孫苗苗，陸波，伏光輝，葉仁智，盧璐，路吉坤

（連云港市海洋與漁業(yè)發(fā)展促進(jìn)中心，江蘇 連云港 22200）

甲殼動(dòng)物是漁業(yè)資源的重要組成部分，種類繁多，數(shù)量龐大。其中，多數(shù)甲殼動(dòng)物物種是許多海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的重要餌料來(lái)源，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中能量流動(dòng)、物質(zhì)傳遞的重要載體，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。

白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒（Infec tious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV）、蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）、十足目虹彩病毒（Decapod iridescent virus 1,DIV1）及對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病（Acute hepatopan creatic necrosis disease, AHPND），是水生動(dòng)物二類及三類疫病病原[2]。目前，關(guān)于養(yǎng)殖的甲殼動(dòng)物病原研究報(bào)道較多。張家松等[3]開展了廣東沿海地區(qū)不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對(duì)蝦攜帶WSSV 和IHHNV的調(diào)查。范東東等[4]調(diào)查了華東、華南主要養(yǎng)殖區(qū)羅氏沼蝦IHHNV 的流行情況，發(fā)現(xiàn)IHHNV 廣泛流行, 陽(yáng)性率高達(dá)90%，但所有成年羅氏沼蝦均未表現(xiàn)出明顯的病癥，僅為病毒的攜帶。薛暉等[5]開展了淡水養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物WSSV 流行病調(diào)查，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹、克氏原螯蝦、日本沼蝦均感染W(wǎng)SSV。楊麗詩(shī)等[6]開展了3種來(lái)源野生斑節(jié)對(duì)蝦攜帶病毒情況調(diào)查，揭示3種來(lái)源的斑節(jié)對(duì)蝦親蝦普遍攜帶WSSV 和IHHNV。劉蘇等[7]對(duì)大亞灣海域的野生對(duì)蝦，進(jìn)行早期死亡綜合征病菌和白斑綜合征病毒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)早期死亡綜合征病菌攜帶率，總體處于較高水平。

近年來(lái)，我國(guó)沿海海灣面臨著日趨嚴(yán)重的環(huán)境污染壓力，水生動(dòng)物疫病頻發(fā)。現(xiàn)于2022 年11 月，對(duì)海州灣海域野生甲殼動(dòng)物攜帶病原情況進(jìn)行調(diào)查，擬為水生動(dòng)物流行病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 調(diào)查方法

1.1 材料

2022 年11 月，在海州灣海域收集捕撈甲殼動(dòng)物樣品44 個(gè)，其中鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）7 個(gè)、日本蟳（Charybdis japonica）3 個(gè)、三疣梭子蟹（Charybdis japonica）3 個(gè)、口蝦蛄（Oratosquilla oratoria）31 個(gè)。取每個(gè)樣品的肝胰腺置于裝有無(wú)水乙醇的樣品管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測(cè)方法

提取樣品DNA，采用生工生物工程（上海）股份有限公司的動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒。 白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、蝦肝腸胞蟲、十足目虹彩病毒及對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病通用引物見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 5種病原的引物序列

PCR 擴(kuò)增以病原的目的基因的載體質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，以雙蒸水作為空白對(duì)照。PCR 反應(yīng)試劑采用生工生物工程（上海）股份有限公司的2×Taq PCR Mastermix 試劑盒。WSSV 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[8]，IHHNV 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]，EHP 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[10]，DIV1 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11]，AHPND 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[12]。

反應(yīng)結(jié)束后，以0.5 mg/L 的4S GelRed 核酸染料顯帶，在1.5% 瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。陽(yáng)性產(chǎn)物，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用NCBI 網(wǎng)站的Blast 工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA

樣品DNA 提取結(jié)果見圖1。由圖1 可見，樣品條帶明顯，樣品DNA 質(zhì)量較好。

圖1 DNA 樣品瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 白斑綜合征檢測(cè)

白斑綜合征PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖2（a）（b），海州灣海域野生甲殼動(dòng)物WSSV 檢測(cè)結(jié)果見表2。由圖2 可見，陽(yáng)性樣品在1 447 bp 和941 bp 處均有條帶，陰性樣品則無(wú)此條帶。由表2 可見，鷹爪蝦、口蝦蛄陽(yáng)性樣品各1 個(gè)；第1 次PCR，僅鷹爪蝦檢出陽(yáng)性樣品1 個(gè)，第2 次PCR 口蝦蛄檢測(cè)出陽(yáng)性樣品1 個(gè)，陽(yáng)性率分別為14.29%、3.23%，日本蟳和三疣梭子蟹未檢出。

圖2 WSSV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 海州灣海域野生甲殼動(dòng)物WSSV 檢測(cè)結(jié)果

2.3 傳染性皮下及造血組織壞死病檢測(cè)

傳染性皮下及造血組織壞死病PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖3，海州灣海域野生甲殼動(dòng)物IHHNV 檢測(cè)結(jié)果見表3。由圖3 可見，陽(yáng)性樣品在389 bp 處有條帶，陰性樣品則無(wú)此條帶。由表3 可見，鷹爪蝦陽(yáng)性樣品2 個(gè)，其中1 個(gè)樣品條帶較弱，陽(yáng)性率分別為28.57%；日本蟳、三疣梭子蟹、口蝦蛄未檢出陽(yáng)性。

