黃金　李思遠(yuǎn)　謝玲玲　周迪　楊蓉　王松　周華　蔡旭航　李基棕　李彬

摘要：牛冠狀病毒（BCoV）在全球廣泛存在，在臨床上能引起牛腹瀉以及呼吸道感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。為快速批量檢測臨床樣品、分析國內(nèi)的BCoV隱性感染及流行情況，根據(jù)BCoV的N基因序列設(shè)計(jì)了引物和探針，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法，對其特異性、敏感性、重復(fù)性進(jìn)行評估，并將其與靶向BCoV的N基因的常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行對比。利用本方法對采集自我國西藏、江蘇、河北、貴州、安徽等5個(gè)省份的22個(gè)未發(fā)病牛場的35份口腔拭子樣品和244份糞便樣品進(jìn)行檢測以了解流行情況。結(jié)果表明，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)與CT值呈現(xiàn)良好穩(wěn)定的負(fù)線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%；最低檢測拷貝數(shù)為6.0×10拷貝/μL，重復(fù)性變異系數(shù)均<5%；對臨床樣品進(jìn)行檢測，檢出率明顯高于常規(guī)RT-PCR方法。對22個(gè)牛場的279份病料進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示BCoV的總體陽性率為73.12%，牛場陽性率為100.00%。本研究成功建立了靶向BCoV N基因、靈敏度高、特異性好的熒光定量RT-PCR檢測方法，并初步掌握了我國5個(gè)省份BCoV的流行現(xiàn)狀，為后續(xù)BCoV研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牛冠狀病毒；TaqMan熒光定量；樣品檢測；隱性感染；RT-PCR

中圖分類號：S852.65+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2023）17-0029-05

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）隸屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，為有囊膜的基因組為線性單股正鏈的RNA病毒［1］，臨床上常引起犢牛出血性腹瀉、成年牛冬季痢疾和呼吸道疾病。該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛存在，除感染牛以外，也可以感染野生反芻動物，如羊駝、麋鹿等。1988年，研究人員從德國1名兒童腹瀉樣品中分離出1株與BCoV基因組關(guān)系密切的毒株，提示BCoV存在跨物種傳播的可能［2］。BCoV已嚴(yán)重影響病畜的生長發(fā)育和養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

不同病原引起犢牛腹瀉在臨床和病理變化上極為相似，而利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、快速簡單等優(yōu)點(diǎn)，在病原診斷和流行病調(diào)查方面具有十分重要的地位。BCoV的全基因組大小約為32 kb，能編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白，而其中高度保守的N基因序列常常被作為診斷BCoV病的靶向基因［3］。在此理論基礎(chǔ)上，本研究以N蛋白核苷酸序列為靶向，建立了檢測BCoV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，能夠?qū)崿F(xiàn)特異、靈敏、快速批量檢測臨床樣品，便于開展BCoV的流行病學(xué)調(diào)查；本研究對我國5個(gè)省份的22個(gè)BCoV未發(fā)病牛場共279份牛樣品進(jìn)行篩查，旨在了解我國不同地區(qū)BCoV的流行感染情況，為我國部分地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 病料、菌株及臨床樣品

BCoV病料、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛星狀病毒（bovine astrovirus，BAstV）、牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus，BPIV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛腺病毒（bovine adenovirus，BAV）、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛源大腸桿菌K99、牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的核酸樣品，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室保存。

用于臨床樣品檢測的樣品：279份樣品，2021年2月至2022年7月采集自西藏、江蘇、河北、貴州、安徽各地的22個(gè)牧場，其中，河北7個(gè)牧場56份，西藏9個(gè)牧場94份，江蘇4個(gè)牧場66份，貴州1個(gè)牧場31份，安徽1個(gè)牧場32份。所有樣品均于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室-80? ℃保存。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、HiScriptⅡ RT SuperMix for qPCR、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、AceQ qPCR Probe Master Mix等，均購自Vazyme公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收提取試劑盒，購自O(shè)mega Bio-Tek公司；pMD19-T載體，購自TaKaRa公司；DNA Marker購自南京擎科生物科技有限公司。

