張擇揚(yáng)，張 軍，趙永旭

(1.法國詩華動物保健公司，北京 100102；2.詩華中國科學(xué)支持與診斷中心，浙江 杭州 310018)

養(yǎng)豬生產(chǎn)在本質(zhì)上是一種生產(chǎn)投資行為，如何保證有效的投資回報率，是養(yǎng)豬生產(chǎn)者應(yīng)始終關(guān)心的問題。從養(yǎng)豬成本占比來看，60%以上的成本來源于飼料投入[1]。被豬采食的飼料要想成為養(yǎng)豬生產(chǎn)者的收入來源——豬肉，都要通過豬腸道這個“加工廠”進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，豬腸道的健康直接關(guān)乎豬場的經(jīng)濟(jì)效益和投資回報率。豬腸道一旦出現(xiàn)問題，輕則營養(yǎng)物質(zhì)流失，導(dǎo)致飼料浪費；重則機(jī)體脫水消瘦，危及生命。剛出生的仔豬抵抗力較弱，該階段危害其腸道健康的重要“兇手”之一就是豬囊等孢球蟲。

1 病原及危害

導(dǎo)致初生仔豬發(fā)病的球蟲只有一種：豬囊等孢球蟲，其卵囊的形狀猶如“雙黃蛋”(圖1)，雙層外殼中包含兩個孢子囊，通過這一形態(tài)學(xué)特征可以與其他種類的球蟲進(jìn)行區(qū)分。豬囊等孢球蟲主要感染1～7 日齡哺乳仔豬，感染豬的年齡越小，引發(fā)的臨床癥狀和經(jīng)濟(jì)損失就越嚴(yán)重。而對于年齡更大的豬，如保育豬、育肥豬及后備母豬等，豬囊等孢球蟲的感染力不強(qiáng)。當(dāng)仔豬攝入有感染力的蟲卵后，一般要經(jīng)歷5 d左右的潛伏期，此階段寄生蟲體在仔豬腸道的上皮細(xì)胞中生長、繁殖，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞受損、脫落[2]。此時母乳中的蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)將無法被仔豬的腸道吸收，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)腹瀉癥狀。有研究表明，球蟲感染導(dǎo)致仔豬斷奶體重減少1 kg，達(dá)到95 kg 屠宰體重所需的時間增加9 d，經(jīng)濟(jì)損失約100 元/頭[3]。

圖1 豬囊等孢球蟲孢子化卵囊

2 材料和方法

2.1 檢測樣本

根據(jù)豬場的規(guī)模大小，選擇5～20 窩的哺乳仔豬。使用一次性聚乙烯或乳膠手套，收集產(chǎn)床上仔豬的糞便于采樣管中，每窩一管，混樣約10 g，做好標(biāo)記，其內(nèi)容包括：窩編號、采樣日期、仔豬日齡。采完一窩更換一組手套(圖2)。

圖2 標(biāo)記好的仔豬糞便樣本

本試驗是為檢測仔豬糞便樣本中的球蟲卵囊。但是，仔豬只有在感染后的第5～7 天和第12 天才會出現(xiàn)兩次排卵囊高峰，因此錯誤的采樣時段會導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陰性。為避免漏檢的情況，本試驗對7～14 日齡仔豬進(jìn)行第1 次采樣，間隔7 d 后進(jìn)行第2 次采樣(圖3)。將第1 次采樣的糞便樣本放置于2～8 ℃冰箱中保存，待完成第2 次的樣本采集后和第1 次采集的樣本按窩標(biāo)號混合送檢，全程冷鏈運輸。

2.2 檢測方法

從23 家豬場中共采集到261 份仔豬糞便樣本，將每份樣本一分為二，其中一份送往某高校檢測實驗室，由該實驗室使用漂浮顯微鏡檢法進(jìn)行檢測；另一份送詩華杭州科學(xué)支持與診斷實驗室，使用熒光定量PCR 法進(jìn)行檢測。

