唐映紅，文 雯，李佳娜，龍 圓，陳建榮

（1.湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.長(zhǎng)沙學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410022；3.常德市人工智能與生物醫(yī)藥研究中心，湖南 常德 415000；4.常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心，湖南 常德 415000）

多花蘭（Cymbidium floribundumLindl.）又稱蜜蜂蘭，是蘭科（Orchidaceae）蘭屬（CymbidiumSw.）的一種附生植物，是《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》附錄二物種中的一員，是國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)野生植物，國(guó)內(nèi)多花蘭主要分布在浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、海南、重慶、貴州、云南等地［1］。多花蘭葉革質(zhì)肥厚，具有光澤，花芽易分化，花朵多達(dá)40 朵以上，色澤鮮艷，花期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值極高［2］。多花蘭根可作藥用，滋陰清肺，化痰止咳［3］。多花蘭株型、花朵數(shù)及花色等均有豐富的變異，能耐高溫和低溫，《國(guó)際蘭花新品種名錄（New Orchid Hybrids）》和國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蘭屬原生種的雜交利用情況均顯示多花蘭雜種數(shù)量排在前5 名［4］，其在雜交育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值。然而，由于生境退化或喪失、砍伐或直接采挖等，實(shí)際的開發(fā)水平使多花蘭種群在過(guò)去10 年減少大于30%［1］，野生多花蘭植物資源急劇減少，加強(qiáng)野生多花蘭及其他蘭科植物的保護(hù)和種質(zhì)資源的保存迫在眉睫［5］。

目前，我國(guó)栽培的國(guó)蘭品種絕大多數(shù)都是由野生種類引種馴化而來(lái)。蘭科以分株繁殖為主，但繁殖速度慢；蘭科種子很小，內(nèi)含一些發(fā)育不完全的球形胚，無(wú)胚乳，自然狀態(tài)下很難萌發(fā)。自種子無(wú)菌萌發(fā)技術(shù)如建蘭［Cymbidium ensifolium（L.）Sw.］［6］、蕙蘭（Cymbidium faberiRolfe）［7］、蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphroditeH.G.Reichenbach）［8］等獲得成功后，已建立起部分蘭科植物的快繁體系，部分品種已達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)階段，并已逐漸深入分子研究方面［9，10］。目前無(wú)多花蘭種質(zhì)資源保存方案的報(bào)道，有關(guān)多花蘭種子無(wú)菌萌發(fā)和組織培養(yǎng)有少量報(bào)道，但培養(yǎng)基中除了添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，還多添加辣木（Moringa oleiferaLam.）葉汁、枸杞（Lycium chinenseMiller）葉汁、椰汁等營(yíng)養(yǎng)劑［11，12］，或硝酸銀或香蕉（Musa nanaLour.）等［13］，或采用升汞消毒種子，加大了繁殖成本和環(huán)境污染。因此，本研究以獲得的一種野生多花蘭蒴果為材料，研究其種子無(wú)菌萌發(fā)、原球莖增殖和出芽、芽生根的培養(yǎng)方案，擬建立和優(yōu)化多花蘭快速繁殖體系，并利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行常規(guī)繼代培養(yǎng)保存其種質(zhì)資源，為多花蘭種苗工廠化生產(chǎn)、多花蘭科研者的野外回歸工作提供重要保障，對(duì)多花蘭野生資源的保護(hù)和保存具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野生多花蘭發(fā)現(xiàn)于湖南省桑植縣野外常綠闊葉林下（圖1A， B），由中南林業(yè)科技大學(xué)劉昂鑒定［14］，采其接近成熟且未開裂的蒴果（圖1C， D）為外植體。

1.2 方法

1.2.1 種子無(wú)菌萌發(fā)

將多花蘭蒴果用自來(lái)水沖洗后，先用75%乙醇浸泡3 min；再用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡10 min；然后無(wú)菌水浸泡沖洗6 次，每次1～2 min；最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，將蒴果兩端切去，剖開果實(shí)，分成多份數(shù)量相同的種子，均勻撒在培養(yǎng)基中。種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：花寶一號(hào)（Hyponex，HP） +4.00 g·L-1蛋白胨（Peptone） + 0.10 g·L-1活性炭（Activated carbon， AC） + 瓊脂（Agar），其中HP 有4 個(gè)水平：2.00、3.00、4.00 和5.00 g·L-1；瓊脂有2 個(gè)水平5.00 和7.00 g·L-1。每個(gè)處理4 次重復(fù)，隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)，記錄種子的污染情況、萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)數(shù)量和種子形態(tài)變化。

1.2.2 原球莖增殖培養(yǎng)