1.3 引物合成

根據(jù)BCoV（GenBank，MW711303.1）N蛋白核苷酸序列，選擇N基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)TaqMan法的特異性檢測引物（BCoV-F，BCoV-R）和探針及構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的引物（N-F，N-R），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

2021年2月，通過臨床樣品檢測鑒定得到BCoV陽性病料。對BCoV陽性病料進(jìn)行處理后，采用RNA提取試劑盒獲取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用引物N-F、N-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增；獲得PCR產(chǎn)物跑核酸膠，膠回收后連接至pMD19-T載體；轉(zhuǎn)化Trans5α、挑菌、提質(zhì)粒，經(jīng)常規(guī)PCR鑒定后，將陽性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序正確的BCoV重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，測濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。

1.5 優(yōu)化反應(yīng)體系及條件

20.0 μL反應(yīng)體系（Mix 10.0 μL，探針0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL），優(yōu)化退火溫度Tm（55～65 ℃），通過分析CT值和擴(kuò)增曲線，確定最佳Tm；再以優(yōu)化的最佳Tm對濃度為10 μmol/L的引物用量（0.2～1.2 μL）及 10 μmol/L的探針用量（0.1～1.0 μL）進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋101～1012倍后作為檢測模板，采用TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測，獲得拷貝數(shù)與CT值的線性關(guān)系，從而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性檢驗(yàn)

以BCoV、BVDV、BRV、BAstV、BPIV、IBRV、BAV、BRSV、牛源大腸桿菌K99、牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌的cDNA/DNA為模板，以標(biāo)準(zhǔn)品（6.0×103拷貝/μL）為陽性對照，ddH2O為陰性對照加以擴(kuò)增。

1.8 敏感性檢驗(yàn)

將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，ddH2O為陰性對照擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，與常規(guī)RT-PCR進(jìn)行比較。

1.9 重復(fù)性檢驗(yàn)

對6×104、6×106、6×108拷貝/μL稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)檢測濃度設(shè)置3次重復(fù)，分3個(gè)時(shí)間段。

1.10 樣品檢測

在35份?？谇皇米訕悠分屑尤?00 μL已滅菌的PBS，渦旋，4 ℃ 12 000 r/min離心3 min后，取病毒上清液200 μL加入400 μL的RL裂解，獲得總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；244份牛糞樣品各取1 g加500 μL已滅菌的PBS充分渦旋，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，步驟同上。以獲得的cDNA為模板，利用建立的TaqMan法進(jìn)行BCoV檢測，選10%陽性PCR產(chǎn)物送公司測序。

1.11 2種RT-PCR符合率的比較試驗(yàn)

將35份?？谇皇米雍?44份牛糞便樣品的cDNA分別用建立的熒光定量方法和常規(guī)RT-PCR分別檢測，比較檢測結(jié)果，同時(shí)送去測序，計(jì)算2種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

以病料BCoV的cDNA為模板，利用引物 N-F/R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，樣品跑膠后獲得N基因片段全長，大小約為1 300 bp（圖1）；切膠回收連于 pMD-19T 載體，轉(zhuǎn)化入Trans5α，挑菌、搖菌提質(zhì)粒鑒定，陽性質(zhì)粒送測序，結(jié)果在NCBI上與BCoV其他株比對，同源性為100.00%，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測得濃度為263.47 ng/μL，相應(yīng)的拷貝數(shù)為 6.0×1012 拷貝/μL。

2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

最佳反應(yīng)體系及條件如下：AceQ qPCR Probe Master Mix 10.0 μL，探針0.2 μL，上下游引物各 0.4 μL（10 μmol/L），染料0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.3 擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將稀釋成6×10～6×1012 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品分別作為模板擴(kuò)增，獲得曲線。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)品在6×10～6×108拷貝/μL與CT值呈現(xiàn)良好的負(fù)線性關(guān)系，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，擴(kuò)增效率（E）為98.2%。

2.4 特異性檢驗(yàn)結(jié)果

采用該方法對BCoV標(biāo)準(zhǔn)品及牛常見腹瀉病原的核酸進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖3）表明，BCoV的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其他病原的核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明該方法的特異性較強(qiáng)。

