隋淑梅　黃思杰　田潔

摘要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子。利用生物信息學(xué)方法從大蒜基因組中篩選并鑒定出63個(gè)WRKY家族基因，分析發(fā)現(xiàn)，大蒜WRKY基因家族成員均含有WRKY保守結(jié)構(gòu)域，其編碼產(chǎn)物的開放閱讀框（ORF）為221～1 867 aa，氨基酸長(zhǎng)度為73～621 aa，蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為8 594.72～67 991.64 u，等電點(diǎn)為4.91～9.86，氨基酸脂肪系數(shù)為41.14～76.28。其中，有35個(gè)AsWRKY蛋白是酸性蛋白，有28個(gè)AsWRKY蛋白是堿性蛋白，并且這63個(gè)家族成員都位于細(xì)胞核中。系統(tǒng)發(fā)育樹將63個(gè)AsWRKY基因分成ClassⅠ、ClassⅡ和Group Ⅲ 三大類，第Ⅰ類有15個(gè)基因，第Ⅱ類有26個(gè)基因，第Ⅲ類有22個(gè)基因。分析保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，同一類AsWRKY的結(jié)構(gòu)域相似，所有成員都含有WRKYGQK七肽保守結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，少數(shù)成員存在保守結(jié)構(gòu)域變異?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，AsWRKY基因的外顯子數(shù)量為2～6 個(gè)，內(nèi)含子數(shù)量為1～5個(gè)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量熱圖分析結(jié)果顯示，AsWRKY基因家族成員在4個(gè)組織或器官中的表達(dá)量均不同，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各組織中的相對(duì)表達(dá)量都最高。蛋白互作與基因共表達(dá)分析結(jié)果表明，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24等處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，推測(cè)其積極響應(yīng)鹽、低磷、干旱等逆境脅迫。研究結(jié)果可為深入探究大蒜WRKY基因的功能及其調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大蒜；WRKY；基因家族；表達(dá)分析；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S633.401 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2023）17-0041-11

大蒜［1］（Allium sativum L.）別稱胡蒜，是石蒜科蔥屬一年生草本植物，具有強(qiáng)烈的辛辣蒜臭味，是一種食藥兩用型蔬菜。大蒜風(fēng)味獨(dú)特，富含有多種維生素、氨基酸和礦物元素等［2］，其鱗莖中含有的大蒜素具有抗菌、抗癌等藥用價(jià)值，被認(rèn)為是重要的天然保健食品［3］。近年來，大蒜的需求量日益增長(zhǎng)，但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中，大蒜常遭遇低溫霜凍、干旱、病蟲害等多種不利于大蒜生長(zhǎng)發(fā)育的脅迫，因此研究大蒜響應(yīng)逆境脅迫的基因具有重要意義。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用［4］，WRKY家族成員一般含有非常保守的WRKYGKQ七肽序列和鋅指基序CX4～5CX22～23HXHH （C2H2型）或CX7CX23HXC（C2HC型）［5］。因此，可將其分為3個(gè)組（GroupⅠ～Ⅲ），其中GroupⅠ含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指基序；GroupⅡ含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指基序，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系又可將GroupⅡ進(jìn)一步分為5個(gè)亞組；Group Ⅲ含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2HC鋅指基序［6］。WRKY轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子內(nèi)的W-box順式元件（T）TGAC（C/T） 結(jié)合，以此激活或抑制轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，在植物響應(yīng)逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)控作用［7］。隨著生物技術(shù)手段的成熟，有很多植物的WRKY基因家族被廣泛研究，例如，擬南芥（Arabidopsis thaliana）［8］中有72個(gè)WRKY基因；大麥［9］（Hordeum vulgare）中有86個(gè)WRKY基因；玉米［10］（Zea mays）中有125個(gè)WRKY基因；在水稻［11］（Oryza sativa）中，粳稻中鑒定出 98 個(gè) WRKY基因，秈稻中鑒定出 102 個(gè)WRKY基因。雖然大蒜基因組已經(jīng)公布，但是對(duì)其WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究較少。本研究基于大蒜全基因組數(shù)據(jù)庫，對(duì)大蒜AsWRKY家族成員進(jìn)行鑒定、生物信息學(xué)分析并對(duì)其在不同器官組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析，以期為初步闡明大蒜AsWRKY基因家族的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 大蒜AsWRKY基因家族成員的鑒定

從figshare網(wǎng)站（https：//doi.org/10.6084/m9.figshare.12570947.v1）上下載大蒜全基因組數(shù)據(jù)［12］，從pfam在線網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）下載獲得WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)文件（PF03106）。利用TBtools軟件，在BLAST界面下設(shè)定參數(shù)E值為10-5，Number of hits為1，用擬南芥WRKY家族的氨基酸序列來尋找可能的大蒜AsWRKY基因，初步獲得大蒜AsWRKY候選基因序列后，在NCBI-CDD（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/guide/domains-structures/）中進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的比對(duì)，手動(dòng)刪除不包含WRKY結(jié)構(gòu)域的候選序列，接著利用SMART在線網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析候選基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域，從而確定大蒜AsWRKY家族的成員數(shù)目。

1.2 大蒜AsWRKY基因家族的染色體定位與理化性質(zhì)分析

使用TBtools軟件從大蒜基因組gff文件中提取大蒜AsWRKY基因家族成員的染色體位置信息，并繪制染色體分布圖，以基因在染色體上的位置進(jìn)行命名（AsWRKY01～AsWRKY63）。

在ExPASy網(wǎng)站分析大蒜AsWRKY蛋白序列的分子質(zhì)量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。用WoLF PSORT （https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行大蒜WRKY蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 大蒜AsWRKY基因家族系統(tǒng)發(fā)育及保守結(jié)構(gòu)域分析

