜一致，且供試品進(jìn)樣第1 針與最后1針主峰的遷移時(shí)間差＜1.0 min。

1.5.2分子排阻高效液相色譜（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SECHPLC）法 色譜柱：TSK-G3000SWXL（5 μm，300 ?，7.8 mm ×300 mm）；流動(dòng)相：25 mmol／L磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4-Na2HPO4），300 mmol／L 氯化鈉，pH 6.5；流速：0.8 mL／min；上樣量：8μL（12.5 mg／mL）；柱溫：室溫；樣品池溫度：4 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；檢測(cè)時(shí)間：20 min。采用WATERS 2695 HPLC系統(tǒng)工作站對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，面積歸一化法計(jì)算單體峰和聚體峰含量。試驗(yàn)重復(fù)6 次，分別計(jì)算單體峰及聚體峰峰面積百分比和RSD。該方法系統(tǒng)適用性要求為：每1針供試品的主峰理論塔板數(shù)應(yīng)≥2 000，主峰和聚體峰間的分離度應(yīng)≥1.5。

1.6電荷異質(zhì)性檢測(cè) 采用成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（imaging capillary isoelectric focusing electrophoresis，iCIEF）法。將樣品用超純水稀釋至5 mg／mL，取1 440μL超純水、875μL 1%甲基纖維素、50μL Pharmalytes 5 ～8、50 μL Pharmalytes 3 ～10、12.5 μL pI marker 5.85 及12.5 μL pI marker 9.22 配置預(yù)混液，取5μL樣品與195μL預(yù)混液混合上樣進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)6次，分別計(jì)算A、B、C、D組峰的峰面積百分比和RSD。分析條件：預(yù)聚焦電壓1.5 kV，持續(xù)1 min；聚焦電壓3 kV，持續(xù)9 min。該方法系統(tǒng)適用性要求為所有供試品特征峰的pI 值與第1 針供試品特征峰pI值相差范圍在±0.10之間。

1.7鑒別試驗(yàn) 采用肽圖進(jìn)行鑒別分析。用Trypsin酶解緩沖液將樣品稀釋至2 mg／mL，取稀釋后樣品50μL，加入6μL 1%Rapigest 和6μL 50 mmol／L TCEP 溶液，60 ℃還原反應(yīng)30 min；向還原后樣品中加入4 μL 100 mmol／L 碘乙酰胺溶液，室溫避光反應(yīng)30 min；加入20 μL 0.1 μg／μL Trypsin 溶液，37 ℃水浴中酶切20 h；酶切后加入含10% TFA 的乙腈溶液4μL，37 ℃反應(yīng)1 h；10 000×g離心3 min；取上清，用超高效液相色譜系統(tǒng)、紫外檢測(cè)器、Waters XBridge BEH C18 XP（2.5μm，2.1 mm ×150 mm）色譜柱進(jìn)行樣品分離，在214 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)。液相色譜條件：流動(dòng)相A 為0.1%三氟乙酸-水溶液；流動(dòng)相B 為0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；采用梯度洗脫（0 ～105 min，流動(dòng)相B 從2%升至100%；106 ～120 min，流動(dòng)相B 從100%降低至2%）；流速為0.2 mL／min；上樣量為10 μL；樣品室溫度為5 ℃；柱溫為40 ℃。制備2 份樣品，分別命名為樣品1 和2。該方法系統(tǒng)適用性要求為：供試品特征峰的相對(duì)保留時(shí)間在固定范圍內(nèi)（以保留時(shí)間79.7 min處的峰為參考峰）。

