咼文靜，鄧 慧，宋 萍，張孟賢，*

(1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院/襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，湖北 襄陽 441000；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430030)

彌漫性膠質(zhì)瘤是成人最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有腦腫瘤的30%，腦惡性腫瘤的80%。彌漫性較低級別膠質(zhì)瘤約占所有膠質(zhì)瘤的15%，5 年生存率在30%～80%，預(yù)后差異較大。膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是成人最常見的惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的15%，盡管目前存在包括手術(shù)、放療和替莫唑胺同步化療[1]以及近來發(fā)展起來的免疫治療、靶向治療和腫瘤電場治療等在內(nèi)的多種標準治療模式，其5 年生存率仍低于5%[2]。因此，尋找有效的治療靶點和更加深入探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制非常必要。

轉(zhuǎn)化生長因子β 誘導(dǎo)蛋白(transforming growth factor β-induced protein，TGFBI)，是一種能結(jié)合整合素和細胞外基質(zhì)蛋白的連接蛋白，在胚胎發(fā)育、細胞增殖、黏附、遷移、分化和炎癥等過程中發(fā)揮著重要作用[3]。有研究表明TGFBI 在不同腫瘤中發(fā)揮不同的功能。TGFBI 在胃癌[4]、膀胱癌[5]和食管鱗癌[6]中異常過表達，提示其可能扮演促癌基因的角色；然而，在間皮瘤、乳腺癌和肺癌中，TGFBI 的表達水平明顯降低[7-8]，因此它亦可能是一種抑癌基因。目前，關(guān)于TGFBI 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究仍然很少，因此，本文旨在探討TGFBI 在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機制。

本研究利用癌癥基因圖譜(The Cancer Genome Altas，TCGA)、中國腦膠質(zhì)瘤圖譜(Chinese Glioma Genome Altas，CGGA)和腦腫瘤分子數(shù)據(jù)庫(Rembrandt)分析TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的表達及其對患者預(yù)后的影響，并通過免疫組化實驗對結(jié)果進行驗證。此外，本研究還采用體外實驗檢測了TGFBI 對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲、凋亡和細胞周期的影響。然后采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)研究TGFBI 在腫瘤中可能參與并調(diào)控的通路，為后續(xù)確定TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值及明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購于美國Gibco公司；TGFBI 抗體購于美國Abcam 公司；二抗來自普諾森試劑盒；TRIzol 試劑購于上海普飛生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒、顯色液均購于上海碧云天生物技術(shù)公司；CCK-8、PI均購于默克Sigma公司；Annexin Ⅴ-APC 凋亡檢測試劑盒購于eBioscience公司；侵襲實驗染色試劑盒購于美國Corning公司；內(nèi)參基因和目的基因引物由吉凱基因設(shè)計和合成。

1.2 數(shù)據(jù)庫和組織標本

從TCGA、CGGA 和Rembrandt 數(shù)據(jù)庫下載膠質(zhì)瘤患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息，然后利用Graphpad Prism 8.0 軟件整合分析并繪制TGFBI mRNA 在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達情況，分析TGFBI mRNA 與患者生存時間的關(guān)系并繪制Kaplan-Meier 曲線。本研究使用的腦膠質(zhì)瘤組織芯片購自上海吉凱生物有限公司，陣列編號GL805b，該芯片包含35 例膠質(zhì)母細胞瘤和5例正常腦組織。

1.3 免疫組化

組織芯片采用二甲苯脫蠟2 次，每次15 min，梯度乙醇水化，在微波爐里高火加熱檸檬酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)至沸騰后低火維持20 min，待組織切片自然冷卻后PBS 洗一次，一抗4 ℃孵育過夜，TBS 洗2次，5 min/次，加二抗室溫孵育60 min，TBS 洗4次，5 min/次。DAB 染色，蘇木素復(fù)染30 s，中性樹膠封片。晾干，觀察結(jié)果，拍照。綜合考慮染色強度評分和染色陽性率評分，兩者相乘得到IHC 評分，用于評估TGFBI 的表達水平。染色強度評分：按顏色深淺分別賦予0(陰性)、1(弱)、2(中)、3 分(強)；染色陽性率評分：陽性率0 為0 分，>0～25%為1 分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。IHC 評分=染色強度評分×染色陽性率評分，分數(shù)越高代表TGFBI表達水平越高。

