趙立然，卜 梁*

(1.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院胸外科，福建 廈門 361100；2.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361100)

食管癌是世界上常見的癌癥之一[1]，是世界上第8常見的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第6 大原因。因其具有較強的侵襲、遷移能力和較差的預(yù)后，5 年生存率僅為15%～25%[2]。食管癌的危險因素包含環(huán)境、遺傳和表觀遺傳因素，如吸煙和飲酒，以及改變細(xì)胞生長的表觀遺傳和遺傳調(diào)節(jié)的變化[3]。食管癌早期通常無癥狀，但單獨吞咽困難或伴有體質(zhì)量意外減輕是最常見的癥狀。由于早期診斷的篩查方法不夠有效，大多數(shù)人在確診時失去了根治性切除的機會[4]。此外，長期服用抗癌藥物(包括順鉑)的患者通常會出現(xiàn)耐藥性，也會導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)?；?、放療和手術(shù)治療后仍有許多患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)[5]。新的治療方法和腫瘤分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對確定治療靶點和改善患者預(yù)后具有重要意義。因此，研究食管癌的病理機制，尋找早期檢測標(biāo)志物，提高患者的生存時間和預(yù)后迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

選取GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中食管癌的基因表達(dá)譜芯片GSE38129[6]和GSE20347[7]。GSE38129 包含30 例食管癌組織樣本，30 例癌旁正常組織樣本。GSE20347 包含17 例食管癌組織樣本，17例癌旁正常組織樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理

使用GEOquery 包在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中下載兩個食管癌芯片數(shù)據(jù)集GSE38129，GSE20347。首先對兩個芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合，再用R 語言中的sva 包去除批次效應(yīng)，然后對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。進(jìn)一步，對標(biāo)準(zhǔn)化后的基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，使用Limma 包，設(shè)置差異表達(dá)基因(differently expressed genes，DEGs)閾值為|log2(FC)|>1.5 且P<0.01 進(jìn)行篩選，以降低假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，F(xiàn)C指基因表達(dá)的差異倍數(shù)(fold change)。

1.3 DEGs的富集分析

利用clusterProfiler包對上調(diào)和下調(diào)DEGs分別進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選出的DEGs導(dǎo)入STRING(https://cn.string-db.org/)網(wǎng)站，進(jìn)行權(quán)重算法分析并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，選取combined score≥0.9(highest confidence)作為納入標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件，應(yīng)用MCODE 及CytoHubba 插件提取核心模塊及Hub gene。

1.5 關(guān)鍵基因在UALCAN 數(shù)據(jù)庫里的信息檢索與表達(dá)差異分析

分析DEGs 在多種腫瘤中的表達(dá)情況，及其在食管癌和正常組織中的表達(dá)水平以及與分期、性別、年齡、TP53 突變的關(guān)系，并探索DGEs 表達(dá)與自身啟動子甲基化水平的關(guān)系。篩選步驟為：①UALCAN 網(wǎng)站輸入關(guān)鍵基因名稱；②探索泛癌視圖，查看食管癌和其他癌癥中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況；③探索關(guān)鍵基因在該數(shù)據(jù)庫納入的食管癌患者與正常人群中的表達(dá)，選擇分期、性別、年齡、啟動子甲基化水平、TP53突變選項分析。

1.6 關(guān)鍵基因表達(dá)與疾病預(yù)后相關(guān)性

使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫對經(jīng)UALCAN 數(shù)據(jù)庫篩選出的相關(guān)基因在食管癌患者和正常人群中的表達(dá)再次驗證，繪制Kaplan-Meier 生存曲線，探究關(guān)鍵基因表達(dá)是否影響食管癌患者的預(yù)后。

2 結(jié)果

2.1 評價批次效應(yīng)去除結(jié)果、評估標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集合理性與DEGs篩選結(jié)果

A：部分?jǐn)?shù)據(jù)集單個樣本表達(dá)量；B：部分標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集單個樣本表達(dá)量.

