楊柳 張雨 吳亞東 陳丹丹 付海洋

臨床常用的傳統(tǒng)骨蠟的主要成分為蜂蠟、麻油等，但其生物相容性差，難以被機體降解和吸收，局部殘留對骨的愈合造成很大的阻礙，因其止血機理只是物理屏障作用，導(dǎo)致新骨不能正常合成[1]。國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從人工合成高分子材料、生物制劑等，進行了骨蠟替代產(chǎn)品的研究工作，如膠原纖維、明膠海綿、氧化纖維素、聚乳酸和多聚糖等[2-6]。動物實驗和臨床應(yīng)用表明，這些物質(zhì)具有可降解性，但在物理性狀改變、材料安全性等方面仍存在較多尚未解決的實際問題[7]。本研究中的新型可吸收骨蠟是由脂肪族聚酯和聚乙二醇組成的混合物。聚酯鏈植入人體后通過酯鍵的斷裂緩慢降解吸收，聚乙二醇可溶解，以原型從腎臟排出體外。可降解骨蠟在臨床應(yīng)用中是通過填塞和覆蓋骨創(chuàng)面，機械性控制骨損傷表面的出血，達到輔助止血的目的，同時可在體內(nèi)自然降解，促進骨質(zhì)愈合，在臨床上適用于控制骨損傷表面出血。本研究通過羊胸骨植入試驗、小鼠急性毒性試驗和兔刺激試驗研究其生物安全性。由于新型可吸收骨蠟性狀可揉捏至可塑形狀態(tài)，還具有可降解的特性，如果其生物安全性也符合要求，其將成為臨床理想的骨表面止血材料。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料：新型可吸收骨蠟（北京頤合恒瑞醫(yī)療科技有限公司）；ETHⅠCON骨蠟（強生醫(yī)療器械有限公司）。主要試劑：鹽酸賽拉嗪（吉林省華牧動物保健品有限公司）；異氟烷（濟南廣盛源生物科技有限公司）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；注射用青霉素（華北制藥集團動物藥業(yè)有限責任公司）；阿托品（山西省芮城科隆獸藥有限公司）；無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；玉米油（江西益普生物藥業(yè)有限公司）。

主要儀器：呼吸麻醉機（VME+MODEL300，美國Midmark公司）；電動吸引器（YX9304，上海斯曼峰醫(yī)療器械公司），心電監(jiān)護儀（Vet-12N，山東銘泰醫(yī)療器械有限公司）；電外科發(fā)生器（Mega Power，美國Megadyne公司）；恒溫箱（DH3600，天津泰斯特儀器有限公司）；顯微鏡（Nikon Ci-S，日本尼康公司）；成像系統(tǒng)（DS-FⅠ2，日本尼康公司）；搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 實驗動物

胸骨植入實驗采用12個月的普通級小尾寒羊，18只，雌雄各半，體重為（45±5） kg，由北京邁迪思維生物技術(shù)有限公司提供，動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0024。實驗前將在實驗機構(gòu)內(nèi)預(yù)適應(yīng)7 d。實驗獲得北京邁迪思維生物技術(shù)有限公司動物倫理委員會審批（批準文號：MDSV-2021-004A）。

急性毒性試驗采用昆明小鼠（雄性，體重15 ～ 17 g）20只，每5只小鼠一籠，添加飼料足量，飲水瓶給水；刺激試驗動物采用SPF級新西蘭大白兔（雄性，體重2.5 ～ 3 kg）6只，單籠喂養(yǎng)，添加飼料足量，飲水瓶給水。小鼠實驗動物許可證號為SYXK（京）2017-0013，兔實驗動物許可證號為SCXK（京）2019-0017，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 骨植入實驗

實驗品：新型可吸收骨蠟，由北京頤合恒瑞醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

對照品：目前國內(nèi)已上市的同類產(chǎn)品均為以蜂蠟為主材的非吸收性產(chǎn)品，尚無可吸收性產(chǎn)品上市。因此，選擇已上市的非吸收性同類產(chǎn)品，即強生醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的ETHⅠCON骨蠟（BONEWAX，W810，2.5 g，國械注進20163133039）作為對照品，其是目前外科手術(shù)中最常用的止血產(chǎn)品之一。

18只小尾寒羊在給藥時的體重差異不超過平均體重的10%。小尾寒羊異氟烷麻醉滿意后，于胸骨行縱切口，切開皮膚、皮下組織和深筋膜，暴露胸骨斷面見活動性出血。胸骨斷面的長度為20 cm，深度為胸骨貫穿傷，暴露心臟。紗布初步處理出血后，用預(yù)先揉捏至可塑形狀態(tài)的實驗品或?qū)φ掌愤M行填塞止血，空白組胸骨切開術(shù)后只用紗布處理出血。