1.4 細胞培養(yǎng)

本實驗所用的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87和U373均來自國家實驗細胞資源共享平臺。兩種細胞系均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞的生長情況分別進行換液或傳代。

1.5 慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染目的細胞

從上海吉凱生物有限公司購買已設(shè)計好的針對TGFBI 序列的shRNA 慢病毒和相應(yīng)的空載序列慢病毒，并轉(zhuǎn)染U87 和U373 細胞，轉(zhuǎn)染完畢后在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，嘌呤霉素篩選后用Western blot法驗證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.6 CCK-8法檢測膠質(zhì)瘤細胞增殖

取對數(shù)生長期的細胞胰酶消化后制成細胞懸液，分為實驗組和對照組：實驗組細胞為帶有針對TGFBI序列的shRNA的慢病毒，而對照組則為帶有轉(zhuǎn)染了相應(yīng)的空載序列的慢病毒。隨后將其接種于96 孔板中，每孔培養(yǎng)基總量100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。將接種細胞的培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%條件下，根據(jù)實驗需要，分別孵育24、48、72、96 和120 h。在每個時間點結(jié)束前，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，孵育結(jié)束后，用酶標儀測定其在450 nm波長處的吸光度值D(450)。

1.7 Transwell細胞侵襲試驗

分別將實驗組和對照組的U87和U373細胞置于侵襲小室上層，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于侵襲小室的下層，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育48 h 后，用棉簽將小室上層細胞刮下去除，然后用4%多聚甲醛將小室下層細胞固定20 min，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察，每個上室隨機取5 個100 倍視野拍照并進行細胞計數(shù)。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

收集實驗組和對照組的U87和U373細胞，用PBS洗滌2次后加入200 μL的結(jié)合緩沖液，加入10 μL的Annexin Ⅴ-APC 吹打混勻，室溫避光孵育30 min，上機檢測細胞凋亡情況。

1.9 流式細胞術(shù)進行細胞周期的檢測

將實驗組和對照組的U87和U373細胞分別用胰酶消化后制成細胞懸液，吸1 mL 細胞懸液離心后加入1 mL 70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃固定過夜，PBS洗去乙醇后加入0.3 mL的PI，4 ℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.10 基因集富集分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載膠質(zhì)瘤患者的mRNA 數(shù)據(jù)，按照TGFBI mRNA表達水平中位數(shù)分為TGFBI高表達組和低表達組并制做成表型數(shù)據(jù)文件(cls 格式)，同時將mRNA 數(shù)據(jù)制作成與表型數(shù)據(jù)相對應(yīng)的基因表達譜文件(gct 格式，矩陣形式)。然后，使用GSEA(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)網(wǎng)站提供的基于IAVA環(huán)境的GSEA軟件(version 3.0)分析比較TGFBI高低表達組之間可能存在的差異表達基因及信號通路。在GSEA 分析中使用GSEA 官方提供的Molecular Signature Database(MsigDB)作為通路注釋源，通過1 000次循環(huán)的排列組合尋找顯著富集的信號通路。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用Graphpad Prism 6 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和制圖，應(yīng)用SPSS 18.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，二獨立樣本t檢驗進行數(shù)據(jù)分析，Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于數(shù)據(jù)庫分析TGFBI mRNA 的表達及其與臨床病理指標的相關(guān)性

從TCGA、CGGA和Rembrandt數(shù)據(jù)庫下載GBM和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床信息進行分析。如圖1 所示，TGFBI mRNA 的表達水平與世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)定義的膠質(zhì)瘤分級相關(guān)，隨著腫瘤級別和惡性程度的增加，TGFBI mRNA 的表達水平也逐漸增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Kaplan-Meier 生存分析顯示TGFBI mRNA 的表達水平與患者的預(yù)后呈負相關(guān)(P<0.05，見圖2)。然后，本研究通過免疫組化檢測TGFBI 蛋白在腫瘤組織和正常腦組織中的表達水平，結(jié)果顯示，TGFBI 蛋白主要位于細胞質(zhì)中，陽性表達呈棕黃色和棕褐色的顆粒(見圖3)，35 例膠質(zhì)母細胞瘤組織的免疫組化染色評分為5.96±4.01，高于對照組的評分0(P<0.05)。