2.5 敏感性檢驗(yàn)結(jié)果

采用該方法對經(jīng)過10倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品（6×10～6×1012拷貝/μL）進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)置ddH2O為陰性對照。由圖4可知，本方法對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出拷貝數(shù)為6.0×10拷貝/μL，對應(yīng)CT值約為36，敏感性為6.0×10拷貝/μL，與文獻(xiàn)報(bào)道的檢測下限［4］幾乎相同；RT-PCR的最低檢出拷貝數(shù)為6.0×103 拷貝/μL，表明該熒光定量方法敏感性更高。

2.6 重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果

在不同時(shí)間段用3個(gè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，該方法的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均低于5%，具有良好的重復(fù)性。

2.7 常規(guī)RT-PCR和TaqMan法熒光定量 RT-PCR 檢測方法的比較

由表3可知，常規(guī)RT-PCR對?？谇皇米訕悠罚╪=35）和牛糞樣品（n=244）的檢出率分別為80.00%和34.01%，TaqMan法熒光定量RT-PCR檢測方法則為91.42%和70.49%；2種方法檢測牛口腔拭子的陽性符合率為87.50%，檢測牛糞樣品的陽性符合率為48.25%。測序結(jié)果經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)，熒光定量方法判定為陽性的均為BCoV片段，表明本研究建立的方法準(zhǔn)確性相對更高。

2.8 臨床樣品的檢測結(jié)果

本次試驗(yàn)共檢測279份樣品，包括?？谇皇米訕悠?5份，牛糞便樣品244份。由表4可知，BCoV的總檢出率為73.12%，牛場陽性率為100.00%。為驗(yàn)證本次試驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠性，隨機(jī)選取判定為陽性的樣品進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)期相符，表明此方法可行。

3 討論與結(jié)論

BCoV是引起牛消化道和呼吸道疾病的主要病原之一。1972年，美國的Mebus等曾在牛的腹瀉病料中檢出BCoV病原，此后在世界各地均陸續(xù)大量報(bào)道了該病的發(fā)生［5］。1985年，宋廣林等首次報(bào)道了BCoV在我國大陸的存在情況［6］，隨后在我國各省多次成功檢出BCoV，陽性率高達(dá)70%，說明此病毒已在我國長期持續(xù)存在。但目前尚未研發(fā)出有效的疫苗及藥物，因此，早期采取合理有效的疫病監(jiān)測手段，及時(shí)淘汰陽性牛、隱形感染牛，是減少畜牧養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，遏制疾病傳播的有效方法。

目前，國內(nèi)外檢測BCoV的方法有很多種，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測速度快、敏感性好、特異性強(qiáng)、重復(fù)性強(qiáng)、準(zhǔn)確率高，適用于大量樣本的快速檢測。國內(nèi)外有些學(xué)者先后建立了BCoV的RT-PCR［7］、染料法熒光定量PCR［8-9］，而TaqMan法比其特異性更高。譚爍等以nsp10為靶向，建立了BCoV檢測方法，與國外利用M基因方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)結(jié)果存在偏差，研究發(fā)現(xiàn)存在偏差的可能原因是M基因變異［4］。因此，本研究選擇了BCoV保守的基因N為靶向設(shè)計(jì)引物和探針，避免傳統(tǒng)檢測方法中因?yàn)榛蛲蛔兯a(chǎn)生的假陰性結(jié)果。本試驗(yàn)將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=-3.441 8x+39.584 0，r2=0.999 4，E=98.2%，表明所建立的方法擴(kuò)增效率高，重復(fù)性強(qiáng)；檢測實(shí)驗(yàn)室保存的常見腹瀉病原的核酸，結(jié)果表明建立的檢測方法能準(zhǔn)確檢測出BCoV，不產(chǎn)生交叉干擾；同時(shí)本試驗(yàn)的檢測方法最低可檢測到6×10拷貝/μL的核酸模板，與高輝等建立的熒光定量檢測方法靈敏度在一個(gè)數(shù)量級上［10］。采用建立的檢測方法，對5個(gè)省份的22個(gè)未發(fā)病牧場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，采用常規(guī)RT-PCR進(jìn)行同步檢測，檢測結(jié)果基本相符并且熒光定量檢出的陽性數(shù)量多于常規(guī)RT-PCR，表明所建立的方法具有更高的靈敏性和準(zhǔn)確性。

