徐捷 彭昊 萬龍彪 劉豐

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的代謝性骨病，其臨床特征主要是骨量減少和骨微觀結(jié)構(gòu)的破壞。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者發(fā)生骨折的概率較健康人群顯著增加，嚴(yán)重危害患病人群的生活質(zhì)量[1-2]?，F(xiàn)有研究普遍認(rèn)為，骨質(zhì)疏松的主要原因是骨吸收和骨形成之間的平衡被打破，導(dǎo)致骨量減少。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是一類來源于中胚層的干細(xì)胞，具有多向分化的能力[3]。研究表明，BMSC成骨分化能力減弱是骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機(jī)制[4]。因此，促進(jìn)BMSC成骨分化以糾正骨代謝平衡是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在方式之一。

microRNA（miRNA）屬于小RNA家族，長度為18 ～ 25個核苷酸。miRNA能夠特異性結(jié)合下游靶基因，抑制其蛋白翻譯，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理和病理過程[5]。研究表明，miRNA在骨代謝平衡中也發(fā)揮重要作用。目前，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA能夠通過促進(jìn)或抑制BMSC成骨分化進(jìn)而影響骨量的形成[6]。以往研究表明，miR-122-5p廣泛參與各項生理病理過程，如Circ_LRP6和HMGB1競爭性結(jié)合miR-122-5p參與調(diào)控骨肉瘤的進(jìn)展[7]，miR-122-5p通過介導(dǎo)TGF-β1和ATG5之間的負(fù)反饋回路參與調(diào)控細(xì)胞纖維化[8]。除此之外，研究表明，miR-122-5p是骨質(zhì)疏松癥的潛在診斷生物標(biāo)志物，骨質(zhì)疏松癥患者血清中miR-122-5p表達(dá)水平顯著降低[9]。然而，miR-122-5p在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用尚不清楚，尤其是對BMSC成骨分化的影響尚未見報道。此外，研究表明組蛋白去甲基化酶2A（histone demethylation protein 2A,KDM2A）在多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Deng等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，KDM2A通過上調(diào)SOX2和NANOG表達(dá)促進(jìn)牙源性干細(xì)胞向成脂方向分化，進(jìn)而影響牙源性干細(xì)胞成骨/成脂分化平衡。但KDM2A對人BMSC成骨分化的影響卻鮮有報道。因此，本實驗以BMSC為研究對象，探討miR-122-5p對KDM2A的調(diào)控作用，以及兩者對BMSC成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購于西安捷晶生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑

MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（12571063）、胎牛血清（12483020）和胰蛋白酶（25200056）均購于美國Gibco公司。成骨分化培養(yǎng)基（HUXMX-90021）購于中國賽業(yè)生物科技公司。miR-122-5p mimic，miR-122-5p inhibitor，miR-NC，過表達(dá)KDM2A質(zhì)粒（OE-KDM2A）和空白對照（OE-NC）由中國廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。茜素紅染色試劑盒（C0138），BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒（C3206）和雙螢光素酶檢測試劑盒（RG088S）均購自中國碧云天公司。OPN（25715-1-AP）、RUNX2（82636-2-RR）、ALP（11187-1-AP）、KDM2A（24311-1-AP）和GAPDH（10494-1-AP）兔多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔ⅠgG二抗（SA00001-2）購于武漢三鷹生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人BMSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～ 90%時，PBS沖洗細(xì)胞3次，每次2 min，1 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞1 ～ 2 min，隨后用2 mL MEM培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞懸液于15 mL離心管中離心，最后將細(xì)胞分別接種于6孔板中，當(dāng)BMSC融合率達(dá)到80% ～ 90%時，利用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分組為：miR-NC組、miR-122-5p mimic組、OE-NC組、OE-KDM2A組和OE-KDM2A+ miR-122-5p mimic組。

