唐愛存， 馬家寶， 賴克道， 劉金花， 盧秋玉

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 廣西 南寧 530023； 2.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022； 3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)部， 廣西 南寧 530021）

目前，隨著我國生育政策的變化，越來越多的家庭選擇二胎或三胎，但受環(huán)境污染、工作壓力、生活方式改變等因素的影響，男性的生育能力逐漸下降，這一矛盾嚴(yán)重影響了社會(huì)穩(wěn)定和家庭和睦，同時(shí)也影響國家人口政策的實(shí)施。其中少弱精子癥是男性不育最常見的原因之一，目前其機(jī)制尚未完全闡明。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是維持雄性動(dòng)物正常生殖生理的重要生殖細(xì)胞之一，具有營養(yǎng)和支持生殖細(xì)胞、合成分泌雄性激素、促進(jìn)精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育等作用。研究表明，氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損的重要原因之一，因此，抑制損傷細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，保護(hù)氧化損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能，對(duì)提高生育率具有重要的臨床意義[1]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是分泌和產(chǎn)生睪酮的主要細(xì)胞。研究表明，氧化應(yīng)激能引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷，從而引起睪酮等雄性激素分泌減少，影響精子發(fā)育[2]。另外，睪酮合成受睪酮合成酶的調(diào)控。研究表明，類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）、P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc）、17β - 羥基固醇脫氫酶（17β -hydroxysteroid dehydrogenase, 17β-HSD）是睪酮合成與分泌的關(guān)鍵酶[3]。參杞強(qiáng)精顆粒由黨參、枸杞子、黃芪、菟絲子、五味子、當(dāng)歸等組成，具有補(bǔ)腎健脾、活血養(yǎng)血、清熱利濕、增強(qiáng)免疫作用，其傳統(tǒng)湯劑已在臨床應(yīng)用10 年以上，是治療少弱精癥的有效方劑。前期研究發(fā)現(xiàn)，參杞強(qiáng)精傳統(tǒng)湯劑對(duì)少弱精子癥有較好的療效，能顯著提高少弱精子癥患者的精子密度、活力及活率[4-5]。能夠降低環(huán)磷酰胺所致脾腎兩虛型睪丸生精障礙模型小鼠的生精細(xì)胞凋亡率，修復(fù)睪丸的病理損傷，恢復(fù)其生精功能[6]。但其在H2O2誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用方面未見報(bào)道，因此，本研究采用H2O2誘導(dǎo)損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，探討參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)H2O2誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與藥物

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，本研究室自行傳代培養(yǎng)，維生素E 軟膠囊由浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)（批號(hào)：H33020187），參杞強(qiáng)精顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供（批號(hào)：20210915，中藥民族藥制劑備案號(hào)：桂藥制備字Z20200023000，每1 g 顆粒相當(dāng)于原生藥2 g），實(shí)驗(yàn)時(shí)采用純化蒸餾水超聲溶解，經(jīng)0.22 μm 孔徑濾膜過濾除菌，再用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）購自美國Gibco 公司，胰蛋白酶和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Amersco 公司，CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol 試劑購自美國Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑購自德國Thermo 公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，SYBR 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa 公司，RIPA裂解液（含1 %蛋白酶抑制劑）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，過氧化氫H2O2購于廣東南國藥業(yè)有限公司，睪酮、一氧化氮NO、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）、8- 羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-deoxyguanosine, 8-OHdG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase, GST）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）及總抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAOC）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