以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)α-萘乙酸（α-Naphthalene acetic acid， NAA）、6-芐基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine， 6-BA）和水解乳蛋白（Lactalbumin hydrolysate， LH）3 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)4 個(gè)水平，NAA 濃度為0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA和LH 濃度均為0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)處理2次重復(fù)，隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)增殖率（%） = 增殖的原球莖個(gè)數(shù) / 接種的原球莖個(gè)數(shù) × 100。

1.2.3 原球莖分化出芽培養(yǎng)

以原球莖為材料、1/2 MS 為基本培養(yǎng)基，添加NAA 濃度為0.01、0.50 和1.00 mg·L-1，6-BA 濃度為1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，每個(gè)處理3 次重復(fù)，隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計(jì)單個(gè)原球莖的出芽個(gè)數(shù)。

1.2.4 多花蘭種質(zhì)資源的保存

將多花蘭原球莖分化出的芽，轉(zhuǎn)接到保存培養(yǎng)基中。以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基（含7.00 g·L-1瓊脂和20.00 g·L-1蔗糖），NAA 濃度為0.00、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1，6-BA 和LH 濃度均為0.00、1.00、2.00 和3.00 mg·L-1，設(shè)計(jì)16 組試驗(yàn)，每個(gè)處理2 次重復(fù)，隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)。統(tǒng)計(jì)芽增殖倍數(shù) = 增殖后的芽個(gè)數(shù) / 接種的芽個(gè)數(shù)、芽生根率（%） = 生根的芽數(shù) / 接種的芽數(shù) × 100、芽生長(zhǎng)高度。

1.2.5 培養(yǎng)條件

除特殊說(shuō)明外，上述培養(yǎng)基中均含30.00 g·L-1蔗糖，5.00 g·L-1瓊脂，pH值為5.4～5.6，培養(yǎng)溫度25 ±1℃，光照時(shí)間為白天/黑夜12 h / 12 h，光照強(qiáng)度為1 000 Lx。種子萌發(fā)先置于黑暗下培養(yǎng)30 d 后，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000 Lx。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)種子無(wú)菌萌發(fā)的影響

F 測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示（表1），各因子的效應(yīng)主次為HP ＞ 瓊脂，其中瓊脂的效應(yīng)無(wú)顯著性。顯著性測(cè)驗(yàn)顯示，HP 的4 個(gè)水平差異顯著，以3.00 g·L-1種子萌發(fā)效果最佳，種子萌發(fā)數(shù)量為43.88，顯著高于其他水平，其他3 個(gè)水平之間無(wú)顯著差異。HP 與瓊脂存在互作，以處理組3種子萌發(fā)效果最佳，最適培養(yǎng)基為：3.00 g·L-1HP + 4.00 g·L-1蛋白胨 + 0.10 g·L-1AC +5.00 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)60 d 后種子萌發(fā)數(shù)量為55.25（萌發(fā)率約55.00%）（表2）。乳白色種子膨大形成淺綠色或深綠色的圓球（圖1E），然后將圓球轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)30 d 后，大部分綠色圓球形成愈傷組織（圖1F）或原球莖（圖1G）。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)種子無(wú)菌萌發(fā)的方差分析Tab.1 Variance analysis of different medium on aseptic germination of seeds

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)種子無(wú)菌萌發(fā)的影響（培養(yǎng)60 d）Tab.2 Effects of different medium on aseptic germination of seeds（60 d）

2.2 不同激素及其配比對(duì)原球莖增殖的影響

F 測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示（表3），各因子的效應(yīng)主次為NAA ＞ 6-BA ＞ LH，各因子的效果均極顯著。

表3 6-BA、NAA和LH對(duì)原球莖增殖的方差分析Tab.3 Variance analysis of NAA， 6-BA and LH on protocorm proliferation

各效應(yīng)顯著性測(cè)驗(yàn)顯示，NAA、6-BA 和LH 的4個(gè)水平均差異顯著，均以1.00 mg·L-1增殖效果最好，顯著高于其他水平（表4）。不同激素濃度配比間產(chǎn)生正互作使得增殖率升高，以處理組9增殖率最高，達(dá)94.00%，顯著高于其他處理組（表5），且原球莖基部膨大，原球莖增殖明顯、較大且緊促（圖2A）。其次為處理組11，增殖率約81.50%，且個(gè)別原球莖有少量出芽（圖2B）。不同激素濃度配比間產(chǎn)生負(fù)互作使得增殖率下降，處理組8 僅為1.25%，僅1/2 MS培養(yǎng)基則無(wú)增殖（圖2C）。綜上所述，多花蘭原球莖增殖的最適培養(yǎng)基為：1/2 MS + 1.00 mg·L-1NAA +2.00 g·L-1LH，培養(yǎng)30 d增殖率達(dá)94.00%。

