龔福愷，劉佳麗，張石蕾*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；3.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)作為生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶，能催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)水解為膽堿和乙酸，從而終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，阻斷神經(jīng)信號的傳遞[1]。所以AChE 活性升高會導(dǎo)致乙酰膽堿水平降低，而乙酰膽堿減少是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病如重癥肌無力、青光眼及阿爾茨海默病的關(guān)鍵病因，因此抑制乙酰膽堿酯酶活性提高乙酰膽堿水平是治療重癥肌無力、青光眼及阿爾茨海默病的重要方法[2-6]。目前美國食品和藥品監(jiān)督管理局(Food And Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于治療阿爾茨海默病的AChE 抑制劑主要有他克林、多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏[7]。除加蘭他敏外，大多數(shù)為合成藥物，雖然有一定的治療效果，但具有頭暈、失眠、惡心、輕度腹瀉等不同程度的副作用，不適于患者長期使用。因此，尋求高效低毒、適宜患者長期使用的天然來源AChE 抑制劑對治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。

本課題組基于前期肉蓯蓉對阿爾茨海默病、癌因性疲勞及肝纖維化的治療作用，研制出防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中藥復(fù)方——肉蓯蓉復(fù)方制劑，由肉蓯蓉、人參、黃芪3 種藥物組成。眾所周知，因為中藥復(fù)方成分復(fù)雜，多靶標(biāo)，系統(tǒng)龐大，所以從混合物體系開展研究其對機體的作用難度極大。而利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)從大數(shù)據(jù)中找到我們需要的化合物組成成分，靶標(biāo)等有效信息是非常實用的。其中，分子對接技術(shù)是一種基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計數(shù)據(jù)挖掘方法，是基于鑰匙理論，通過研究配體與受體(生物大分子)之間的相互作用，預(yù)測二者結(jié)合模式和親和力進(jìn)而從分子層面解釋配體作用機制的方法。表面等離子共振(surface plasmon resonance，SPR)是一種免標(biāo)記型光學(xué)生物傳感方法，在研究生物分子相互作用方面具有獨特優(yōu)勢，其具有微量化、高靈敏、通用性好及實時快速等優(yōu)點，還可同時獲得相互作用過程的動力學(xué)和熱力學(xué)信息，便于在模擬生理條件下探究分子相互作用的整個過程[8]。

綜上，本研究擬利用分子對接技術(shù)進(jìn)行AChE 天然產(chǎn)物小分子抑制劑的虛擬篩選，從肉蓯蓉、人參、黃芪3 種藥物中獲得最佳候選小分子。之后，通過SPR 技術(shù)驗證活性成分及AChE 親和力，以期為后續(xù)體內(nèi)外機制探究，指明方向，還有望提高研發(fā)效率，為天然產(chǎn)物小分子抑制劑的研究開發(fā)提供啟示。

1 材料與方法

1.1 試 劑

槲皮素、山奈酚均購于北京索萊寶科技有限公司；染料木素購于上海源葉生物科技有限公司；鼠源乙酰膽堿酯酶蛋白購于北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2 儀 器

OpenSPRTM 生物分子相互作用分析系統(tǒng)和Sensor Chip COOH芯片，均購自于Nicoya公司。

1.3 肉蓯蓉復(fù)方制劑數(shù)據(jù)庫的建立

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)是基于中藥材系統(tǒng)藥理學(xué)的框架而構(gòu)建的中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(https://tcmspw.com/index.php)。我們從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載肉蓯蓉、人參以及黃芪這3 種中藥所含化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并用ISIS 軟件去除重復(fù)、合并化合物，最后分別建立肉蓯蓉、人參以及黃芪這3種中藥的數(shù)據(jù)庫。

1.4 化合物與AChE蛋白的半柔性虛擬分子對接

1.4.1 Glide 分子對接試驗對于Glide 對接，利用Maestro suite 里的蛋白質(zhì)制備向?qū)?protein preparation wizard，PPW)工具進(jìn)行蛋白的準(zhǔn)備。先用Maestro suite 直接下載質(zhì)子化晶體蛋白結(jié)構(gòu)(https://www.rcsb.org/)，在OPLS2005力場中進(jìn)行能量最小化，填補loop和側(cè)鏈，刪除不需要的鏈、水分子及小分子，并對隨機加的H進(jìn)行基于氫鍵的重新分布，刪除形成氫鍵少于3的水分子。在PPW準(zhǔn)備好蛋白后，打開受體格點生產(chǎn)面板，根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)里面的小分子配體自動產(chǎn)生對接的結(jié)合位點。在格點文件產(chǎn)生后進(jìn)行對接，并在配體對接的面板中，選擇精度最高的XP 對接模式。最終保留10個對接打分的結(jié)果。