Model 311 型二氧化碳孵箱（美國Thermo Forma公司），XD-101 型倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰生物科技有限公司），722S 型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ABI 9700 型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀，Model 450 型自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司），Tanon 5200 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），TGL-16G-A 型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 TM3 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS 的DMEM 作為培養(yǎng)液，將TM3 細(xì)胞置于37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長情況，每兩天更換1 次細(xì)胞培養(yǎng)液，采用0.25%胰酶對(duì)長滿細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 MTT 法檢測(cè)參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)TM3 細(xì)胞的毒性作用 采用0.25%胰酶將對(duì)數(shù)生長期TM3 細(xì)胞消化制成濃度為1×105/mL 的細(xì)胞懸液，并接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于37 ℃，5%二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 貼壁后，丟棄培養(yǎng)液，加入含參杞強(qiáng)精顆粒的給藥組，終濃度分別為0.05、0.50、2.50、5.00 和10.00 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)在37 ℃，5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)4 h，吸棄全部上清液，再在每孔加入二甲亞砜（Dimethylsulphoxide, DMSO）200 μL，在微量振蕩器上振蕩5 min，最后在酶標(biāo)儀450 nm 波長處測(cè)定吸光度值，測(cè)定各組細(xì)胞活力。

1.4.3 H2O2損傷模型的構(gòu)建及藥物濃度篩選 參照參考文獻(xiàn)[7]和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用0.25 %胰酶將對(duì)數(shù)生長期TM3 細(xì)胞消化制成濃度為1×105/mL 的細(xì)胞懸液，并接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分為8 組，每組6 個(gè)復(fù)孔，分別為正常組、H2O2損傷模型組、陽性對(duì)照組（10 μg/mL 維生素E）、參杞強(qiáng)精顆粒組（0.05、0.40、0.80、1.60、5.00 mg/mL），置于37 ℃，5%二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 貼壁后，丟棄培養(yǎng)液，正常組換用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，其余各組加入終濃度為500 μmol/L H2O2完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷模型，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄全部上清液，正常組和模型組加入200 μL 完全培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組加入終濃度10 μg/mL 維生素E 的培養(yǎng)液，其余給藥組加入等體積終濃度分別為0.05、0.40、0.80、1.60 和5.00 mg/mL 的參杞強(qiáng)精顆粒藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后置37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后采用自動(dòng)酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長為450 nm）檢測(cè)各組OD 值，篩選最佳給藥濃度。

1.4.4 分組給藥 采用0.25%胰酶將對(duì)數(shù)生長期TM3 細(xì)胞消化制成濃度為1×105/mL 的細(xì)胞懸液，并接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，分為5 組，分別為正常組、H2O2損傷模型組、參杞強(qiáng)精顆粒低中高劑量組（0.4、0.8 和1.6 mg/mL），每組6 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%二氧化碳孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 貼壁后，丟棄培養(yǎng)液，正常組換用含10 %胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，模型組和參杞強(qiáng)精顆粒給藥組加入終濃度為500 μmol/L H2O2完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷模型，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄全部上清液，正常組和模型組加入200 μL 完全培養(yǎng)液，其余給藥組加入等體積終濃度分別為0.4，0.8 和1.6 mg/mL 的參杞強(qiáng)精顆粒藥液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞上清液和細(xì)胞，待后續(xù)進(jìn)一步檢測(cè)。

1.4.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST 的活性 按照1.4.4 復(fù)制H2O2損傷模型并分組給藥，收集各組細(xì)胞上清液，同時(shí)根據(jù)睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST試劑盒說明書配置好相關(guān)工作液，向稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品中加入各組細(xì)胞上清液50 μL，混勻后于恒溫水浴鍋中溫育0.5 h，分別加入50 μL 酶標(biāo)志物、顯色劑A 和顯色劑B 各50 μL，混勻后，37 ℃避光顯色15 min，最后加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長處吸光度值。

1.4.6 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC 的含量 按照1.4.4 復(fù)制H2O2損傷模型并分組給藥，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后，去上清液，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，4 000 r /min 離心5 min 收集細(xì)胞，采用超聲破碎法收集各組細(xì)胞裂解液，2 500 r /min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說明書方法（同1.4.5 ELISA 操作方法），分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC 的含量。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA 表達(dá) 按照1.4.4 復(fù)制H2O2損傷模型并分組給藥，連續(xù)培養(yǎng)24 h后，去上清液，胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，4 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA 純度及濃度，并將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq（2×）10 μL，正向引物（10 μmol/L）0.2 μL，反向引物（10 μmol/L）0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ROX reference dye（50×）0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)中StAR、P450scc、17β-HSD 基因的引物設(shè)計(jì)合成及驗(yàn)證均由大連寶生生物工程有限公司完成。以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析各基因在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。各引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)正常TM3細(xì)胞毒性作用