1.4 qRT-PCR檢測miR-122-5p和成骨基因表達(dá)情況

利用Trizol裂解細(xì)胞，加入氯仿抽提RNA，最后加入異丙醇沉淀RNA，離心后用75%乙醇洗滌RNA，晾干后利用酶標(biāo)儀測定RNA濃度。利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將提取的RNA與各種試劑混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s。利用Takara擴(kuò)增試劑盒檢測miR-122-5p以及成骨相關(guān)基因（OPN、ALP和RUNX2）的表達(dá)情況，將cDNA與Takara試劑盒中的試劑按照相應(yīng)配比混勻，反應(yīng)條件為：98℃ 10 s，55℃ 5 s，71℃ 1 min，30 ～ 50 cycles。其中U6和GAPDH分別為miR-122-5p和成骨基因的內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

利用RⅠPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白（電泳條件：80 V 30 min，120 V 60 min），隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（轉(zhuǎn)膜條件：400 Ma 40 min），5%脫脂牛奶封閉后，4℃條件下過夜孵育一抗，TBST清洗PVDF膜，室溫條件下孵育二抗1 h，最后使用ECL發(fā)光液曝光顯影條帶。

1.6 茜素紅染色檢測鈣沉積情況

將轉(zhuǎn)染后的BMSC在MEM培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)2 d，隨后將MEM培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)期間每2天換液1次，2周后使用4%多聚甲醛固定20 min，茜素紅染色30 min，去離子水清洗去除多余染液后，于顯微鏡下拍照觀察。使用十二烷基硫酸鈉溶解鈣結(jié)節(jié)，檢測405 nm處的吸光度用于定量分析鈣沉積情況。

1.7 堿性磷酸酶染色檢測酶活性

將轉(zhuǎn)染后的BMSC在MEM培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)2 d，隨后將MEM培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)期間每2天換液1次，1周后使用4%多聚甲醛固定20 min，使用BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑染色20 min，PBS清洗去除多余染液后于顯微鏡下拍照觀察。使用堿性磷酸酶檢測試劑盒測定410 nm處吸光度用于定量分析堿性磷酸酶活性。

1.8 雙熒光素酶報告試驗

使用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測KDM2A和miR-122-5p相互結(jié)合位點，分別構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）3'-UTR熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，將BMSC按照1.3中的方法接種于6孔板中，待BMSC融合率達(dá)到80% ～ 90%時，將上述質(zhì)粒分別與miR-122-5p mimic和miR-122-5p NC共同轉(zhuǎn)染至BMSC中，48 h后測定熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-122-5p影響B(tài)MSC成骨分化

首先，使用qRT-PCR方法檢測miR-122-5p在BMSC成骨誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-122-5p的表達(dá)水平在BMSC成骨誘導(dǎo)后顯著上調(diào)（P＜0.05，見圖1A），提示miR-122-5p可能參與調(diào)控BMSC成骨分化。隨后，使用miR-122-5p mimic進(jìn)一步探討miR-122-5p在BMSC成骨分化中的作用。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著上調(diào)成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達(dá)水平（P＜0.05，見圖1B、C）。茜素紅染色及定量分析顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic組BMSC細(xì)胞鈣沉積水平顯著升高，（P＜0.05，見圖1D、E）。堿性磷酸酶染色及定量分析顯示，miR-122-5p mimic組BMSC細(xì)胞鈣沉積水平顯著高于miR-NC組（P＜0.05，見圖1F、G）。

圖1 miR-122-5p影響B(tài)MSC成骨分化：A. qRT-PCR方法檢測miR-122-5p在BMSC成骨誘導(dǎo)分化前后的表達(dá)情況；B. qRT-PCR檢測miR-122-5p mimic對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；C. western blot檢測miR-122-5p mimic對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；D. 茜素紅染色檢測miR-122-5p mimic對BMSC鈣沉積的影響；E. 鈣沉積的定量分析；F. 堿性磷酸酶染色檢測miR-122-5p mimic對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；G. 堿性磷酸酶活性的定量分析