對5個(gè)省份22家牧場未發(fā)病的樣品進(jìn)行檢測，牛場陽性率高達(dá)100%，說明我國牛場BCoV的感染率很高，BCoV廣泛存在于牛場，但是常表現(xiàn)為不發(fā)病的隱性感染，潛伏性很強(qiáng)，通過臨床表現(xiàn)觀察不能檢出。同時(shí)，有研究表明，BCoV導(dǎo)致牛群的發(fā)病與環(huán)境有很大關(guān)系，牛群的群體抵抗力下降（如環(huán)境不良等），易發(fā)生BCoV?。?1］，提示或許是我國牛場養(yǎng)殖不規(guī)范不合理，生物安全防控不到位，導(dǎo)致我國牛場感染率過高。在5個(gè)省份牛場對BCoV病原的檢測中，5個(gè)省份的檢出率從6.25%～96.97%不等，5個(gè)省份的陽性檢出率差別大。其中，江蘇、西藏的感染率高，河北、貴州次之，安徽的感染率最低，這與劉蓉菁等的結(jié)果［12］一致。江蘇、西藏、河北的感染率均高于50%，提示該地區(qū)導(dǎo)致牛腹瀉的主要病原很可能是BCoV，需要引起高度重視；西藏、江蘇的陽性率高于90%，推測兩省對于BCoV的生物安全防控不是特別到位，導(dǎo)致BCoV在各省內(nèi)大范圍傳播；西藏地區(qū)主要為牦牛，推測牦牛與普通牛相比更易感BCoV；或是牦牛的飼養(yǎng)方式與其他省份不同，牦牛的主要飼養(yǎng)方式是放牧，更容易導(dǎo)致病原的傳播；或者西藏地區(qū)是否進(jìn)化出使牦牛易感的特殊BCoV株；安徽省在此次檢測中檢出BCoV，與楊海峰等的研究結(jié)果［12］不一致，表明BCoV在我國的傳染范圍變大且持續(xù)存在。BCoV是感染消化道和呼吸道的病原，因此本次研究統(tǒng)一采用檢測口腔拭子和牛糞便的方法，結(jié)果表明口腔拭子的檢出率明顯高于牛糞便，呼吸道型BCoV明顯高于腹瀉型BCoV，這與高輝等的調(diào)查結(jié)果［10］是一致的，推測可能是呼吸道BCoV引發(fā)的呼吸道疾病綜合征［13-14］在臨床上的表現(xiàn)癥狀輕，不易察覺；其次，本次結(jié)果提示在我國BCoV引起呼吸道感染的癥狀多于腹瀉癥狀，但是由于本次口腔拭子樣品有限，還需進(jìn)一步檢測研究。

本研究建立了一種以BCoV保守的N基因?yàn)榘邢虻腡aqMan熒光定量方法，能夠快速、特異、靈敏地檢出BCoV的核酸；運(yùn)用此檢測方法對我國5省22個(gè)牧場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明我國5省的BCoV總陽性率為73.12%，牛場陽性率高達(dá)100.00%。

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收稿日期：2022-11-11

資助項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2021YFD1801101）；江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20221432）。

作者簡介：黃 金（1999—），女，江西省贛州市人，碩士研究生，從事動物傳染病防治和診斷技術(shù)研究。E-mail：1748916481@qq.com。

通信作者：李基棕，博士，副研究員，從事家畜重要疫病的病原學(xué)、致病機(jī)制與免疫防控技術(shù)研究，E-mail：lijizong22@sina.com；李 彬，博士，研究員，從事動物腹瀉病防控技術(shù)、重要豬病感染與免疫的分子機(jī)制、新型疫苗和診斷試劑開發(fā)等研究，E-mail：libinana@126.com。