1.4.2 能量評分我們利用專業(yè)化學(xué)對接軟件Rosetta，將蛋白質(zhì)與多肽分子，進(jìn)行柔性對接，得到初步的對接位相結(jié)構(gòu)。在對接中，對每一個體系都將產(chǎn)生至少100 個對接結(jié)果。最后，從100 個對接位相中，挑選對接能量最好的對接結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)提取，用于后續(xù)的SPR親和力檢測。

1.5 SPR技術(shù)測定活性成分與AChE蛋白的親和力

1.5.1 蛋白芯片固定通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)將蛋白偶聯(lián)活化固定在COOH 芯片上，然后根據(jù)蛋白的等電點篩選蛋白質(zhì)固定在COOH 芯片的最佳pH 值(4.0、4.5、5.0、5.5)和濃度(20、50、100 μg/mL)，以確保較多的蛋白固定于蛋白芯片上，其蛋白質(zhì)的偶聯(lián)包括3 步：EDC/NHS 的活化；蛋白質(zhì)的偶聯(lián)；乙醇胺封閉蛋白質(zhì)多余的結(jié)合位點。

1.5.2 化合物檢測液配制根據(jù)肉蓯蓉、人參和黃芪3 種化合物的能量評分結(jié)果，精密稱取槲皮素、山奈酚和染料木素對照品，分別以二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解制成對照品貯備液。取各對照品儲備液，加入PBS 溶液稀釋100 倍，再用含1% DMSO 的PBS 溶液(pH=7.4)稀釋成濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L 的對照品溶液。配體蛋白用HEPES 緩沖液稀釋。

1.5.3 親和力檢測設(shè)定結(jié)合目標(biāo)蛋白的流通池為檢測通道，未結(jié)合目標(biāo)蛋白的流通池為參比通道，開始以最大流速(150 μL/min)運行，檢測緩沖液為HEPES。達(dá)到信號基線穩(wěn)定后，對樣本環(huán)運用緩沖液沖洗，進(jìn)行排空。在信號達(dá)到基線后，調(diào)整緩沖液流速到20 μL/min。上樣 EDC/NHS(1∶1)溶液激活芯片。上樣激活緩沖液稀釋的200 μL 的配體運行4 min，結(jié)合穩(wěn)定之后，緩沖液沖洗樣本環(huán)。上樣200 μL封閉溶液，緩沖液沖洗樣本環(huán)，并用空氣排空。為確保穩(wěn)定，觀察基線5 min。分析物用緩沖液稀釋，以 20 μL/min 上樣，上樣的濃度為3.125、6.25、12.5、25 和50 μmol/L，蛋白與配體結(jié)合時間均為240 s，自然解離時間為360 s。

1.5.4 親和曲線擬合進(jìn)樣完成后，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，親和曲線擬合用TraceDrawer (Ridgeview Instruments AB，Sweden)軟件進(jìn)行評估，將穩(wěn)態(tài)親和力模型(1∶1)用于曲線擬合。繪制靶點蛋白與單體化合物的結(jié)合曲線，即SPR光譜圖，并且計算獲得動力學(xué)參數(shù)如結(jié)合速率常數(shù)ka[1/(M*s)]、解離速率常數(shù)kd(1/s)及解離平衡常數(shù)KD(M)，也叫親和力常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Glide分子對接結(jié)果

使用Rosetta 軟件分別獲得75、330 及87 個肉蓯蓉、人參和黃芪活性分子，與AChE 相互作用的結(jié)合能量，以及對接得分見表1。結(jié)合最為穩(wěn)定的肉蓯蓉活性物質(zhì)為槲皮素、染料木素、8-表馬錢子苷酸；人參活性物質(zhì)為N-亞水楊基水楊胺、山奈酚、葉酸；黃芪活性物質(zhì)為槲皮素、異鼠李素、山奈酚。這表明槲皮素、染料木素及山奈酚可能為AChE 蛋白的配體物質(zhì)，依據(jù)對接得分絕對值排名前3 位篩選出這3 個化合物作為對接最佳活性分子進(jìn)行下一步研究。AChE蛋白結(jié)構(gòu)與其小分子結(jié)合空腔見圖1。