2.2 miR-122-5p靶向調(diào)控KDM2A

Targetscan在線數(shù)據(jù)庫顯示miR-122-5p和KDM2A之間存在特異性結(jié)合位點（見圖2A）。雙熒光素酶報告基因顯示，miR-122-5p mimic+KDM2A-WT組的螢光素酶相對活性顯著低于miR-122-5p NC+KDM2A-WT組，而miR-122-5p mimic+KDM2A-MUT和miR-122-5p NC+KDM2A-MUT兩組的螢光素酶相對活性無顯著變化（見圖2B），提示miR-122-5p和KDM2A能夠靶向結(jié)合。Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic能夠抑制KDM2A蛋白表達(dá)水平，而miR-122-5p inhibitor能夠上調(diào)KDM2A蛋白表達(dá)水平（見圖2C）。

圖2 miR-122-5p靶向調(diào)控KDM2A：A. Targetscan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-122-5p和KDM2A特異性結(jié)合位點；B. 雙熒光素酶報告實驗檢測miR-122-5p和KDM2A相互結(jié)合關(guān)系；C. Western blot實驗檢測miR-122-5p對KDM2A蛋白表達(dá)水平的影響

2.3 KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-KDM2A顯著上調(diào)成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達(dá)水平（P＜0.05，見圖3A、B）。茜素紅染色及定量分析顯示，與si-NC組相比，si-KDM2A組BMSC細(xì)胞鈣沉積水平顯著升高（P＜0.05，見圖3C、D）。堿性磷酸酶染色及定量分析顯示，si-KDM2A組BMSC細(xì)胞鈣沉積水平顯著高于si-NC組（P＜0.05，見圖3E、F）。

圖3 KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化：A. qRT-PCR檢測si-KDM2A對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；B. Western blot檢測si-KDM2A對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；C. 茜素紅染色檢測si-KDM2A對BMSC鈣沉積的影響；D. 鈣沉積的定量分析；E. 堿性磷酸酶染色檢測si-KDM2A對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；F. 堿性磷酸酶活性的定量分析

2.4 miR-122-5p靶向KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著下調(diào)成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表達(dá)水平，而OEKDM2A能夠逆轉(zhuǎn)miR-122-5p mimic對成骨相關(guān)基因的抑制作用（P＜0.05，見圖4A、B）。茜素紅染色及堿性磷酸鎂染色分析顯示，與miR-NC組相比，miR-122-5p mimic顯著抑制BMSC細(xì)胞中鈣沉積情況和堿性磷酸酶活性，而OE-KDM2A能夠逆轉(zhuǎn)miR-122-5p mimic的抑制作用（P＜0.05，見圖4C-F）。

圖4 miR-122-5p靶向KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化：A. qRT-PCR檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉(zhuǎn)染對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；B. Western blot檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉(zhuǎn)染對BMSC成骨相關(guān)指標(biāo)（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表達(dá)水平；C. 茜素紅染色檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉(zhuǎn)染對BMSC鈣沉積的影響；D. 鈣沉積的定量分析；E. 堿性磷酸酶染色檢測OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共轉(zhuǎn)染對BMSC堿性磷酸酶活性的影響；F. 堿性磷酸酶活性的定量分析

3 討論

人體骨骼系統(tǒng)始終處于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡之中。當(dāng)這種骨代謝的平衡關(guān)系被打破后，就會導(dǎo)致骨量丟失、骨穩(wěn)定性下降和骨脆性的風(fēng)險增加，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[11]。成骨細(xì)胞是主要由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的骨形成細(xì)胞。成骨細(xì)胞可以特異性分泌骨基質(zhì)，在骨形成和重建中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[12]。在骨質(zhì)疏松癥中，BMSC成骨分化能力減弱會加重骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展，而恢復(fù)BMSC成骨分化能力則能夠延緩疾病進(jìn)展。例如，芝麻脂素能夠通過直接促進(jìn)BMSC成骨分化來延緩骨質(zhì)疏松的進(jìn)展[13]。除了藥物治療，從基因水平調(diào)控干細(xì)胞成骨分化能力也是一種具有發(fā)展前景的治療方式。越來越多的研究表明，miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)情況，進(jìn)而參與調(diào)控多種病理生理過程。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)miRNA在調(diào)控骨質(zhì)疏松進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。例如，Li等[14]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-149-3p能夠促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化，是骨質(zhì)疏松癥潛在的治療靶點。Yin等[15]揭示miR-215-5p通過靶向XⅠAP調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化和骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。以上結(jié)果提示，miRNA能夠通過調(diào)控干細(xì)胞成骨分化緩解骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。