MTT 結(jié)果顯示，各組細(xì)胞存活率的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，參杞強(qiáng)精顆粒在濃度為0.05～2.50 mg/mL 時(shí)對(duì)正常TM3 細(xì)胞增殖活性無明顯毒性作用（P＞0.05）；當(dāng)參杞強(qiáng)精顆粒濃度為5.00～10.00 mg/mL 時(shí)對(duì)正常TM3 細(xì)胞增殖活性有一定的毒性作用（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)正常TM3細(xì)胞毒性的影響（±s）

表2 不同濃度參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)正常TM3細(xì)胞毒性的影響（±s）

注 ： ?與正常組比較，P ＜0.05。

組別正常組參杞強(qiáng)精顆粒0.05 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.50 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒2.50 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒5.00 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒10.00 mg/mL F 值P 值OD值0.98±0.08 1.02±0.12 0.94±0.09 0.92±0.08 0.79±0.06?0.68±0.07?108.655 0.000

2.2 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)H2O2損傷的TM3細(xì)胞增殖活力的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞存活率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，H2O2損傷模型組中TM3 細(xì)胞增殖活力下降（P＜0.05），與H2O2損傷模型組比較，參杞強(qiáng)精顆粒在濃度為0.05～5.00 mg/mL 時(shí)能提高TM3 細(xì)胞的增殖活力（P＜0.05），且在0.05～1.60 mg/mL 范圍內(nèi)，TM3 細(xì)胞的增殖活力隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)（見表3）。后續(xù)藥效試驗(yàn)選擇0.40、0.80 和1.60 mg/mL作為參杞強(qiáng)精顆粒低劑量組、中劑量組和高劑量組。

表3 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)H2O2損傷的TM3細(xì)胞增殖活力的影響 （±s）

表3 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)H2O2損傷的TM3細(xì)胞增殖活力的影響 （±s）

注 ： ①與正常組比較，P ＜0.05； ②與H2O2損傷模型組比較，P ＜0.05。

OD值0.92±0.08 0.40±0.03①0.86±0.07②0.61±0.06②0.65±0.05②0.76±0.08②0.85±0.09②0.77±0.07②125.227 0.000組別正常組H2O2損傷模型組維生素E 10 μg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.05 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒1.60 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒5.00 mg/mL F 值P 值

2.3 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)細(xì)胞上清液中睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST活性影響

ELISA 結(jié)果顯示，各組細(xì)胞上清液中睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST 活性比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，H2O2損傷模型組睪酮水平、NO 含量、GST 活性降低（P＜0.05），LDH 和8-OHdG 含量升高（P＜0.05）；與H2O2損傷模型組比較，參杞強(qiáng)精顆粒各劑量組均能提高睪酮水平、NO 含量（P＜0.05），增加GST 活性（P＜0.05），同時(shí)降低LDH 和8-OHdG 含量（P＜0.05）；參杞強(qiáng)精顆粒低、中、高劑量組（0.40、0.80 和1.60 mg/mL）兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)上清液中睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST活性影響 （±s）

表4 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)上清液中睪酮、NO、LDH、8-OHdG、GST活性影響 （±s）

注 ： ①與正常組比較，P ＜0.05； ②與H2O2損傷模型組比較，P ＜0.05； ③與參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL 組比較，P ＜0.05； ④與參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL組比較，P ＜0.05。