2.3 漂浮顯微鏡檢法

2.3.1 樣本處理

將仔豬糞便樣本加入到一個容器中，加入足夠的飽和食鹽水。

2.3.2 攪拌和過濾

將樣本和鹽水混合均勻，然后用過濾器對樣本進(jìn)行過濾，去除大顆粒物質(zhì)。

2.3.3 漂浮

將過濾后的樣本轉(zhuǎn)移到漂浮器中，隨后加入足夠的飽和食鹽水，使樣本在鹽水中漂浮。

2.3.4 觀察和檢測

用顯微鏡觀察漂浮在鹽水表面的顆粒，檢測是否存在球蟲卵或幼蟲。

2.4 熒光定量PCR 法

2.4.1 樣本收集

從疑似感染球蟲的仔豬糞便樣本中收集適量的樣本。

2.4.2 DNA 提取

使用商業(yè)化的Power Fecal DNA (QIAGEN的試劑盒，從糞便樣本中提取球蟲的DNA。

2.4.3 PCR 反應(yīng)體系準(zhǔn)備

準(zhǔn)備PCR 反應(yīng)混合液，包括使用球蟲線粒體和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed space，ITS)基因設(shè)計的引物、DNA 模板、聚合酶和缺失核苷酸。

2.4.4 PCR 反應(yīng)

將PCR 反應(yīng)混合液置于PCR 儀QuantStudio 3(Thermo Scientific)中，進(jìn)行一系列的溫度循環(huán)，包括DNA 變性、引物結(jié)合和DNA 擴(kuò)增等步驟。

數(shù)據(jù)讀取，根據(jù)電腦推送結(jié)果，得出試驗數(shù)據(jù)。

3 結(jié)果與討論

檢測結(jié)果顯示，采用漂浮顯微鏡檢法，豬場陽性率為22%，仔豬糞便樣本陽性率為3%；采用熒光定量PCR 法，豬場陽性率為78%；仔豬糞便樣本陽性率為41% (表1)；并且漂浮顯微鏡檢法結(jié)果為陽性的樣本，熒光定量PCR 法也為陽性(表2)。

通過對比兩種方法的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR 法在仔豬球蟲感染檢測中具有明顯的優(yōu)勢。首先，在敏感性方面，熒光定量PCR 法是檢測糞便中的球蟲DNA，其球蟲卵囊需求數(shù)量比傳統(tǒng)漂浮顯微鏡檢法的少，因此結(jié)果更加敏感。這使得豬場能夠及早發(fā)現(xiàn)隱性感染豬，即使在臨床癥狀出現(xiàn)之前，也能進(jìn)行干預(yù)，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。其次，熒光定量PCR 法具有更高的特異性。傳統(tǒng)的漂浮顯微鏡檢法在卵囊計數(shù)過程中存在一定的主觀性，容易受檢測人員的經(jīng)驗和技術(shù)水平的影響。而熒光定量PCR法通過特定引物和探針的選擇，可以更準(zhǔn)確地識別仔豬球蟲的DNA 序列，避免了誤判和漏診的情況。第三，熒光定量PCR 法還具有更快的檢測速度和更高的自動化程度，可以通過自動化設(shè)備進(jìn)行高通量的樣本檢測，最多一次可以檢測96 個樣本，大大提高了檢測效率。

根據(jù)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)宮慶龍等[4]通過檢索1980—2019年的文獻(xiàn)顯示，豬囊等孢球蟲在中國豬場中的流行率為9.1%。楊光友等[5]對四川省豬場調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，豬囊等孢球蟲的流行率為18.7%。這些結(jié)果均低于本試驗中使用熒光定量PCR 法獲得的42%的流行率。該結(jié)果提示，我國豬場球蟲的感染率可能顯著高于之前的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)的漂浮顯微鏡檢法檢測由于敏感性較低，導(dǎo)致隱性感染較多，豬場不能及早發(fā)現(xiàn)問題。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究結(jié)果表明，熒光定量PCR 法在中國豬場仔豬球蟲病檢測中具有明顯的優(yōu)勢。它不僅在發(fā)現(xiàn)隱性感染豬方面更敏感，還具有更高的特異性、更快的檢測速度和更高的自動化程度。因此，在豬場管理中推廣熒光定量PCR 法作為仔豬球蟲病的主要檢測方法，以提高疾病的早期檢測和控制效果，減少經(jīng)濟(jì)損失。

5 挑戰(zhàn)與展望

本研究僅在中國不同地區(qū)的23 家豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，因此結(jié)果可能受到地區(qū)和糞便樣本數(shù)的限制。未來的研究可以擴(kuò)大樣本規(guī)模，以進(jìn)一步驗證本研究的結(jié)論。此外，還可以探索其他新型檢測方法，以提高仔豬球蟲病的檢測效果和管理水平。