1.8含唾液酸糖型組分含量的分析 采用超高效液相色譜法。將樣品用50 mmol／L 碳酸氫銨溶液稀釋至2 mg／mL，按25 ∶1 的比例加入PNGase F，37 ℃水浴中酶切反應(yīng)20 h；加入3 倍體積的-20 ℃預(yù)冷乙醇，-20 ℃冰箱放置1 h；10 000×g離心10 min；取上清，用真空干燥離心機(jī)干燥樣品后，加入2-AB熒光標(biāo)記試劑，65 ℃反應(yīng)3 h。用Waters H-Class 超高效液相色譜儀、熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析。試驗(yàn)重復(fù)6次。檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)：330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：420 nm；色譜條件：流動(dòng)相A 為50 mmol／L 甲酸銨，pH 4.5；流動(dòng)相B 為乙腈；色譜柱：Acquity UPLC Glycan（300 A，1.7 μm，2.1 mm × 150 mm）；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃；樣品盤(pán)溫度：10 ℃。采用面積歸一化計(jì)算含唾液酸糖型的含量。該方法系統(tǒng)適用性要求為：供試品圖譜和提供的參考品圖譜一致。

1.9數(shù)據(jù)采集及分析 細(xì)胞生物學(xué)活性使用Perkin Elmer EnVision 酶標(biāo)儀系統(tǒng)自帶軟件采集數(shù)據(jù)，Soft-Max Pro 5.4.1 軟件處理數(shù)據(jù)；競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性使用BD CellQuest Pro軟件采集數(shù)據(jù)，SoftMax Pro 5.4.1軟件處理數(shù)據(jù)；還原／非還原CE-SDS、iCIEF均采用32 Karat?軟件采集及分析數(shù)據(jù)；SEC-HPLC、肽圖及含唾液酸糖型組分含量的分析均采用EmpowerTM3 軟件采集及處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞生物學(xué)活性（PD-1 靶點(diǎn)） 6 次檢測(cè)的EC50為（6.91±0.78）nmol／L，RSD為11.29%；相對(duì)參比品的生物學(xué)效價(jià)為（103.50±13.08）%，RSD為12.64%。見(jiàn)圖1。

2.2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性（CTLA-4 靶點(diǎn)） 6次檢測(cè)的EC50為（0.35±0.28）nmol／L，RSD為10.42%；相對(duì)參比品的生物學(xué)效價(jià)為（99.30±9.15）%，RSD為8.32%。見(jiàn)圖2。

圖2 抗PD-1／CTLA-4雙特異性抗體的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性效應(yīng)曲線(xiàn)Fig.2 Competitive binding activity effect curve of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

2.3純度

2.3.1還原／非還原型CE-SDS 還原CE-SDS典型圖譜見(jiàn)圖3，輕鏈與重鏈峰面積之和百分比為（98.86±0.02）%，RSD為0.02%。非還原CE-SDS 典型圖譜見(jiàn)圖4，主峰峰面積百分比為（93.07±0.13）%，RSD為0.14%；片段百分比為（4.44 ± 0.13）%，RSD為2.93%，聚體峰面積百分比為（2.49 ± 0.15）%，RSD為0.21%。

圖3 抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體的還原CE-SDS 典型圖譜Fig.3 Reducing CE-SDS typical chromatogram of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

圖4 抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體的非還原CE-SDS典型圖譜Fig.4 Non-reducing CE-SDS typical chromatogram of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

2.3.2SEC-HPLC 結(jié)果顯示，單體的峰面積百分比為（97.20 ± 0.01）%，RSD為0.01%；聚體峰面積百分比為（2.68±0.01）%，RSD為0.37%。見(jiàn)圖5。

圖5 抗PD-1／CTLA-4雙特異性抗體的SEC-HPLC 典型圖譜Fig.5 SEC-HPLC typical chromatogram of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

2.4電荷異質(zhì)性 結(jié)果顯示，圖中A組峰面積百分比為（38.43±0.54）%，RSD為0.1.41%；B 組峰面積百分比為（43.26±0.32）%，RSD為0.74%；C 組峰面積百分比為（11.31±0.14）%，RSD為1.24%；D 組峰面積百分比為（7.00±0.17）%，RSD為2.43%。見(jiàn)圖6。

圖6 抗PD-1／CTLA-4雙特異性抗體的iCIEF典型圖譜Fig.6 iCIEF typical chromatogram of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