R語言中的sva包對數(shù)據(jù)集去除批次效應(yīng)后得到標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集，使用箱線圖來評估批次效應(yīng)去除效果，標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集樣本表達(dá)量分布情況比原始數(shù)據(jù)集更加集中，部分標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集與數(shù)據(jù)集中單個樣本表達(dá)量的數(shù)據(jù)如圖1 所示。對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析(PCA)，如圖2顯示該數(shù)據(jù)集中食管癌組與正常對照組組間差異大，絕大部分組內(nèi)差異較小在正常誤差范圍內(nèi)，從而可進(jìn)一步分析。在標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集GSE38129_GSE20347 中，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2(FC)|>1.5且P<0.01，共篩選出390個顯著差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因166 個，下調(diào)基因224 個。根據(jù)篩選出的390 個顯著差異基因，利用Volcano Plot 包繪制火山圖，對這些基因進(jìn)行可視化展示如圖3 所示。在上調(diào)和下調(diào)基因中挑選log2(FC)降序排名前10 基因，繪制差異基因聚類熱圖進(jìn)行可視化展示如圖4。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集的主成分分析

圖3 390個顯著差異基因火山圖

圖4 差異基因聚類熱圖

2.2 DEGs的GO和KEGG富集分析

對上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，GO 分析表明上調(diào)基因參與的生物進(jìn)程有：有絲分裂細(xì)胞周期相變、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織生成等，下調(diào)基因與表皮發(fā)育、角質(zhì)細(xì)胞分化、皮膚發(fā)展等功能密切相關(guān)(均為P<0.05)，部分上、下調(diào)基因分別GO富集結(jié)果的信息見表1，部分DEGs的GO富集結(jié)果如分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)可視化見圖5。

圖5 部分差異基因的GO分析結(jié)果

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、阿米巴病等信號通路(均為P<0.05)，部分上調(diào)基因的KEGG 富集信號通路可視化如圖6 所示。下調(diào)基因主要與視黃醇代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、5-羥色胺能神經(jīng)突觸等信號通路密切相關(guān)(均為P<0.05)，部分下調(diào)基因的KEGG 富集信號通路可視化如圖7 所示。部分上、下調(diào)基因分別KEGG富集結(jié)果的信息見表2。

表2 食管癌組織差異基因KEGG富集分析結(jié)果

圖6 上調(diào)差異基因KEGG分析結(jié)果

圖7 下調(diào)差異基因KEGG分析結(jié)果

2.3 DEGs的PPI、中心模塊及核心基因篩選

將DEGs 導(dǎo)入STRING 網(wǎng)站構(gòu)建PPI，得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件，使用MCODE 插件，對所得網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行提取分析，得到了4 個中心模塊，選最主要的模塊分析，使用CytoHubba 中的MCC 算法，篩選出評分最高的前20 個核心基因(CDK1、ASPM、TOP2A、AURKA、CCNB2、CDC20、AURKB、NUSAP1、KIF20A、BUB1、DLGAP5、TPX2、BUB1B、KIF2C、NDC80、PBK、TTK、NEK2、PRC1、KIF4A)，它們之間的關(guān)系如圖8 所示，基因間聯(lián)系密切，可能在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起著協(xié)同作用。

圖8 20個關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 CDK1、TOP2A、AURKA在GEPIA與UALCAN數(shù)據(jù)庫里的表達(dá)差異分析