miR-122-5p已被發(fā)現(xiàn)廣泛參與調(diào)控各種疾病，包括腹膜纖維化、肺損傷以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。例如，miR-122-5p通過靶向Smad5激活Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑促進(jìn)腹膜纖維化[16]。miR-122-5p通過靶向ⅠL1RN減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[17]。在骨科領(lǐng)域，miR-122-5p已被證實與骨肉瘤細(xì)胞的遷移和增殖相關(guān)。值得注意的是，對于miR-122-5p在骨質(zhì)疏松癥中的研究僅有少量報道，且以往的研究僅發(fā)現(xiàn)miR-122-5p在骨質(zhì)疏松癥患者血清中的表達(dá)水平顯著降低，是骨質(zhì)疏松癥的潛在診斷生物標(biāo)志物[9]。然而，miR-122-5p在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，尤其是對BMSC成骨分化的影響尚未見報道。在此基礎(chǔ)之上，本研究著重探討miR-122-5p對BMSC成骨分化的影響。通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p能夠促進(jìn)BMSC成骨基因的表達(dá)、鈣沉積及堿性磷酸酶的活性，提示miR-122-5p參與調(diào)控BMSC成骨分化。

研究表明，miRNA通過靶向下游靶基因的翻譯參與介導(dǎo)各種疾病的發(fā)展[18]。組蛋白去甲基化酶2A（KDM2A）已被證實參與調(diào)控干細(xì)胞成骨分化[19]。據(jù)此推測，miR-122-5p可能通過靶向調(diào)控下游KDM2A進(jìn)而參與調(diào)控BMSC成骨分化。首先，筆者利用雙熒光素酶報告試驗證實兩者之間存在相互結(jié)合關(guān)系；隨后，利用小干擾RNA證實沉默KDM2A能夠促進(jìn)BMSC成骨分化；最后，通過功能回復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)沉默KDM2A能夠促進(jìn)BMSC成骨分化，而miR-122-5p inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)si-KDM2A的促進(jìn)作用。以上結(jié)果提示，miR-122-5p靶向KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化。

值得說明的是，盡管本研究發(fā)現(xiàn)miR-122-5p能夠靶向KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化，但對于KDM2A如何調(diào)控BMSC成骨分化的機(jī)制仍不清楚。KDM2A屬于組蛋白去甲基化酶的一種，后者已被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控組蛋白的甲基化，而甲基化能夠改變DNA的折疊和暴露狀態(tài)，進(jìn)而影響干細(xì)胞的分化[10]。提示KDM2A可能通過參與調(diào)控組蛋白甲基化而影響B(tài)MSC成骨分化。除了miR-122-5p能夠靶向KDM2A影響B(tài)MSC成骨分化，關(guān)于miR-122-5p和KDM2A在骨質(zhì)疏松中的診斷和治療價值仍有待進(jìn)一步研究。以往研究表明，miRNA可以作為獨立診斷標(biāo)志物，但由于本研究缺少人體組織樣本，miR-122-5p能否作為骨質(zhì)疏松的診斷和預(yù)后標(biāo)志物仍需進(jìn)一步臨床研究。此外，由于KDM2A可能通過參與調(diào)控組蛋白甲基化進(jìn)而影響B(tài)MSC成骨分化，提示KDM2A有望為骨質(zhì)疏松的分子治療提供新的研究方向。需要注意的是，本研究使用的人源的BMSC，由于人和動物之間存在種屬差異，因此本研究僅從細(xì)胞水平探索了miR-122-5p和KDM2A在BMSC成骨分化中的作用，關(guān)于miR-122-5p和KDM2A在動物實驗中的效果以及在臨床中的使用價值仍有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，miR-122-5p靶向抑制KDM2A表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMSC成骨分化。但BMSC成骨分化機(jī)制復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步研究。