將18只小尾寒羊隨機分為2、6、12周時間點的實驗組、對照組和空白組，每個時間點6只。同一只羊的每節(jié)胸骨（共6節(jié)）作為1個獨立的植入位點，每只實驗動物的胸骨上隨機選擇各2個植入位點分別植入實驗品（實驗組）和對照品（對照組）[8-9]，剩余2個植入位點作為空白（空白組），對術(shù)中止血情況進行記錄。在術(shù)后飼養(yǎng)2、6、12周的時間節(jié)點各隨機處死6只試驗羊（每個時間點每組12節(jié)胸骨），并取胸骨做病理檢測。

為保證與對照組、空白組進行比較時具有足夠的組間差異檢出能力，共對18只實驗用小尾寒羊進行實驗，且每個產(chǎn)品每個時間點分別在6只羊上進行實驗。每個時間點各組產(chǎn)品有12個平行樣進行相關(guān)評價。結(jié)合臨床實際使用情況，保證每個植入位點的樣品使用量不低于160 mg，保持植入的每個樣本量基本一致。實驗位點使用可吸收骨蠟進行止血，對照位點使用強生骨蠟進行止血，空白位點不使用產(chǎn)品。于術(shù)后2、6、12周時，分別將實驗用羊處死，并將已實驗的胸骨部位組織取出，福爾馬林固定以進行病理評價[9-12]。通過組織病理切片分析確認材料的體內(nèi)降解周期[13-16]。

實驗品植入2、6、12周的炎癥反應(yīng)與空白組、對照組有無明顯差別。植入后局部組織學(xué)評價標準依據(jù)GB/T16886.6—2015附錄E[17]，參見表1和表2。

表1 組織學(xué)評價系統(tǒng)舉例——細胞類型/反應(yīng)

表2 組織學(xué)評價系統(tǒng)舉例——反應(yīng)

按以上的評分標準，各組間比較組織反應(yīng)，兩組之間的評分相減后計算得分，實驗樣品得分的判定標準為：①無刺激（0.0 ～ 2.9）；②輕微刺激（3.0 ～ 8.9）；③中度刺激（9.0 ～ 15.0）；④重度刺激（＞15.0）。

1.4 急性毒性實驗

取昆明小鼠20只，隨機分為4組，每組5只。其中兩組分別尾靜脈注射生理鹽水對照、可吸收骨蠟的浸提液（50 mL/kg，生理鹽水樣品組），另外兩組分別腹腔注射玉米油（玉米油對照組）、可吸收骨蠟的玉米油浸提液（50 mL/kg，玉米油樣品組）。記錄注射后第1、2、3 d觀察到的小鼠的毒性癥狀，并記錄小鼠的體重變化，若發(fā)現(xiàn)死亡動物則需要進行尸檢并隔離瀕死動物。

1.5 刺激試驗

取6只新西蘭大白兔，分為4組：生理鹽水對照組和生理鹽水樣品組，玉米油對照組和玉米油樣品組。其中3只兔子在脊柱左邊選5個點注射生理鹽水對照，每點間隔2 cm，在脊柱右邊選5個點注射可吸收骨蠟生理鹽水浸提液，各點注射量為0.2 mL。另外3只兔子相同操作，左邊注射玉米油對照，右邊注射可吸收骨蠟玉米油浸提液。在注射的1、2、3 d觀察記錄各個注射部位的情況，對每個觀察期各注射部位的紅斑和水腫的組織反應(yīng)評分，并記錄實驗結(jié)果。

3只兔子記分相加后除以3得出每一試驗樣品和相應(yīng)的生理鹽水對照和玉米油對照平均積分，試驗樣品的平均積分減去相應(yīng)對照的平均記分得到刺激指數(shù)。刺激指數(shù)小于1為無刺激。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，定量指標的描述將計算均值、標準差，分類指標描述各類的例數(shù)及百分數(shù)。定量資料的組間比較采用One-way ANOVA差異性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨植入試驗結(jié)果

2.1.1 術(shù)中止血情況

本研究中的實驗組和對照組在術(shù)中涂抹3 min后均起到顯著止血效果：創(chuàng)面出血完全停止，止血效果明顯，材料黏附牢固，無脫落?？瞻捉M止血效果為無效：創(chuàng)面仍有明顯滲血。

2.1.2 術(shù)后一般狀況

小尾寒羊術(shù)后2、6、12周時均無創(chuàng)口感染、出血、血腫或其他任何異常臨床癥狀出現(xiàn)，創(chuàng)口均已愈合。18只羊呼吸、運動、飲食、排便均正常。

