文 柏金霞* 張彩雯 王蕓芳 陳莉 宋燕華 .浙江索契壹營(yíng)養(yǎng)科技有限公司；.浙江省疾病預(yù)防控制中心

本文目的為探討復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠免疫力功能的影響。參照《保健食品檢驗(yàn)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》的方法，設(shè)置空白對(duì)照組（去離子水），持續(xù)30d，分別用0.5、1.0、3.0g/kg體重3個(gè)劑量的濃縮乳清蛋白粉對(duì)小白鼠進(jìn)行連續(xù)灌胃。對(duì)小鼠進(jìn)行細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能試驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測(cè)定。結(jié)果顯示，各劑量組對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)、臟器/體重比值、ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力、血清溶血素水平、抗體生成細(xì)胞數(shù)、NK細(xì)胞活性均無(wú)顯著性影響。足跖增厚實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量組小鼠足跖厚度差值較陰性對(duì)照組增高（P<0.05）。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，高劑量組的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)較陰性對(duì)照組顯著增加（P<0.05）；中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率比陰性對(duì)照組有升高（P<0.05）。復(fù)方濃縮乳清蛋白供試樣品對(duì)細(xì)胞免疫功能以及單核巨噬細(xì)胞功能均具有顯著的提升作用，研究表明復(fù)方濃縮乳清蛋白粉具有提高小鼠免疫力的作用。

先天性免疫與后天性免疫的共同作用，形成宿主免疫功能。前者對(duì)病原體反應(yīng)迅速且非特異性，而后者反應(yīng)較慢但特異性強(qiáng)，產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫記憶。人體通過(guò)免疫系統(tǒng)的作用進(jìn)行防御。當(dāng)免疫力下降時(shí)，機(jī)體的反應(yīng)能力下降，不能快速的發(fā)現(xiàn)、排除、消除“異己”，從而引發(fā)疾病。機(jī)體免疫功能會(huì)隨著環(huán)境的變化而改變，并且免疫力低下的人群也在逐年增加。

乳清蛋白目前可通過(guò)現(xiàn)代化技術(shù)從牛奶中獲得，其氨基酸比例較完美，且易被消化和吸收。不僅如此，它還能在消化過(guò)程中生成多種肽類物質(zhì)，具有生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，它能幫助人體生長(zhǎng)發(fā)育，還具有提高免疫力、緩解疲勞等功能。乳清蛋白還富含免疫球蛋白、乳鐵蛋白（LF）。免疫球蛋白也是母乳中常見(jiàn)的免疫成分之一，目前，僅有IgG形式能通過(guò)胎盤(pán)，是幫助新生兒對(duì)抗外界病毒、細(xì)菌入侵的主要活性物質(zhì)。LF是參與血清鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的鐵結(jié)合蛋白，約占全部蛋白質(zhì)的1/5，是母乳中重要的乳清蛋白成分。LF在人和牛乳中均可發(fā)現(xiàn)，主要由中性粒細(xì)胞和幾種粘膜細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并有防御病毒侵染的作用。

唾液酸自身的衍生物高達(dá)50多種，N-乙酰神經(jīng)氨酸是其中最重要的一種，是大部分高等脊椎動(dòng)物組織存在的形式，因此，它被廣泛認(rèn)為是唾液酸的主要成分。N-乙酰神經(jīng)氨酸的運(yùn)用非常廣泛，在食品領(lǐng)域中可作為提高記憶力和智力、預(yù)防阿茲海默癥、維持腸道的健康、提升機(jī)體免疫能力等功效的原料。

基于上述考慮，參照評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的試驗(yàn)要求，本研究以濃縮乳清蛋白粉、N-乙酰神經(jīng)氨酸、低聚半乳糖為原料制備的復(fù)方濃縮乳清蛋白粉為對(duì)象對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫力功能影響的研究，為其在免疫力功能相關(guān)產(chǎn)品的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

復(fù)方濃縮乳清蛋白粉由本公司自主研發(fā)，主要活性成分為N-乙酰神經(jīng)氨酸、免疫球蛋白IgG、LF（來(lái)自于濃縮乳清蛋白粉）。復(fù)方濃縮乳清蛋白粉的人群推薦量如下：8-20kg幼兒及兒童為2g/d，20-40kg兒童及青少年為4g/d，40kg以上青少年及成人為6g/d。本實(shí)驗(yàn)采用最低人推薦服用量0.1g/kg/d進(jìn)行劑量設(shè)置。試驗(yàn)前將樣品溶于去離子水，并配制成不同濃度的溶液，在混合均勻后使用。