圖2 多花蘭原球莖增殖培養(yǎng)Fig.2 Propagation culture of protocorm of C. floribundum

2.3 6-BA 和NAA 及其配比對(duì)原球莖分化出芽的影響

根據(jù)前期原球莖增殖有出芽情況的研究基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)6-BA和NAA 2個(gè)因素3個(gè)水平的原球莖分化出芽培養(yǎng)方案。F測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示（表6），各因子的效應(yīng)主次為NAA ＞ 6-BA，其中6-BA的效應(yīng)無(wú)顯著性。

表6 6-BA和NAA對(duì)原球莖分化出芽的方差分析Tab.6 Variance analysis of NAA and 6-BA on protocorm budding

顯著性測(cè)驗(yàn)顯示，NAA的3個(gè)水平差異顯著，對(duì)原球莖分化出芽的效果呈先增后減的趨勢(shì)，以0.50 mg·L-1出芽效果最好，單個(gè)原球莖分化約5 個(gè)芽，顯著高于其他水平。6-BA 和NAA 之間存在互作效應(yīng)，以處理組4分化出的芽數(shù)最多，單個(gè)原球莖分化約8個(gè)芽（表7）。綜上所述，多花蘭原球莖分化出芽的最適培養(yǎng)基為：1/2 MS + 0.50 mg·L-1NAA +1.00 mg·L-16-BA，培養(yǎng)7 d 后，單個(gè)原球莖同時(shí)分化出多個(gè)芽點(diǎn)（圖3A），培養(yǎng)30 d 后，芽伸長(zhǎng)約1～2 cm（圖3B）。培養(yǎng)30 d后更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，原球莖增殖并不斷分化出新的芽，芽葉片展開（圖3C）。

圖3 多花蘭原球莖分化出芽的培養(yǎng)過(guò)程Fig.3 Process of protocorm differentiation and budding of C.floribundum

表7 不同培養(yǎng)基對(duì)原球莖分化出芽的影響（培養(yǎng)30 d）Tab.7 Effects of different media on protocorm budding（30 d）

2.4 多花蘭種質(zhì)資源的保存研究

不同處理對(duì)芽生根、增殖和伸長(zhǎng)均表現(xiàn)出極顯著。培養(yǎng)5 個(gè)月后，處理13 對(duì)芽生根和伸長(zhǎng)效果均較好，芽生根率為92.50%、芽增殖倍數(shù)約為8.50、芽伸長(zhǎng)約4.35 cm；處理9 芽增殖效果最好，增殖倍數(shù)約為9.07。僅1/2 MS 的培養(yǎng)基芽生根率和芽伸長(zhǎng)均是最低的，且無(wú)芽增殖情況（表8）。因此，綜合考慮，選擇多花蘭組培苗保存的最適培養(yǎng)基為1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA。將單個(gè)芽（圖4A）接種在最適保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)前3 個(gè)月，芽生長(zhǎng)較快，芽伸長(zhǎng)4 cm 左右，之后開始出現(xiàn)根點(diǎn)（圖4B），芽增殖和伸長(zhǎng)較慢，根點(diǎn)不斷伸長(zhǎng)，培養(yǎng)5 個(gè)月之后根伸長(zhǎng)約1 cm，根呈乳白色或淺綠色（圖4C）。直至6 個(gè)月后組培苗因營(yíng)養(yǎng)不夠的原因，開始慢慢褐化死亡，因此6 個(gè)月后應(yīng)及時(shí)更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)保存組培苗。此外，最適保存培養(yǎng)基中加入1.00 g·L-1AC 時(shí)，芽增殖和生根率基本保存不變，但芽生根時(shí)間縮短為30 d，基部形成的根較長(zhǎng)，呈深綠色（圖4D）。