表1 肉蓯蓉、人參和黃芪活性成分的Glide對接能量和評分

圖1 AChE蛋白結(jié)構(gòu)與AChE蛋白小分子結(jié)合空腔

2.2 對接能量排名靠前的分子體系結(jié)合模式

用PoseView 分析槲皮素與AChE 蛋白的對接結(jié)果，其對接得分為-9.397 kcal/mol，Glide 對接能量為-63.914 kcal/mol，槲皮素與AChE 蛋白作用的結(jié)合模式見圖2，氨基酸殘基為TYR449、ASP74、SER125、TRP86、TYR72；山奈酚與AChE 蛋白作用的結(jié)合模式見圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山奈酚與AChE蛋白作用的氨基酸殘基為SER125、TYR72、TYR337、TRP86、HIS447，其總的對接得分為-9.006，Glide 對接能量為-58.255。同上，染料木素與AChE 蛋白作用的結(jié)合模式見圖4，氨基酸殘基為ASP74、TYR124、TRP86、GLH202，其對接得分為-8.066，Glide對接能量為-34.421。

圖2 肉蓯蓉成分排名前5位的分子體系結(jié)合模式

2.3 SPR親和力檢測

采用SPR生物傳感器檢測活性成分槲皮素、山奈酚、染料木素與AChE 蛋白之間的親和力，結(jié)果顯示，山奈酚的解離常數(shù)Kd 值較小，各親和力參數(shù)如表2所示，3個化合物與AChE蛋白反應(yīng)作出的擬合曲線中，槲皮素、山奈酚、染料木素與AChE 蛋白親和力均較好，如圖5～7所示。

圖5 乙酰膽堿酯酶和槲皮素的濃度梯度結(jié)合曲線

圖6 乙酰膽堿酯酶和山奈酚的濃度梯度結(jié)合曲線

圖7 乙酰膽堿酯酶和染料木素的濃度梯度結(jié)合曲線

3 討論

天然產(chǎn)物是指人和動物體內(nèi)許多內(nèi)源性的化學(xué)成分、動植物提取物或昆蟲、海洋生物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物，是天然酶抑制劑的重要來源之一，嗎啡、阿司匹林、喜樹堿、紫杉醇和青蒿素等批準(zhǔn)藥物均是直接來源于植物或衍生于植物藥。ACh是一種人體內(nèi)常見的神經(jīng)遞質(zhì)，主要作用是傳遞神經(jīng)之間的電信號，在人腦內(nèi)也具有相似的作用。人腦神經(jīng)之間正常量的ACh 可以維持正常的腦活動，而AChE 就是處理前者的物質(zhì)，使其維持在正常的范圍內(nèi)[9]。但是在阿爾茨海默病患者的腦內(nèi)，可觀測到AChE 的含量明顯增加，導(dǎo)致ACh 的含量減少，人腦的神經(jīng)活動減弱，表現(xiàn)為認(rèn)知障礙。AChE 抑制劑可以抑制膽堿酯酶，阻止ACh的水解，從而提高突觸間隙中ACh的濃度水平，增加對突觸后膜上膽堿受體的刺激，最終提高阿爾茨海默病患者的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力[10]。他克林、加蘭他敏、多奈哌齊以及利凡斯的明均是常見的膽堿酯酶抑制劑。他克林是第一個獲得美國FDA批準(zhǔn)用于治療阿爾茨海默病的藥物，屬于吖啶類非選擇性AChE 抑制劑，但是因為具有外周膽堿能刺激和肝臟毒性作用，臨床使用受到很大限制。因此，從天然產(chǎn)物中篩選出具有有效、低毒和價廉等特點的AChE抑制劑意義重大。