在UALCAN數(shù)據(jù)庫中對這20個關(guān)鍵基因進(jìn)行泛癌驗證，篩選出CDK1、TOP2A、AURKA在食管癌中的表達(dá)顯著高于正常組織(均為P<0.05，見圖9A、10A、11A)。在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，CDK1、TOP2A、AURKA在食管癌中的表達(dá)也顯著升高(均為P<0.05，見圖9B、10B、11B)。在UALCAN 數(shù)據(jù)庫中，CDK1、TOP2A、AURKA與正常組織比較，在I～I(xiàn)V期表達(dá)均升高，且各期與正常組織表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖12A～C)。表達(dá)在性別、年齡、TP53 突變狀態(tài)方面與正常組織比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，性別分類見圖12D～F，年齡分類見圖12G～I(xiàn)，TP53突變狀態(tài)分類見圖12J～L)，甲基化分析結(jié)果顯示，食管癌組織中CDK1、TOP2A、AURKA啟動子甲基化表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖13A～C)。以上指標(biāo)均證明CDK1、TOP2A、AURKA與食管癌的發(fā)展有關(guān)。

圖9 CDK1在食管癌腫瘤組織和正常組織的表達(dá)差異

圖10 TOP2A在食管癌腫瘤組織和正常組織的表達(dá)差異

圖12 CDK1、TOP2A、AURKA表達(dá)水平與臨床資料相關(guān)性

圖13 CDK1、TOP2A、AURKA在腫瘤組織和正常組織中的啟動子甲基化水平

2.5 生存分析

把UALCAN 得到的相關(guān)基因輸入GPEPIA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示CDK1、AURKA與食管癌預(yù)后密切相關(guān)，CDK1高表達(dá)組總生存期(overall survival，OS)顯著低于低表達(dá)組(HR=1.8，P=0.036，見圖14A)，AURKA高表達(dá)組OS 亦顯著低于低表達(dá)組(HR=2，P=0.033，見圖14A)，利用芯片數(shù)據(jù)集GSE70409 對3 個基因進(jìn)行再次驗證，CDK1、TOP2A、AURKA在食管腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，與標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集趨勢表現(xiàn)一致(見表3)。

表3 食管癌中CDK1、TOP2A及AURKA在3個數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)