2.1.3 組織病理學(xué)結(jié)果

小尾寒羊于術(shù)后2周的胸骨切片HE染色結(jié)果如圖1所示。術(shù)后2周，可見骨組織出現(xiàn)斷裂，兩側(cè)斷離面呈現(xiàn)大量壞死的骨組織和滲出物，可見不同數(shù)量的破骨細胞浸潤。骨組織斷離面端可見有帶狀的纖維化的肉芽組織出現(xiàn)，其中有炎性細胞浸潤，伴有明顯的充血、水腫和出血。各張切片中肉芽組織的厚度不一致。各組切片骨折處均存在由骨折時的暴力造成的創(chuàng)傷性壞死骨組織和滲出物，由于大量壞死組織和滲出物的存在而未被清除，雖然可見少量新骨組織的再生，但在各組之間沒有明顯的差別。

圖1 術(shù)后2周小尾寒羊胸骨切片HE染色圖：A. 空白組（×50）；B. 對照組（×200）；C. 實驗組（×200）

小尾寒羊于術(shù)后6周的胸骨切片HE染色結(jié)果如圖2所示。術(shù)后6周，各組切片骨折處都存在由增生的纖維結(jié)締組織和骨小梁構(gòu)成的骨痂。骨折處殘存的未被吸收的壞死組織在對照組中可見最多；空白組次之；而在實驗組中最少。骨小梁在實驗組中可見最多；空白組次之；而在對照組中較少。

圖2 術(shù)后6周小尾寒羊胸骨切片HE染色圖：A. 空白組（×200）；B. 對照組（×10）；C. 實驗組（×50）

小尾寒羊于術(shù)后12周的胸骨切片HE染色結(jié)果如圖3所示。術(shù)后12周，空白組切片骨折處殘存病變最少，僅可見骨小梁稍微增多，排列稍微不整，分布不均勻；實驗組次之，除骨小梁稍微增多，排列稍微不整，分布不均勻之外，可見少數(shù)切片中殘存少量壞死組織，并可見殘存有軟骨；而對照組殘存較多，每例都可見殘存的壞死組織以及周圍的組織反應(yīng)和炎性細胞浸潤，少數(shù)切片中可見有殘存的軟骨。

圖3 術(shù)后12周小尾寒羊胸骨切片HE染色圖：A. 空白組（×20）；B. 對照組（×20）；C. 實驗組（×100）

2.1.4 組織病理學(xué)半定量評分結(jié)果

組織病理學(xué)半定量評分結(jié)果如表3所示。

表3 組織病理學(xué)半定量評分結(jié)果（分）

2周時，實驗組和空白組與對照組相比為0，判定為無刺激（0 ～ 2.9）。

6周時，實驗組與空白組相比為1，判定為無刺激（0 ～ 2.9）；而對照組與實驗組相比為9.6，判定為中度刺激（9.0 ～ 15.0）。

12周時，實驗組與空白組相比為1.7，判定為無刺激（0 ～ 2.9）；而對照組與實驗組相比為9，判定為中度刺激（9.0 ～ 15.0）。

2.1.5 體內(nèi)降解周期

在病理切片圖1-3中，實驗組缺損處2周時觀察到大量樣品。6周時樣品明顯崩解，崩解后的樣品最大不超過300 μm，分散在新骨空隙處。降解過程中未見纖維組織包囊，新骨生長明顯，至12周時，少數(shù)切片偶見樣品殘余且不超過50 μm，樣品已基本降解，新骨連接兩斷端，骨損傷已得到修復(fù)。

對照組于6、12周時在損傷處仍殘留較多樣品。樣品未見明顯降解，引起纖維組織增生形成包囊而阻擋新骨形成，至12周時，骨缺損間隙明顯。

2.2 急性毒性實驗

在急性毒性實驗中，小鼠在樣品浸提液注射后1、2、3 d的體重變化情況如圖4所示。

圖4 急性毒性試驗中小鼠的體重變化

在整個試驗過程中，各組小鼠均未出現(xiàn)毒性表現(xiàn)，也未出現(xiàn)死亡的實驗個體。玉米油樣品組的小鼠和玉米油對照組相比，生理鹽水樣品組的小鼠和生理鹽水對照組相比，小鼠的體重均呈增長的趨勢。因此，可以得出可吸收骨蠟不具備急性毒性。

2.3 刺激試驗

樣品組3只兔子注射后1、2、3 d記分相加后除以3，減去相應(yīng)對照組的平均積分，得到生理鹽水樣品組刺激指數(shù)為0，不大于1，玉米油樣品組刺激指數(shù)為0.11，不大于1。