2.5肽圖樣品1和2各特征峰與參比標(biāo)準(zhǔn)品圖譜初步觀(guān)察具有可比性，見(jiàn)圖7。

圖7 抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體的肽圖典型圖譜Fig.7 Typical peptide map of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

2.6糖型分析 糖基化分析的典型圖譜見(jiàn)圖8，糖型命名見(jiàn)圖譜。其中，占比最高的糖型為G0F，含量為（41.06 ± 0.11）%，RSD為0.27%。含唾液酸的糖型共3 種，分別為G2F+G1F-NANA、G2F-NANA 和G2F-2NANA，G2F+G1F-NANA 含量為（12.44 ± 0.12）%，RSD為0.96%；G2F-NANA 含量為（12.00±0.05）%，RSD為0.42%；G2F-2NANA 含量為（5.37±0.05）%，RSD為0.93%；含唾液酸糖型的總體含量為（29.80±0.20）%，RSD為0.67%。

圖8 抗PD-1／CTLA-4雙特異性抗體的糖型典型圖譜Fig.8 Glycosylation typical chromatogram of anti-PD-1／CTLA-4 bispecific antibody

3 討論

隨著研究的不斷深入，抗體的靶點(diǎn)從傳統(tǒng)的單一靶點(diǎn)逐漸向多樣化、復(fù)雜化過(guò)渡，抗體偶聯(lián)藥物、雙特異性抗體，甚至四特異性抗體逐漸從研發(fā)走向上市。其中，雙特異性抗體呈爆炸式增長(zhǎng)。目前我國(guó)藥企參與或在國(guó)內(nèi)申報(bào)的雙特異抗體已達(dá)100 多個(gè)。從2015年友芝友實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司申報(bào)第1款HER2／CD3雙特異抗體，至2020年安進(jìn)公司的貝林妥歐的獲批［7-8］，均極大促進(jìn)了雙特異抗體的發(fā)展。靶點(diǎn)方面，已經(jīng)申報(bào)臨床的抗體多集中在CD19、CD20、BCMA、HER2、TIGIT、EGFR、TGF-β、4-1BB、Claudin18.2和CD47等靶點(diǎn)。在國(guó)內(nèi)，除了中山康方生物醫(yī)藥有限公司的卡度尼利（AK104）外［9］，還有多款單抗申報(bào)臨床。

