張曉瑩，王家軍，朱春艷，劉張淮，張熒熒，張洮

（寶應(yīng)縣農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

中華草龜（Chinemys reevesii），又名烏龜、金龜、泥龜、長(zhǎng)壽龜，有延年益壽、吉祥的寓意。屬于爬行綱（Reptilia），龜鱉目（Testudine），龜科（Emydidae），是我國(guó)分布最廣、數(shù)量最多的一種龜，因其具有生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)和具有觀賞性等特點(diǎn)，養(yǎng)殖前景十分廣闊。但隨著中華草龜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，各類疾病也日益增多。目前已有研究從患病中華草龜，分離出維氏氣單胞菌（Aeromonas Veronii）[1]、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[2]、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）[3]、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[4]、遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）[5]等病原菌。產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium），是一類革蘭陰性菌，為條件致病菌，是一種高度耐藥的細(xì)菌，目前已從患腐皮病的中華鱉潰爛處[6]、烏鱧肝腎等組織[7]分離出產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes），從鯽的脾臟分離出金黃桿菌（Chryseobacterium）[8]。伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）是Kim 等[9]在2005 年提出的新菌屬，歸屬于黃桿菌科（Flavobacteriaceae），為條件致病菌，廣泛存在于水、土壤等自然環(huán)境中；伊麗莎白菌屬包括米爾伊麗莎白菌（E. miricola）、按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）、腦膜敗血伊麗莎白菌（E. meningoseptica）等，可引起人類腦膜炎、敗血癥和肺炎等疾病[9]。該菌屬已從烏鱧[10]、中華鱘[11]、中華鱉[12]以及蛙類[13-16]體分離出來(lái)，感染該菌后，導(dǎo)致動(dòng)物的肝臟、脾臟和腎臟組織損害嚴(yán)重[10-12]。伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）引起的人類細(xì)菌感染，在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，尤其是按蚊伊麗莎白菌（E.anophelis）引起的感染[17]，目前已疑似在患病烏鱧身上分離出該菌[10]。按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）是一類革蘭陰性菌，在我國(guó)主要分布在秦嶺-淮河線以南濕潤(rùn)地區(qū)，而濕潤(rùn)的亞熱帶氣候區(qū)的北移，可能會(huì)導(dǎo)致該菌在我國(guó)分布范圍更廣[18]。現(xiàn)對(duì)患病的中華草龜進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為中華草龜細(xì)菌性疾病的防治和針對(duì)性治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

患病中華草龜攝食量較少，眼球明顯突出，眼部有膿血水滲出。

1.1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；DNA 提取試劑盒、Premix Taq Version 2.0均購(gòu)自TaKaRa 公司；ddH2O 及引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；測(cè)序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；細(xì)菌鑒定板購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；動(dòng)物用藥敏檢測(cè)分析試劑盒購(gòu)自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

1.1.3 儀器

BSC-1300A2 生物安全柜（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱（揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司）、THZ-82B 型空氣搖床（上海梅香儀器有限公司）、BG25 干式恒溫器（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、MIKRO 200R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich 科學(xué)儀器有限公司）、BD PhoenixSpecTM比濁儀（Becton Dickinson & Company）、CFX96 Real-Time PCR 儀（Bio-Rad）、BG-Power 600 型電泳儀（BayGene）、Tanon 3500B 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）及BD 半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（Becton Dickinson & Company）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，使用無(wú)菌接種環(huán)，蘸取中華草龜眼部病灶部位，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，共接種3 個(gè)平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑選形態(tài)大小一致的優(yōu)勢(shì)菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)并進(jìn)行革蘭染色，共挑取2株優(yōu)勢(shì)菌，分別命名為2022-11-11-WG-1 和2022-11-11-WG-2。

1.2.2 生理生化試驗(yàn)鑒定

使用比濁儀，配制比濁度為0.5 mcf 的菌液，倒入鑒定板中，將鑒定板放入35～37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育18～24 h，將孵育完成的鑒定板取出，使用BD半自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)判讀鑒定結(jié)果。

1.2.3 16S rDNA 基因序列測(cè)定及分析

將生理生化鑒定方法與分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合[19]。將分離菌震蕩培養(yǎng)24 h 后，參考DNA 提取試劑盒操作說(shuō)明，提取純化菌株的DNA，將其作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：Premix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火15 s；72 ℃延伸10 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。一部分?jǐn)U增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。16S rDNA 序列擴(kuò)增使用通用引物，F(xiàn)：5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3'和R：5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3'，參考文獻(xiàn)[20]的方法。剩下的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行16S rDNA 基因測(cè)序。將分離株16S rDNA 測(cè)序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行blast 比對(duì)。