1.2 動(dòng)物篩選和檢驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(浙）2013-0190。上海喜普-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供ICR小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬）2013-0016，SPF級(jí)，均為雌性，小鼠體重18-22g。飼料來(lái)源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，符合《浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。小鼠試驗(yàn)環(huán)境為屏障環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境控制在20-24℃的恒定溫度和40-70%的恒定相對(duì)濕度，動(dòng)物需提前4天適應(yīng)。

1.3 劑量設(shè)計(jì)

低劑量組：0.5g/kg的標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的5倍；中劑量組：1.0g/kg標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的10倍；高劑量組：3.0g/kg標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)小鼠，是人體推薦量的30倍。各劑量組分別稱取待試產(chǎn)品2.5g、5.0g和15.0g，加入去離子水配制成濃度為0.05、0.10和0.30g/mL的三種溶液，作為試樣從口灌入小鼠胃中，灌入胃的量按0.1mL/10g計(jì)算。

1.4 主要儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡；CO2培養(yǎng)箱；721分光光度計(jì)；酶標(biāo)儀；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液；小牛血清；Hank’s液；YAC-1細(xì)胞；碳酸鈉；氯化鈉；印度墨汁；去離子水。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

臟器/體重值的測(cè)試方法：受試樣品灌入各組小鼠胃中，每天一次，持續(xù)30d后處死小鼠，從中取出胸腺和脾臟，并進(jìn)行稱重，確定胸腺與體重的比值以及脾臟與體重的比值。

其他免疫指標(biāo)測(cè)定：按照評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：采用MTT法進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、采用足跖增厚法進(jìn)行綿羊紅細(xì)胞（SRBC）誘導(dǎo)小鼠DTH實(shí)驗(yàn)、采用血凝法進(jìn)行小鼠血清溶血素測(cè)定、采用Jerne改良玻片法進(jìn)行抗體生成細(xì)胞測(cè)定、采用半體內(nèi)法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、采用LDH測(cè)定法進(jìn)行NK細(xì)胞活性測(cè)定。

1.6 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.結(jié)果

2.1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠體重的影響

結(jié)果顯示，各劑量組小鼠體重在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中與陰性對(duì)照組對(duì)比均無(wú)顯著差異（方差分析，P>0.05）。表明不同劑量的樣品對(duì)小鼠體重?zé)o影響。

2.2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠臟器與體重比值的影響

結(jié)果顯示，各劑量組小鼠胸腺與體重的比值以及脾臟與體重的比值均與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異（方差分析，P>0.05）。表明各濃度樣品不改變小鼠的免疫器官體重比值。

2.3 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

由實(shí)驗(yàn)可知，各劑量組小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力光密度差值較陰性對(duì)照組相比均無(wú)顯著性（方差分析，P>0.05）。但中、高劑量組小鼠左后足跖部厚度較陰性對(duì)照組顯著增加（q檢驗(yàn)，P<0.05）。

表1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S）

表1 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH的影響（±S）

注：q檢驗(yàn)：與陰性對(duì)照（去離子水）比較，＊.P<0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 光密度差值 左后足跖部厚度差（mm）24小時(shí)陰性對(duì)照 10 0.475±0.041 0.32±0.10低劑量組 10 0.453±0.067 0.39±0.09中劑量組 10 0.451±0.081 0.46±0.17＊高劑量組 10 0.494±0.069 0.51±0.15＊P值 0.428 0.015

2.4 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

由實(shí)驗(yàn)可知，與陰性對(duì)照組比較，各劑量組小鼠溶血素抗體積數(shù)值、溶血空斑數(shù)均無(wú)顯著性（方差分析或秩和檢驗(yàn)，P>0.05）。

2.5 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠單核－巨噬細(xì)胞功能的影響

為符合方差齊性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2對(duì)吞噬百分率的結(jié)果進(jìn)行變換。由試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，與陰性對(duì)照組比較，在半體內(nèi)法實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量組的吞噬百分率和高劑量組吞噬指數(shù)均顯著升高（q檢驗(yàn)，P<0.05）。在小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中，各劑量組的吞噬指數(shù)與陰性對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異（方差分析，P>0.05）。