活性是單抗的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，阿斯利康的MEDI5752 是國(guó)際上最早進(jìn)入臨床的PD-1／CTLA-4單抗［10］，最近報(bào)道的該單抗生物學(xué)活性測(cè)定方法為雙靶點(diǎn)報(bào)告基因測(cè)定活性方法［11］。該方法構(gòu)建2 個(gè)工程細(xì)胞系：CHO／CD80／PD-L1 和Jurkat／CTLA-4／PD-1／IL2-Luc，將細(xì)胞與梯度稀釋的抗體孵育后，抗體在Jurkat／CTLA-4／PD／1／IL2-Luc細(xì)胞上與各自抗原靶點(diǎn)（CTLA-4／PD-1）結(jié)合，導(dǎo)致熒光素酶蛋白濃度依賴(lài)性表達(dá)，通過(guò)RLU 值反映抗體生物學(xué)活性。本研究結(jié)合該單抗的結(jié)構(gòu)特征，即與CTLA-4抗原呈弱結(jié)合狀態(tài)，并參考PD-1［12-13］和CTLA-4［14-15］單抗的活性測(cè)定方法，開(kāi)發(fā)了報(bào)告基因法用于測(cè)定PD-1 靶點(diǎn)的細(xì)胞生物學(xué)活性。原理如下：PD-1 effector 細(xì)胞表達(dá)的PD-1 分子結(jié)合于PD-L1 aAPC／CHO-K1 細(xì)胞表面的PD-L1 分子會(huì)抑制TCR 信號(hào)通路從而抑制螢光素酶蛋白的表達(dá)。加入抗PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體阻斷PD-1 與PD-L1 結(jié)合并重新釋放TCR 信號(hào)通路激活螢光素酶蛋白的表達(dá)，因此螢光素酶蛋白的表達(dá)水平與PD-1抗體呈濃度梯度依賴(lài)關(guān)系，加入螢光素酶底物試劑后產(chǎn)生生物化學(xué)發(fā)光信號(hào)，見(jiàn)圖9。流式細(xì)胞熒光分選法用于測(cè)定CTLA-4靶點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，原理如下：使用的293TCTLA-4 細(xì)胞表面含有CTLA-4 分子，通過(guò)在板中加入293T-CTLA-4細(xì)胞，再加入抗CTLA-4抗體與hB7.1-hFc-Biotin配體蛋白，使二者競(jìng)爭(zhēng)與細(xì)胞表面的CTLA-4結(jié)合。孵育洗滌后，加入FITC Streptavidin 熒光二抗，使其與hB7.1-hFc-Biotin配體蛋白結(jié)合，在激光激發(fā)后，熒光素產(chǎn)生熒光，見(jiàn)圖10。因此熒光強(qiáng)度與hB7.1-hFc-Biotin 配體蛋白的結(jié)合量呈正相關(guān)，與抗CTLA-4抗體的結(jié)合量呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)以上2種方法對(duì)抗PD-1／CTLA-4 單抗的活性進(jìn)行有效控制。采用還原／非還原CE-SDS配合SEC-HPLC［16］的方法進(jìn)行單抗純度的控制，相比于SDS-PAGE，CE-SDS 具有高分辨率、高自動(dòng)化和高重復(fù)性的特點(diǎn)，近年來(lái)得到了廣泛應(yīng)用［17］。由于IEC-HPLC法分離度有限，無(wú)法將組成復(fù)雜的雙特異性抗體各電荷異質(zhì)體完全分開(kāi)，并且不易于平臺(tái)化，因此，針對(duì)該單抗的特點(diǎn)，本研究建立了iCIEF 法用于測(cè)定電荷的異質(zhì)性。本研究建立了肽圖的方法，使用Trypsin 酶解之后，通過(guò)UPLC法對(duì)抗PD-1／CTLA-4的雙抗進(jìn)行分子水平鑒別。該雙特異性抗體的N-糖糖型中含有唾液酸，而唾液酸是引起抗體電荷異質(zhì)性的重要原因，且各電荷異質(zhì)體在糖型上主要差異在于唾液酸的比例，因此，本研究建立了HPLC法用于分析抗PD-1／CTLA-4單抗的糖基化，對(duì)含唾液酸糖型的總量進(jìn)行控制［18］。

圖9 細(xì)胞學(xué)活性（PD-1靶點(diǎn)）原理圖Fig.9 Schematic diagram of biological activity（PD-1 target）

圖10 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性（CTLA-4靶點(diǎn)）原理圖Fig.10 Schematic diagram of competitive binding activity（CTLA-4 target）

此外，本研究使用Fortebio 分子相互作用的方法分別測(cè)定了PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體與CD16a和C1q 的親和能力，結(jié)果表明，該雙特異性抗體與兩種受體均無(wú)結(jié)合。同時(shí)，在膜表達(dá)PD-1的293T-PD1細(xì)胞系和膜表達(dá)CTLA-4 的293T-CTLA4 細(xì)胞系進(jìn)一步驗(yàn)證了PD-1／CTLA-4 雙特異性抗體的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）活性和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒（complement dependent cytotoxicity，CDC）活性，結(jié)果表明均無(wú)活性，即該雙特異性抗體引起ADCC 或CDC 效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)極低。

本研究專(zhuān)門(mén)針對(duì)雙特異抗體的質(zhì)量控制開(kāi)展研究，依據(jù)ICHQ6B 指導(dǎo)原則［19］，針對(duì)此類(lèi)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性建立了基于不同原理的質(zhì)量控制方法，以保證該產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，對(duì)于我國(guó)雙特異性抗體的早期研發(fā)和申報(bào)上市均具有重大意義。