肉蓯蓉可以補充腎臟的精氣和陰陽不足，人參對維持人體正常生命活動有益，黃芪可以補氣和增加機體功能，故本課題組研制出防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中藥復(fù)方——肉蓯蓉復(fù)方制劑，并發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉、人參、黃芪對一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有很好的治療效果。Chen等[11]通過建立大鼠骨質(zhì)疏松癥合并阿爾茨海默病模型，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉可以提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增加大鼠的骨密度，進(jìn)而同時治療骨質(zhì)疏松癥與阿爾茨海默病。王永炎院士通過多年臨床實踐基礎(chǔ)研發(fā)出復(fù)方蓯蓉益智膠囊(荷葉、肉蓯蓉和漏蘆)，在北京、天津等多家醫(yī)院對阿爾茨海默病患者治療后發(fā)現(xiàn)該中成藥能夠改患者認(rèn)知功能[12-13]。Luo等[14]通過體內(nèi)外實驗證實了人參具有神經(jīng)保護(hù)作用。劉建春等[15]利用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55 肽段誘導(dǎo)建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型，通過HE 染色，Western blot 等手段檢測黃芪總皂苷對脊髓炎性細(xì)胞浸潤，髓鞘脫失情況及中樞神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF 和GAP-43 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)黃芪總皂苷干預(yù)可改善局部神經(jīng)組織生長的微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)類物質(zhì)的表達(dá)，從而減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病程度。

AChE 抑制劑可作為多種神經(jīng)性疾病的一線治療藥物，是抗重癥肌無力、青光眼及阿爾茨海默病的重要靶點。為此，我們擬針對AChE，發(fā)掘天然產(chǎn)物小分子抑制劑。首先，我們整合多個平臺數(shù)據(jù)，構(gòu)建了肉蓯蓉、人參和黃芪這3 味藥物的天然產(chǎn)物小分子虛擬數(shù)據(jù)庫。之后，通過分子對接虛擬篩選技術(shù)，從幾百個化合物中，成功篩選出了30個最佳的候選天然產(chǎn)物小分子抑制劑。根據(jù)篩選出的實驗結(jié)果，重點考察了槲皮素、山奈酚及染料木素等3 個化合物，結(jié)果顯示它們的結(jié)合能量均遠(yuǎn)高于已報道的抑制劑，而且類藥性也遠(yuǎn)大于常用閾值，顯然它們將是AChE 抑制劑開發(fā)的重點研究對象。

基于分子對接藥物篩選的結(jié)果，我們選取肉蓯蓉、人參和黃芪3味藥物中結(jié)合能量及打分最高的1～2個單體化合物作為研究對象，采用SPR技術(shù)對AChE與槲皮素、山奈酚及染料木素進(jìn)行親和力檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個單體化合物均可以與AChE顯示出較好的結(jié)合力。現(xiàn)有的報道證實了SPR 的結(jié)果，槲皮素可通過上調(diào)/激活SIRT1 和抑制/失活A(yù)ChE 來防止氯化鎘誘導(dǎo)的海馬損傷和記憶喪失[16]。山奈酚可通過GSK3β-Nrf2信號通路，降低AChE 活性發(fā)揮對毒死蜱所致大鼠氧化應(yīng)激和記憶障礙的神經(jīng)保護(hù)作用[17]。同樣，染料木素可通過降低大鼠海馬組織中AChE 活性，發(fā)揮抗氧化和抗炎作用減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知損傷[18]。這些研究也從側(cè)面驗證了SPR 實驗的有效性。

綜上所述，本研究一方面通過分子對接進(jìn)行藥物篩選，獲得了槲皮素、山奈酚及染料木素等數(shù)個候選的AChE 天然產(chǎn)物小分子抑制劑。另一方面，運用了SPR 技術(shù)對分子對接虛擬篩選的結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步的親和力檢測。雖然，分子對接藥物篩選和SPR親和力檢測研究能夠從大量的天然產(chǎn)物中快速地篩選出候選藥物并初步揭示藥物發(fā)揮作用的機制。但是，還需要借助分子生物學(xué)、細(xì)胞、動物實驗和臨床試驗進(jìn)行進(jìn)一步的確證實驗。本研究為后續(xù)AChE 抑制劑的篩選評價及天然產(chǎn)物小分子抑制劑的研究開發(fā)提供思考和啟示，也為天然AChE 抑制劑防治多種神經(jīng)性疾病提供了初步的實驗依據(jù)。