圖3 IHHNV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表3 海州灣海域野生甲殼動(dòng)物IHHNV 檢測(cè)結(jié)果

2.4 蝦肝腸胞蟲檢測(cè)

蝦肝腸胞蟲PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖4（a）（b），海州灣海域野生甲殼動(dòng)物EHP 檢測(cè)結(jié)果見表4。由圖4 可見，第1 次PCR 所有樣品均未擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶；第2 次PCR，在147 bp 處擴(kuò)增出條帶。由表4可見，鷹爪蝦陽(yáng)性樣品2 個(gè)，陽(yáng)性率分別為28.357%；口蝦蛄檢出陽(yáng)性樣品1 個(gè)，陽(yáng)性率為3.23%；日本蟳、三疣梭子蟹未檢出陽(yáng)性。

表4 海州灣海域野生甲殼動(dòng)物EHP 檢測(cè)結(jié)果

2.5 虹彩病毒檢測(cè)

虹彩病毒PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見圖5（a）（b），海州灣海域野生甲殼動(dòng)物DIV1 檢測(cè)結(jié)果見表5。 由圖5 可見，第1 次PCR 所有樣品均未擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶；第2 次PCR，在129 bp 處擴(kuò)增出條帶。由表5可見，鷹爪蝦陽(yáng)性樣品2 個(gè)，陽(yáng)性率分別為28.57%；口蝦蛄檢出陽(yáng)性樣品1 個(gè)，陽(yáng)性率為3.23%；日本蟳、三疣梭子蟹未檢出陽(yáng)性。

圖5 DIV1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表5 海州灣海域野生甲殼動(dòng)物DIV1 檢測(cè)結(jié)果

2.6 急性肝胰腺壞死病檢測(cè)

經(jīng)2 次PCR 擴(kuò)增，鷹爪蝦、日本蟳、三疣梭子蟹、口蝦蛄共44 個(gè)樣品均未檢出陽(yáng)性，見圖6（a）（b）。

圖6 AHPND PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

3 討論

水生動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)有多種方法，包括PCR、核酸雜交、電鏡觀察、熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等。然而PCR 以其快速、成本低、敏感等優(yōu)點(diǎn)仍然是當(dāng)前水生動(dòng)物疫病檢測(cè)的主要手段[6]。但是PCR 技術(shù)，如果引物與模板結(jié)合的特異性不夠、模板濃度過(guò)高、鎂離子濃度過(guò)高或過(guò)低等情況下也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增[13]。本調(diào)查中，PCR 擴(kuò)增特異性較好，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，說(shuō)明所用引物特異性較強(qiáng)、DNA 質(zhì)量較高、反應(yīng)體系較為優(yōu)化。

野生水生動(dòng)物攜帶病原多有發(fā)現(xiàn)，且可以通過(guò)水平和垂直方式進(jìn)行傳播。水平傳播指生物之間相互蠶食或攝食攜帶病原的生物而相互感染，垂直傳播指感染后存活下來(lái)的個(gè)體會(huì)終身攜帶病原，并可以通過(guò)繁殖的方式傳播給下一代[14]。在生產(chǎn)過(guò)程中，水生動(dòng)物苗種繁育所需親本主要為海捕的野生親本，勢(shì)必會(huì)出現(xiàn)病原垂直傳播的情況；養(yǎng)殖過(guò)程中，飛禽、浮游生物、其他甲殼動(dòng)物等可能會(huì)將病原通過(guò)水平傳播的方式感染養(yǎng)殖品種。

甲殼動(dòng)物不同病原混合感染現(xiàn)象以往研究中也有報(bào)道。Tsai 等[15]在臺(tái)灣地區(qū)的凡納濱對(duì)蝦中，檢測(cè)到WSSV 和桃拉病毒（Taura Virus, TSV）混合感染現(xiàn)象。楊衛(wèi)帆等[16]報(bào)道，養(yǎng)殖場(chǎng)的對(duì)蝦中發(fā)現(xiàn)存在WSSV 和IHHNV 混合感染。楊麗詩(shī)等[6]研究發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對(duì)蝦存在WSSV 和IHHNV 以及WSSV 和MBV 混合感染情況。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鷹爪蝦存在混合感染現(xiàn)象，其中1 個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)到DIV1 和EHP，1 個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)出WSSV、EHP 及IHHNV?？梢娂讱?dòng)物病原混合感染現(xiàn)象較為常見，給甲殼動(dòng)物疫病防控工作帶來(lái)更大挑戰(zhàn)。

4 結(jié)論

本調(diào)查44 個(gè)樣品，僅在鷹爪蝦和口蝦蛄中檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性樣品7 個(gè)，占總樣品數(shù)的15.91%；共檢出陽(yáng)性病原10 個(gè)，其中WSSV 2 個(gè)、IHHNV 2 個(gè)、EHP 3 個(gè)、DIV1 3 個(gè)。鷹爪蝦存在不同病原混合感染現(xiàn)象，其中1 個(gè)樣品同時(shí)感染了DIV1 和EHP，1 個(gè)樣品同時(shí)感染IHHNV、EHP 和WSSV。日本蟳、三疣梭子蟹均為檢出病原。