圖14 CDK1、TOP2A、AURKA表達(dá)水平與食管癌預(yù)后的生存曲線

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)方法，對食管癌基因芯片GSE38129、GSE20347 進(jìn)行整合并標(biāo)準(zhǔn)化處理，共得到390個DEGs，其中166個上調(diào)，224個下調(diào)。GO和KEGG 富集分析結(jié)果顯示上調(diào)基因涉及有絲分裂細(xì)胞周期相變、細(xì)胞外基質(zhì)組織構(gòu)成等功能以及細(xì)胞周期、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用等信號通路。下調(diào)基因與表皮發(fā)育、角質(zhì)細(xì)胞分化等功能和5-羥色胺能神經(jīng)突觸等信號通路密切相關(guān)。通過PPI和cytohubba 插件選出20 個關(guān)鍵基因，在UALCAN 和GEPIA 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行表達(dá)差異分析及生存分析驗證，顯示基因CDK1、TOP2A及AURKA可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)屬于蛋白激酶家族成員一種；其中，CDK1通過G2/M期轉(zhuǎn)變和激活同源重組(HR)DNA修復(fù)途徑在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。癌細(xì)胞以永久性增殖、分裂，不受控制為特點，因此CDK1 在其生存中充當(dāng)著不可替代的角色。細(xì)胞周期中有序的G2/M 轉(zhuǎn)換由CDK1/CCNB 復(fù)合物控制。CDK1 參與多種癌癥的發(fā)展，例如乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肝癌等。Zou 等[8]研究表明CDK1 中mRNA 表達(dá)在包括HCC 在內(nèi)的多種腫瘤組織中上調(diào)。CDK1 的高表達(dá)與HCC 患者的較差預(yù)后相關(guān)，CDK1 較低的啟動子甲基化可能導(dǎo)致HCC腫瘤組織中較高的表達(dá)水平。目前，已經(jīng)開發(fā)了多種用于癌癥治療的CDK1 抑制劑，這些抑制劑可誘導(dǎo)延長的G2 停滯和/或使細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞中的DNA 損傷劑敏感，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。CDK1 藥物抑制劑包括：Rigosertib(III 期)、BEY-1107(II 期)等，藥物臨床適應(yīng)癥主要集中在胰腺癌和膠質(zhì)瘤[10]。文獻(xiàn)顯示，食管癌中的CDK1明顯上調(diào)，BIRC5可能通過影響細(xì)胞周期通路在ESCC 中發(fā)揮重要作用，而CDK1 可能是該通路的樞紐基因[11]。而本研究也發(fā)現(xiàn)CDK1 在食管癌中的表達(dá)明顯上調(diào)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致，但有關(guān)CDK1 在食管癌中的實驗及藥物研究并未見報道，需要開展進(jìn)一步研究予以驗證。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II Alpha(TOP2A)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，是復(fù)制過程的核心，已發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中失調(diào)。TOP2A是染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的保守調(diào)節(jié)劑，可催化可逆的DNA 雙鏈斷裂(DSB)，對于在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和細(xì)胞分裂等多種動態(tài)過程中維持基因組完整性至關(guān)重要。有研究表明TOP2A在乳腺癌組織中高度過表達(dá)，TOP2A的過表達(dá)與較差的總生存期和無復(fù)發(fā)生存期相關(guān)[12]。此外，TOP2A 顯示與腫瘤間質(zhì)高度相關(guān)，尤其是與骨髓來源的抑制細(xì)胞。Liu等[13]研究發(fā)現(xiàn)MDM4 和TOP2A 相互結(jié)合并在翻譯后表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致TOP2A 蛋白穩(wěn)定、p53 抑制和腫瘤細(xì)胞增殖增加，揭示了MDM4和TOP2A的新功能以及它們在腫瘤發(fā)生中的相互作用，表明抑制MDM4-TOP2A相互作用可能代表了一種新的策略，可以特異性并同時靶向TOP2A 和MDM4 進(jìn)行癌癥治療。Hailati 等[14]通過生物信息學(xué)分析得出TOP2A 可能為食管癌患者診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶(aurora kinase A，AURKA)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其激活對于通過調(diào)節(jié)有絲分裂的細(xì)胞分裂過程是必需的。Aurora 激酶家族由三種絲氨酸/蘇氨酸激酶Aurora-A/B/C 組成。其中，Aurora-A和Aurora-B在有絲分裂中發(fā)揮核心作用，而Aurora-C 在減數(shù)分裂中發(fā)揮獨特作用。激酶的過度表達(dá)或基因擴(kuò)增已在廣泛的人類惡性腫瘤中得到報道，如AURKA 的異常擴(kuò)增表達(dá)與人類結(jié)直腸癌、肺癌和白血病的化療耐藥密切相關(guān)[15]，表明它們在腫瘤發(fā)生中作為有效致癌基因的作用。目前已經(jīng)產(chǎn)生了許多激酶抑制劑(AKI)；其中一些正在接受臨床評估。AURKA 的過表達(dá)已被證明會導(dǎo)致染色體畸變和基因組不穩(wěn)定[16]。細(xì)胞實驗證實，USP3和AURKA在ESCC細(xì)胞中的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。有研究報道了AURKA在人ESCC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，這種上調(diào)導(dǎo)致預(yù)后不良[18]。Aurora-A 可能在多西他賽化療敏感性中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)可能是ESCC的潛在治療靶點[19]。

差異基因的GO 功能和KEGG 富集分析顯示、有絲分裂細(xì)胞周期相變、表皮發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞周期、阿米巴病等信號通路與食管癌的發(fā)生、發(fā)展機制有著密切的聯(lián)系。本文局限之處在于，未對這些基因?qū)τ谑彻馨┑木唧w臨床意義進(jìn)行深究和驗證，但本研究為食管癌發(fā)病機制的研究提供了新的思路，后續(xù)將開展進(jìn)一步的實驗驗證。