組別正常組H2O2損傷模型組參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒1.60 mg/mL F 值P 值NO/（μmol/mL）8.22±0.79 4.79±0.50①5.26±0.46①②6.63±0.61①②③7.94±0.80①②③④104.854 0.000 LDH/（u/mL）50.13±5.07 136.77±15.01①91.09±9.38①②80.04±9.05①②③65.33±5.82①②③④174.338 0.000 GST/（u/mL）45.66±4.73 20.71±2.11①29.56±3.06①②35.88±4.13①②③40.05±4.46①②③④155.219 0.000睪酮/（ng/mL）4.85±0.54 2.06±0.16①2.99±0.31①②3.81±0.35①②③4.07±0.39①②③④91.006 0.000 8-OHdG/（ng/mL）5.25±0.49 12.17±1.63①9.01±0.88①②7.83±0.74①②③6.14±0.65①②③④115.960 0.000

2.4 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC含量的影響

ELISA 結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC 含量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，H2O2損傷模型組細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA 含量均升高（P＜0.05），CAT、SOD 和總抗TAOC 的活性均下降（P＜0.05）；與H2O2損傷模型組比較，參杞強(qiáng)精顆粒各劑量組均降低細(xì)胞內(nèi)ROS 和MDA 含量（P＜0.05），均增強(qiáng)CAT、SOD 和TAOC 的活性（P＜0.05）；參杞強(qiáng)精顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組（0.40、0.80 和1.60 mg/mL）兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC含量的影響 （±s）

表5 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、CAT、SOD、TAOC含量的影響 （±s）

注 ： ①與正常組比較，P ＜0.05； ②與H2O2損傷模型組比較，P ＜0.05； ③與參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL 組比較，P ＜0.05； ④與參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL組比較，P ＜0.05。

組別正常組H2O2損傷模型組參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒1.60 mg/mL F 值P 值MDA/（u/mg）2.47±0.14 6.05±0.58①5.12±0.42①②4.27±0.39①②③3.03±0.35①②③④85.911 0.000 CAT/（u/mg）15.06±1.66 6.46±0.59①7.90±0.73①②9.58±0.85①②③11.87±1.22①②③④90.424 0.000 TAOC/（u/mg）18.55±2.00 9.94±1.04①11.86±1.25①②13.45±1.47①②③15.01±1.39①②③④103.553 0.000 ROS熒光強(qiáng)度/%0.82±0.06 2.57±0.21①2.09±0.17①②1.84±0.18①②③1.05±0.11①②③④73.227 0.000 SOD/（u/mg）7.25±0.71 2.76±0.30①4.09±0.39①②5.71±0.55①②③6.33±0.58①②③④80.632 0.000

2.5 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，H2O2損傷模型組中睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA 相對(duì)表達(dá)量下降（P＜0.05）；與H2O2損傷模型組比較，參杞強(qiáng)精顆粒各劑量組能提高睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA 相對(duì)表達(dá)量（P＜0.05）；參杞強(qiáng)精顆粒低、中、高劑量組（0.40、0.80 和1.60 mg/mL）兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （±s）

表6 參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 （±s）

注 ： ①與正常組比較，P ＜0.05； ②與H2O2損傷模型組比較，P ＜0.05； ③與參杞強(qiáng)精顆粒0.40 mg/mL 組比較，P ＜0.05； ④與參杞強(qiáng)精顆粒0.80 mg/mL組比較，P ＜0.05。

17β-HSD mRNA 1.00±0.06 0.61±0.06①0.69±0.07①0.82±0.06①②③0.93±0.08②③④98.611 0.000組別正常組H2O2損傷模型組參杞強(qiáng)精顆粒0.4 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒0.8 mg/mL參杞強(qiáng)精顆粒1.6 mg/mL F 值P 值StAR mRNA 1.00±0.05 0.50±0.07①0.70±0.06①②0.83±0.08①②③0.91±0.08①②③④90.153 0.000 P450scc mRNA 1.00±0.04 0.42±0.05①0.64±0.07①②0.77±0.09①②③0.89±0.07①②③④115.866 0.000