3 討論

目前，常用的傳統(tǒng)骨蠟在骨科手術(shù)骨斷面止血方面效果顯著，簡單易用，但其存在的最大問題在于材料的不可吸收性，盡管是常用的骨止血劑，但已有研究表明其會阻礙骨愈合[18]，引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)、增加感染率，這一缺陷限制了骨蠟在骨性融合術(shù)后創(chuàng)面止血方面的應(yīng)用，患者失血量的增加不僅給手術(shù)帶來極大不便，而且對于其預(yù)后也會產(chǎn)生一定的影響[19]。由于骨蠟的不可吸收性，可以使用膠原蛋白和氧化纖維素等經(jīng)典的可吸收止血劑作為骨蠟的替代產(chǎn)品在骨止血方面加以應(yīng)用。然而，這類材料因其在骨骼內(nèi)缺乏黏附性，其儲存穩(wěn)定性、生物相容性等方面也存在問題，這些不足使經(jīng)典的可吸收止血劑在骨止血方面的應(yīng)用受到限制[20]。因此，在傳統(tǒng)骨蠟的有益特性的基礎(chǔ)上，解決其不可吸收性，使其成為在體內(nèi)可降解的材料可能是臨床骨損傷表面出血的好方法。

以往的對骨蠟植入動物后安全性評價試驗都是采用小型動物進行試驗，選擇的動物骨缺損部位也不同，有的研究使用SD大鼠顱骨缺損動物模型[21]，有的研究使用家兔股骨缺損模型[8]。本研究使用大型動物小尾寒羊的胸骨損傷動物模型，與小型動物模型相比更接近于臨床真實結(jié)果。

組織病理學(xué)是最常用的觀察植入部位生長和炎癥情況的方式，通過組織病理學(xué)可以直觀反映新型可吸收骨蠟植入小尾寒羊后植入部位的新骨生成，組織病理學(xué)的半定量評分則能半定量反映植入部位的炎癥情況。本研究通過組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，實驗組骨折修復(fù)效果最好，可見大量新生骨小梁，骨缺損處得到一定的修復(fù)，可觀察到紅細胞、脂肪細胞等結(jié)構(gòu)，缺損部位血供正常。未降解的植入樣品分散在骨缺損后新骨生長的空隙處，且對局部組織顯示無刺激。對組織病理學(xué)進行半定量評分：實驗組可吸收骨蠟與空白組相比，樣品植入胸骨損傷表面2、6、12周，顯示為無刺激；對照組不可吸收骨蠟與實驗組可吸收骨蠟相比，植入6、12周，顯示中度刺激。新型可吸收骨蠟植入后引起的組織學(xué)反應(yīng)與對照相比更加輕微。

植入物的降解速度若與組織生長速度不匹配，則可能會阻礙骨骼愈合速度并影響愈合質(zhì)量，同時可吸收植入材料滯留體內(nèi)時間過長，往往會導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，影響骨組織愈合。所以本研究對新型可吸收骨蠟植入小尾寒羊進行了體內(nèi)降解周期的觀察發(fā)現(xiàn)體內(nèi)降解周期為2周時，實驗組可吸收骨蠟在骨損傷處有大量實驗品殘留；6周時實驗品實驗組可吸收骨蠟明顯崩解，崩解后的樣品最大不超過300 μm；12周時，實驗組可吸收骨蠟已基本降解完全。

新型可吸收骨蠟在小尾寒羊胸骨創(chuàng)面進行止血后，其降解速度與組織生長速度匹配，小尾寒羊胸骨病理結(jié)果中可見大量新生骨小梁?？晌展窍炘谝欢〞r間內(nèi)可以被機體吸收，并且對于骨折的愈合不會產(chǎn)生不良影響。

在急性毒性試驗中，生理鹽水樣品組和玉米油樣品組均未出現(xiàn)嘔吐、走路不穩(wěn)等臨床反應(yīng)，且每組的體重均正常增長，說明了該可吸收骨蠟不具有急性毒性。在刺激試驗中，玉米油樣品組的新西蘭大白兔和玉米油對照組相比，生理鹽水樣品組的新西蘭大白兔和生理鹽水對照組相比，未出現(xiàn)泛紅、水腫等皮膚刺激癥狀，說明該可吸收骨蠟不具有刺激毒性。

綜上，本研究中的新型可吸收骨蠟是一種安全、無急性毒性、無刺激性、可用于骨創(chuàng)面止血的材料。并且，由于這種新型可吸收骨蠟具有可以在體內(nèi)逐漸降解的特性，比傳統(tǒng)骨蠟更有優(yōu)勢。這種新型可吸收骨蠟不會阻礙新骨組織生成，所以更有利于骨組織修復(fù)，在臨床上有望替代傳統(tǒng)骨蠟，成為理想的骨表面損傷止血材料。