1.2.4 藥敏特性分析

使用動(dòng)物用藥敏分析試劑板檢測(cè)8種常見(jiàn)水產(chǎn)抗生素的藥物敏感性。挑取純化后的單個(gè)菌落于5 mL 生理鹽水中，制成0.5 mcf 濃度的菌懸液制成A 管，取2 支10 mL 的無(wú)菌生理鹽水，打開(kāi)任意一瓶，以無(wú)菌的方式向陰性對(duì)照孔中分別加入200 μL無(wú)菌生理鹽水，從A 管中吸取200 μL 菌懸液，加入10 mL 無(wú)菌生理鹽水，倒入V 型槽中。混勻后，利用微量移液器吸取V 型槽中的菌液，加入所有微孔中（陰性對(duì)照除外），每孔200 μL，將加樣好的藥敏分析試劑板，放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～28 h 后讀取結(jié)果。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：與陽(yáng)性對(duì)照孔比較，藥敏分析試劑板孔底變渾濁，為陽(yáng)性（+）；藥敏分析試劑板孔底澄明，為陰性（-）。以在微孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及菌落形態(tài)

從患病中華草龜眼部分離出兩株優(yōu)勢(shì)菌，見(jiàn)圖1（a）（b）。由圖1 可見(jiàn)，菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，2 株均為革蘭陰性菌。分離菌株培養(yǎng)24 h后，2022-11-11-WG-1 菌落形態(tài)特征為：黃色，凸起，表面光滑，邊緣整齊；2022-11-11-WG-2 菌落形態(tài)特征為：米色，表面光滑，邊緣整齊。

圖1 2株優(yōu)勢(shì)菌

2.2 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定

將2 株菌株接種到生化反應(yīng)板上，對(duì)2種菌株進(jìn)行30 項(xiàng)生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)，初步鑒定2022-11-11-WG-1 為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes），2022-11-11-WG-2 為按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）。

表1 細(xì)菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果①

2.3 16S rDNA 鑒定

將測(cè)序獲得的基因序列在NCBI 中進(jìn)行blast比對(duì)，結(jié)果表明，2022-11-11-WG-1 與金黃桿菌屬（Chryseobacteriumsp.）相似性為99%（登錄號(hào)：MH801979）；2022-11-11-WG-2 與按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）（登錄號(hào)：OQ210041）和米爾伊麗莎白菌（E. miricola）（登錄號(hào)：CP115634）的序列相似性均為99%。

綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特性測(cè)定及分子生物學(xué)鑒定方法，初步判定病原菌2022-11-11-WG-1 為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes），2022-11-11-WG-2 為按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）。

2.4 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)《抗微生物敏感試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI）（2019 版）》，判斷菌株對(duì)8種抗生素敏感程度。2種分離菌株對(duì)8種常見(jiàn)水產(chǎn)抗生素敏感程度見(jiàn)表2。2022-11-11-WG-1 產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes）和2022-11-11-WG-2 按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis）均對(duì)恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及鹽酸多西環(huán)素敏感，對(duì)硫酸新霉素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉及磺胺甲惡唑+甲氧芐啶具有較強(qiáng)的耐藥性。

表2 菌株藥敏特性①mg/L

3 討論

本試驗(yàn)從患病中華草龜眼部分離出產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）和按蚊伊麗莎白菌（E.anophelis）2種菌株。產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes）可引起人類肺炎、敗血癥、膿毒血癥等疾病，是人和動(dòng)物共患病原菌。產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes）耐藥范圍較廣，楊移斌等[6]建議養(yǎng)殖過(guò)程中如發(fā)現(xiàn)中華鱉感染產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes），可選用慶大霉素、新霉素或者阿莫西林內(nèi)服，并配合使用二氧化氯、漂白粉及高鐵酸鉀等外用進(jìn)行防控；王鑫毅等[7]建議使用米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、多西環(huán)素、恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等7種抗生素對(duì)烏鱧產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes）進(jìn)行治療。本試驗(yàn)從患病中華草龜眼部分離的產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C. indologenes）對(duì)恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及鹽酸多西環(huán)素敏感。

伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）能感染動(dòng)物和人類，其致病機(jī)制包括侵入宿主細(xì)胞、裂解血小板和產(chǎn)彈性蛋白酶等，該菌屬具有多重耐藥性[21]。劉曉琳等[10]從患病烏鱧身上分離出疑似按蚊伊麗莎白菌（E. anophelis），并進(jìn)行了人工回歸感染試驗(yàn)，證實(shí)該菌對(duì)烏鱧有較強(qiáng)致病性，建議將米諾環(huán)素、利福平、多西環(huán)素、磺胺異惡唑作為治療候選藥物。蔡完其等[12]從發(fā)病中華鱉肝臟分離出腦膜敗血伊麗莎白菌（E. meningoseptica）（曾被稱為腦膜炎敗血性黃桿菌），根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，配制了鱉必康Ⅲ號(hào)對(duì)其治療。李旭東等[16]從具有歪頭、破頭與白眼等癥狀的蛙體，分離出米爾伊麗莎白菌（E. miricola），該菌對(duì)青霉素、阿莫西林等19種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，僅對(duì)氟苯尼考高度敏感。本試驗(yàn)中的中華草龜，之所以會(huì)感染病原菌，可能與養(yǎng)殖過(guò)程中存在相互撕咬、投喂的飼料中存在病原菌、或者是養(yǎng)殖水體中有病原菌等有關(guān)。建議使用恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考或鹽酸多西環(huán)素，治療該患病中華草龜眼部。