3 討論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸中一種能特異性產(chǎn)生男性雄激素的細(xì)胞，受垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的間質(zhì)細(xì)胞刺激素的作用，可促進(jìn)精子的發(fā)生和男性生殖器官發(fā)育，并維持第二性征和性功能[8]。氧化應(yīng)激是細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。研究表明，睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一[9]。因此，通過抑制氧化應(yīng)激損傷及清除睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)活性氧，對(duì)保護(hù)睪丸間質(zhì)細(xì)胞具有重要意義。

H2O2是機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)生的一種ROS，是機(jī)體自由基產(chǎn)生的重要環(huán)節(jié)，在正常的生理?xiàng)l件下，機(jī)體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除維持正常生理平衡，當(dāng)在病理?xiàng)l件下，這種正常平衡被打破，導(dǎo)致大量ROS 的產(chǎn)生，引發(fā)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，使機(jī)體長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而氧化細(xì)胞DNA、脂類、蛋白質(zhì)等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致某些酶失活，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能損傷[10]。目前TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的模型主要有H2O2誘導(dǎo)、重金屬誘導(dǎo)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH）誘導(dǎo)等，其中，H2O2誘導(dǎo)是最為常見且成熟的模型，其作為一種ROS，能抑制細(xì)胞增殖，造成細(xì)胞內(nèi)大分子氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老、死亡、突變等嚴(yán)重后果。因此，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型普遍用于探究自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷機(jī)制及抗氧化劑對(duì)氧化損傷的保護(hù)和修復(fù)機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)研究表明在給予500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷睪丸間質(zhì)細(xì)胞4 h 后，TM3 細(xì)胞分泌睪酮的功能逐漸下降，細(xì)胞內(nèi)ROS 增加，引起氧化應(yīng)激和過氧化損傷。

睪酮又稱睪丸素，是男性最重要的雄激素，男性睪酮全部在睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體內(nèi)合成，具有促進(jìn)生殖器官發(fā)育和生長，維持男性第二性征發(fā)育，同時(shí)維持前列腺和精囊生精功能的作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和骨骼生長。研究表明，睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮是一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果[11]。睪酮合成酶主要包括StAR、P450scc、17β-HSD，其中P450scc 在線粒體是睪酮合成的關(guān)鍵限速酶，而StAR 主要將睪酮的前體膽固醇從線粒體膜外轉(zhuǎn)運(yùn)至膜內(nèi)[12]，17β-HSD 在靶組織中起著甾體類激素受體前調(diào)節(jié)的分子開關(guān)作用，其能催化睪酮的類固醇激素生物合成，促進(jìn)睪酮合成。本研究結(jié)果表明，參杞強(qiáng)精顆粒能明顯提高TM3 細(xì)胞存活率，提高細(xì)胞上清液睪酮水平，且能提高睪酮合成酶StAR、P450scc、17β-HSD mRNA 相對(duì)表達(dá)量。8-OHdG 是ROS 自由基如羥自由基、單線態(tài)氧等攻擊DNA 分子中的鳥嘌呤堿基第8 位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，其作為內(nèi)源性及外源性因素對(duì)DNA 氧化損傷作用的生物標(biāo)志物，其含量的高低是評(píng)估體內(nèi)氧化損傷程度，以及氧化應(yīng)激與DNA損傷相互關(guān)系的重要指標(biāo)之一[13]。本研究結(jié)果顯示參杞強(qiáng)精顆粒能顯著降低8-OHdG 含量，表明其能改善TM3 細(xì)胞氧化應(yīng)激及過氧化損傷。

以上研究結(jié)果表明，參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)正常TM3細(xì)胞無毒性作用，參杞強(qiáng)精顆粒對(duì)H2O2誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基、抗氧化應(yīng)激損傷及促進(jìn)睪酮合成有關(guān)。本研究為睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致男性不育的臨床治療提供了新思路，為參杞強(qiáng)精顆粒在臨床的開發(fā)應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。