圖1 TGFBI mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達水平

圖2 TGFBI mRNA不同表達水平膠質(zhì)瘤患者的生存分析

2.2 TGFBI對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響

采用慢病毒轉(zhuǎn)染干擾TGFBI 的表達，構(gòu)建TGFBI低表達的U87 和U373 細胞系，Western blot 檢測結(jié)果顯示，相較于陰性對照組，實驗組sh-TGFBI中TGFBI蛋白的表達水平顯著下降，說明轉(zhuǎn)染成功(圖4A)。應(yīng)用CCK-8 試劑盒分別對對照組和sh-TGFBI 組膠質(zhì)瘤細胞在24、48、72、96和120 h時間點進行細胞增殖能力的檢測。結(jié)果顯示，sh-TGFBI 組U87 和U373 細胞增殖能力較對照組明顯降低(P<0.05，圖4B)。表明敲低TGFBI基因表達后可抑制腫瘤細胞的增殖。

圖4 TGFBI蛋白低表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖

2.3 TGFBI對膠質(zhì)瘤細胞侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果(圖5)顯示，不同光鏡視野中實驗組兩株膠質(zhì)母細胞瘤細胞的數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)，表明敲低TGFBI 的表達能顯著抑制U87 和U373膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。

圖5 敲低TGFBI后對U87和U373膠質(zhì)瘤細胞侵襲的影響

2.4 TGFBI對膠質(zhì)瘤細胞凋亡和細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細胞凋亡和細胞周期分布情況(圖6)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了sh-TGFBI慢病毒顆粒的U87 和U373 細胞凋亡率分別為(7.92±0.57)%、(6.89±0.56)%，而陰性對照組細胞凋亡率分別為(3.94±0.23)%、(4.45±0.44)%。以上數(shù)據(jù)表明與對照組相比，實驗組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，轉(zhuǎn)染了sh-TGFBI 慢病毒顆粒的U87和U373細胞處于S期的細胞數(shù)減少，G2/M期細胞數(shù)增多(均為P<0.05)，而處于G1期的細胞無顯著變化。

圖6 U87和U373細胞敲低TGFBI對腫瘤細胞凋亡和細胞周期的影響

2.5 TGFBI的功能基因集富集分析

為了進一步研究TGFBI 參與腫瘤的調(diào)控機制，利用TCGA 數(shù)據(jù)庫，通過GSEA 方法分析了TGFBI 的表達所參與的信號通路，結(jié)果顯示，TGFBI 高表達可能通過TOLL 樣受體信號通路、NOD 樣受體信號通路和JAK-STAT信號通路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展(圖7)。

3 討論

人腦膠質(zhì)瘤是高度惡性的顱內(nèi)腫瘤，它表現(xiàn)為對正常腦組織的破壞，對常規(guī)治療的抵抗以及廣泛侵襲整個大腦[9]。世界衛(wèi)生組織根據(jù)膠質(zhì)瘤的組織病理學(xué)特征將其分為四級(I～IV)。盡管有最佳的治療模式，膠質(zhì)母細胞瘤(IV 級)患者的中位生存期仍只有15～18個月[10]。在本文中，我們討論了在膠質(zhì)母細胞瘤中的一個潛在的分子標志物，可能為膠質(zhì)母細胞瘤的研究帶來新的機遇。

研究證實TGF-β信號在癌前狀態(tài)下發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用，而在晚期癌癥中則作為腫瘤促進劑發(fā)揮作用[11]。TGFBI，作為TGF-β信號通路的下游分子，有文獻報道其在腫瘤進程中發(fā)揮促進和抑制的雙重作用[12-13]。近年來，多項研究表明TGFBI 在不同類型腫瘤中的作用，如在卵巢癌[14]、食管鱗狀細胞癌[6]、腎細胞癌[15]、黑色素瘤[16]、結(jié)腸癌[17]和肺腺癌[18]中發(fā)揮促腫瘤作用，而在白血病[19]、間皮瘤、乳腺癌[8]和肺癌[7]中起抑癌作用，因此，TGFBI 可能是一個廣譜的生物標志物和治療靶點。然而，TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的表達模式和確切作用尚不清楚。

A：JAK-STAT信號通路；B：NOD樣受體信號通路；C：TOLL樣受體信號通路.