圖4 多花蘭種質(zhì)資源的保存Fig.4 Conservation of Germplasm Resources of C. floribundum

3 討論

從古至今，我國(guó)栽培蘭花已有2000 年的歷史，盡管歷史悠久，但由于某些蘭花的人工栽培體系至今還不成熟，所以對(duì)蘭花的利用基本仍是從自然界直接索取獲得。因此，加強(qiáng)對(duì)蘭科植物的研究至關(guān)重要［15］。根據(jù)蘭花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需求，著重從種質(zhì)資源創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)兩個(gè)方面開展工作，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)培育和保存種質(zhì)資源是一種有效的方式［16］。目前已經(jīng)有70 個(gè)屬的蘭花植物可采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，大量洋蘭的組織培養(yǎng)和工廠化得到了發(fā)展，部分國(guó)蘭也在組織培養(yǎng)方面的研究取得了很大的成功［15］。有關(guān)多花蘭組織培養(yǎng)研究報(bào)道較早，其野生種質(zhì)資源的快速繁殖缺乏研究報(bào)道。本研究從種子的無(wú)菌萌發(fā)到獲得組培苗進(jìn)行快速繁殖。多花蘭種子從接種到胚開始轉(zhuǎn)綠的培養(yǎng)時(shí)間為60 d，相比唐鳳鸞等［17］研究的多花蘭種子萌發(fā)時(shí)間縮短30 d 左右、萌發(fā)率差異不大。值得注意的是本研究多花蘭原球莖分化出芽途徑是小球體經(jīng)原球莖發(fā)育成小苗，與冬鳳蘭（Cymbidium dayanumRchb.F）和多花脆蘭等類似，但比多花脆蘭［Acampe rigida（Buch.-Ham.ex J.E.Smith） P.F.Hunt］形成小球體（40～45 d）培養(yǎng)時(shí)間短［18］，不同于其他大多數(shù)蘭科的根狀莖分化出芽途徑。最優(yōu)多花蘭增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d 后的原球莖增殖率為90.00%（增殖倍數(shù)約9），相比已報(bào)道的多花蘭原球莖增殖培養(yǎng)基，如：王鄭昊等［11］培養(yǎng)90 d增殖倍數(shù)5.50、唐鳳鸞等［17］培養(yǎng)的增殖倍數(shù)6.5倍/60 d、丁長(zhǎng)春等［13］培養(yǎng)的增殖率82.00%/60 d，本研究在增殖倍數(shù)和增殖時(shí)間上得到明顯優(yōu)化。本研究獲得的最優(yōu)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d左右生根率達(dá)92.50%，比唐鳳鸞等［17］培養(yǎng)50 d生根率100%的生根時(shí)間要縮短較多。

蘭科種質(zhì)資源的保存主要有栽培保存、離體保存（無(wú)菌保存）、花藥、種子和DNA 保存等形式［21］，有低溫、玻璃化保存等技術(shù)［22，23］。但不管哪種保存形式都有其優(yōu)點(diǎn)和缺陷，較為理性的的保存方式則是結(jié)合栽培保存和離體保存，通過(guò)栽培保存的方式為離體保存提供穩(wěn)定保存品種特性的材料，為離體保存材料的更新提供保障；通過(guò)離體保存節(jié)約種質(zhì)資源圃所需要的空間、人員等投入，同時(shí)也能夠?yàn)樗耘嗟姆N質(zhì)材料提供更新?lián)Q代的材料［21］。目前關(guān)于多花蘭種質(zhì)資源的保存缺乏報(bào)道。本研究獲得的保存培養(yǎng)基1/2 MS + 2.00 mg·L-1NAA（含7g·L-1瓊脂和20 g·L-1蔗糖），不同于與大多數(shù)其他蘭科的保存培養(yǎng)基，如鐵皮石斛（Dendrobium candidumLindl.）、苞舌蘭（Spathoglottis pubescensLindl.）使用1/2 MS，獨(dú)蒜蘭［Pleione bulbocodioides（Franch.） Rolfe］則為MS + 1 mg/L BA + 2 mg/L NAA + 0.5 g/L AC［22］。

此外，本研究篩選的培養(yǎng)基僅使用基本培養(yǎng)基添加6-BA、NAA 和/或LH［24］，相比其他研究中除了添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑外，還不同程度的添加了馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）水煮液、硝酸鑭、硝酸銀、椰乳、椰汁和活性炭等其他試劑［2，11，13，17］，大大減少了繁育成本。

4 結(jié)論

綜上所述，一方面，相比已報(bào)道的其他蘭科的組培快繁技術(shù)，本研究建立的多花蘭組培快繁體系，在種子萌發(fā)、原球莖增殖和分化出芽、芽生根等的時(shí)間和數(shù)量上均得到一定的優(yōu)化，從種子萌發(fā)到獲得大量組培苗僅需120 d左右，種子萌發(fā)途徑也不同于大多數(shù)蘭科，大大減少了繁育成本，降低了對(duì)環(huán)境的污染，為多花蘭種苗工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)。另一方面，獲得了多花蘭叢生芽同時(shí)緩慢生長(zhǎng)、增殖和生根的培養(yǎng)方案，能夠保證1顆叢生芽在50 mL培養(yǎng)基中生長(zhǎng)6 個(gè)月左右，并獲得約10 棵的多花蘭組培苗，保證了多花蘭種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存，對(duì)多花蘭野生資源的保護(hù)和保存具有重要意義。