2.6 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

為符合方差齊性要求（P>0.05），按公式X=Sin-1p1/2對(duì)NK細(xì)胞活性的結(jié)果進(jìn)行變換。結(jié)果顯示，較陰性對(duì)照組，各劑量組小鼠NK細(xì)胞活性無(wú)顯著差異（方差分析，P>0.05）。

表2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和小鼠碳廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)的影響（±S）

表2 復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和小鼠碳廓清試驗(yàn)吞噬指數(shù)的影響（±S）

注：q檢驗(yàn)：與陰性對(duì)照（去離子水）比較，＊.P<0.05。

吞噬指數(shù)（碳廓清試驗(yàn)）陰性對(duì)照 10 21.6±8.8 0.33±0.09 6.95±0.57低劑量組 10 21.4±3.8 0.30±0.06 6.85±0.85中劑量組 10 30.2±8.1＊ 0.42±0.10 6.86±0.95高劑量組 10 32.6±9.2＊ 0.51±0.18＊ 6.96±0.51 P值 0.003 0.002 0.980組別 動(dòng)物數(shù)（只）吞噬百分率（%）吞噬指數(shù)（巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞）

總結(jié)與展望

人體免疫系統(tǒng)是由三道屏障組成的保護(hù)機(jī)體免受疾病原菌侵害的重要防御系統(tǒng)。身體抵御病原侵襲的第一道屏障是能有效阻止大多數(shù)細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、病毒侵襲的皮膚和粘膜；第二道屏障由體液中的溶菌酶等殺菌物質(zhì)和具有吞噬、防衛(wèi)功能的細(xì)胞群體組成；第三道屏障抗體主要來(lái)源于免疫細(xì)胞。第一道屏障和第二道屏障是每個(gè)人與生俱來(lái)的，這是長(zhǎng)期進(jìn)化產(chǎn)生的結(jié)果，可防御大多數(shù)入侵的病原微生物，這種保護(hù)性生理功能稱為非特異性免疫。第三道屏障是指體內(nèi)的T、B細(xì)胞在接受“非自身”的物質(zhì)侵入后，經(jīng)過(guò)感應(yīng)、反應(yīng)和效應(yīng)幾個(gè)不同的應(yīng)答階段，從而進(jìn)行抗原清除的一系列過(guò)程，這個(gè)過(guò)程又叫免疫特異性。人體免疫系統(tǒng)需要相互協(xié)調(diào)、相互配合，2種免疫方式缺一不可。研究表明，N-乙酰神經(jīng)氨酸可在黏膜表面與流感病毒、冠狀病毒等競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，減少病毒與黏膜上的受體結(jié)合，從而保護(hù)宿主細(xì)胞，增強(qiáng)黏膜防御系統(tǒng)。乳鐵蛋白可通過(guò)鐵依賴和鐵不依賴的機(jī)制與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)鐵營(yíng)養(yǎng)，抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)達(dá)到廣譜抑菌作用；同時(shí)，乳鐵蛋白通過(guò)不同機(jī)制與病毒受體結(jié)合阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。“特異性抗體”通常被稱作“免疫球蛋白”，它們通過(guò)B細(xì)胞分化形成，具有特異性免疫功能，它們通過(guò)與抗原進(jìn)行特定反應(yīng)，來(lái)抵御疾病。免疫球蛋白IgG作為人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在血清及其他組織的分泌水平都較高，并具可進(jìn)行重復(fù)免疫應(yīng)答，且目前僅其可通過(guò)胎盤(pán)。

研究結(jié)果表明，不同劑量的復(fù)方濃縮乳清蛋白粉經(jīng)口給予小鼠30d，不會(huì)引起各組間小鼠體重增長(zhǎng)差異，各組間小鼠脾臟與體重的比值以及胸腺與體重的比值也均無(wú)差異。在足跖增厚試驗(yàn)中，中、高劑量組小鼠足跖厚度差值較陰性對(duì)照組顯著增高（P<0.05）。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高（P<0.05）；中、高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率升高（P<0.05），表明復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠細(xì)胞免疫及單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能陽(yáng)性。依據(jù)評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范中增強(qiáng)免疫功能的評(píng)價(jià)規(guī)定：在體液免疫功能、細(xì)胞免疫功能、NK細(xì)胞活力、單核-巨噬細(xì)胞功能中，任意2項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，均可表明樣品具有此功能。因此，結(jié)論提示，復(fù)方濃縮乳清蛋白粉對(duì)小鼠具有增強(qiáng)免疫力的功能，具備一定的開(kāi)發(fā)的價(jià)值。