在本研究中，我們用生物信息學(xué)方法證實了TGFBI 的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度分級存在顯著相關(guān)性，膠質(zhì)瘤分級越高，其表達越豐富。并且TGFBI 高表達與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。隨后免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示TGFBI 在膠質(zhì)母細胞瘤組織中的表達水平顯著高于正常腦組織。基于上述結(jié)果我們推測TGFBI 在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演了癌基因的角色，為了進一步了解TGFBI 在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能，我們通過CCK-8、Transwell 小室實驗、流式細胞術(shù)檢測細胞增殖、凋亡和細胞周期的變化。結(jié)果顯示，敲低TGFBI基因表達后，膠質(zhì)瘤細胞U87 和U373的增殖速度減慢，侵襲能力下降，細胞凋亡率升高，并促使細胞滯留于G2/M 期。這些結(jié)果均提示TGFBI 在膠質(zhì)瘤中可能作為一個促癌因子存在。Guo等[20]的實驗通過pSUPER-shTGFBI 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87 和U251細胞，發(fā)現(xiàn)TGFBI表達增強可以促進膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移，此與我們的實驗結(jié)果一致。Zhu 等[21]通過體外實驗初步證實了膠質(zhì)母細胞瘤TGFBI主要由M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌，并作用于膠質(zhì)瘤干細胞，促進干細胞特性而發(fā)揮作用。這些結(jié)果進一步顯示TGFBI可能作為膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點。

為了進一步探索TGFBI在GBM惡性進展中可能存在的分子機制，我們采用了GSEA 富集分析，結(jié)果顯示TGFBI 在人膠質(zhì)瘤中的作用機制可能與Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)信號通路、NOD 樣受體(Nod-like receptors，NLRs)信號通路和JAK-STAT信號通路密切相關(guān)。TLRs是一類重要的模式識別受體，參與人類自身免疫性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)TLRs 和相關(guān)的信號通路能夠介導(dǎo)膠質(zhì)瘤和其微環(huán)境中浸潤的巨噬細胞之間的相互作用，聯(lián)合激活巨噬細胞中TLR3/9可以更有效的抑制膠質(zhì)瘤的惡性進展[24]。故而我們推測TGFBI可能由M2型巨噬細胞自分泌后與自身TLRs 結(jié)合從而調(diào)控膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為。NLRs同樣是一種胞內(nèi)模式識別受體，在介導(dǎo)免疫和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[25]。已有研究報道NLRs參與膠質(zhì)瘤血管生成[26]并且Nod樣受體家族的分子NLRP3可通過白介素-1β和NF-κB通路促進膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲[27]，提示TGFBI 可能通過與NLRs相互作用參與膠質(zhì)瘤的惡性進展。TLRs和NLRs均是啟動固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵分子，因此我們推測TGFBI 可能通過影響膠質(zhì)瘤的免疫微環(huán)境或者系統(tǒng)或局部的免疫反應(yīng)參與調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)行為，具體作用機制需要進一步通過實驗驗證。JAK-STAT 信號通路在個體發(fā)育、細胞分化和維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面至關(guān)重要，該通路的失調(diào)通常與人類惡性腫瘤相關(guān)[28]。近來有研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT 通路參與免疫調(diào)節(jié)過程，包括對腫瘤細胞的識別和介導(dǎo)腫瘤細胞的免疫逃逸。Henrik 等[29]發(fā)現(xiàn)抑制膠質(zhì)母細胞瘤反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞中JAK-STAT 通路后可以將促炎/抗炎的平衡轉(zhuǎn)向促炎環(huán)境，提示TGFBI 可能通過該通路影響微環(huán)境而對膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為進行調(diào)控，這些結(jié)果為后續(xù)研究TGFBI如何影響膠質(zhì)瘤惡性進展提供了方向。

綜上所述，我們的研究強調(diào)了TGFBI 表達水平的升高與高的腫瘤分級和較差的腫瘤預(yù)后有關(guān)，同時體外實驗證實了TGFBI 的高表達能夠促進膠質(zhì)瘤細胞惡性增殖，增強其侵襲性，抑制凋亡和改變細胞周期的作用。然而TGFBI 對促進膠質(zhì)瘤惡性進展的機制尚需進一步探索，此外，對于TGFBI 的促癌作用尚需在人腦的其他細胞系、膠質(zhì)瘤原代細胞和體內(nèi)動物實驗中獲得更多的實驗證據(jù)加以證實。