從TAIR官網(wǎng)下載擬南芥相關(guān)的蛋白序列。然后，利用MEGA軟件，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次，對(duì)大蒜、擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從而確定大蒜WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的分類。用DNAMAN軟件對(duì)大蒜、擬南芥WRKY蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析。

1.4 大蒜AsWRKY家族保守基序與基因結(jié)構(gòu)的分析

利用MEME（http：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線工具對(duì)大蒜AsWRKY家族蛋白序列進(jìn)行保守基序的分析，設(shè)置保守基序的數(shù)量為10個(gè)，記作基序1～基序10。用TBtools工具繪制大蒜AsWRKY基因結(jié)構(gòu)。

1.5 大蒜AsWRKY基因家族的表達(dá)模式分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載Sun等于2020年上傳的表達(dá)數(shù)據(jù)（登錄號(hào)：GSE145455），提取大蒜WRKY家族基因在大蒜鱗莖膨大期（從鱗莖未膨大開始統(tǒng)計(jì)，每隔5 d取樣1次，共8個(gè)時(shí)期）假莖（JJ）、根（G）、葉片（YP）的相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)，用TBtools軟件生成熱圖［12］。

1.6 大蒜AsWRKY基因家族蛋白互作與基因共表達(dá)分析

在String數(shù)據(jù)庫中，以擬南芥作為植物參數(shù)，分析大蒜AsWRKY蛋白互作和基因的共表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜WRKY家族基因染色體定位和蛋白理化性質(zhì)分析

本研究從大蒜基因組中鑒定了63個(gè)AsWRKY基因，根據(jù)基因在染色體上的分布位置，依次將其命名為AsWRKY01～AsWRKY63。染色體定位分析結(jié)果（圖1）顯示，63個(gè)AsWRKY基因在8條染色體上均有分布，且分布不均勻；Chr2上分布得最多，有13個(gè)AsWRKY基因；Chr8次之，分布有11個(gè)AsWRKY基因；Chr7上分布得最少，只有2個(gè)AsWRKY基因；Chr1、Chr3上各分布6個(gè)AsWRKY基因；除此之外，Chr4、Chr5、Chr6上分別分布有4、7、8個(gè)AsWRKY基因。另外，聚集在Chr0上的AsWRKY58、AsWRKY59、AsWRKY60、AsWRKY61、AsWRKY62和AsWRKY63是未定位到Chr1～Chr8的染色體上的基因。

大蒜WRKY轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)分析結(jié)果（表1）表明，AsWRKY基因家族編碼產(chǎn)物的ORF大小為221（AsWRKY56）～1 867aa（AsWRKY27）之間，氨基數(shù)量為73（AsWRKY56）～621 aa（AsWRKY27）；蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為8 594.72（AsWRKY56）～67 991.64 u（AsWRKY27）；等電點(diǎn)為4.91（AsWRKY10）～9.86（AsWRKY20），平均值為7.19，其中35個(gè)AsWRKY蛋白的等電點(diǎn)小于 7，是酸性蛋白質(zhì)，有28個(gè)AsWRKY蛋白的等電點(diǎn)大于 7，是堿性蛋白質(zhì)；氨基酸脂肪系數(shù)為41.14（AsWRKY02）～76.28（AsWRKY32）；AsWRKY01、AsWRKY08、AsWRKY11、AsWRKY17、AsWRKY53、AsWRKY55、AsWRKY56、AsWRKY58和AsWRKY60的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，是穩(wěn)定蛋白，約占AsWRKY家族的14%，其余蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白。所有大蒜WRKY成員均定位于細(xì)胞核中，且平均親水系數(shù)都為負(fù)數(shù)，說明該家族蛋白均為親水蛋白。

2.2 AsWRKY家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和AsWRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)大蒜WRKY和擬南芥WRKY家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化樹可分為3個(gè)大類（圖2）。其中，GroupⅠ包含15個(gè)AsWRKY成員，GroupⅡ組有26個(gè)AsWRKY成員，可繼續(xù)分為5個(gè)亞組（GroupⅡ-a～GroupⅡ-e），分別有3、4、11、2、7個(gè)成員；剩下的22個(gè)AsWRKY成員被劃分在Group Ⅲ。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖3）顯示，AsWRKY結(jié)構(gòu)域比較保守，但仍存在一些特異的變異，其中Group Ⅰ中的AsWRKY55保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生了缺失和突變，變?yōu)閃TKN。GroupⅡ-a中的AsWRKY15保守位點(diǎn)的WRKYGQK變成了WLKYGQK，GroupⅡ-c中的AsWRKY08、AsWRKY29、AsWRKY30和AsWRKY31的保守位點(diǎn)的WRKYGQK變成了WRKYGKK。另外，AsWRKY56的保守位點(diǎn)的WRKYGQK變成了WTKYGKK；Group Ⅲ中的AsWRKY03、AsWRKY04、AsWRKY05、AsWRKY06、AsWRKY09、AsWRKY10、AsWRKY11、AsWRKY21、 AsWRKY36、AsWRKY47、AsWRKY49、AsWRKY60和AsWRKY62的保守位點(diǎn)WRKYGQK變成WRKYGEK。還有AsWRKY48的保守位點(diǎn)WRKYGQK變成WRKYAEK，推測(cè)這種變異可能產(chǎn)生了一些新的生物學(xué)功能。從鋅指結(jié)構(gòu)來看，63個(gè)蛋白都含有WRKYGQK和鋅指結(jié)構(gòu)2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，除Group Ⅲ鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC型之外，其余均為C2H2型。其中，GroupⅠ的C2H2型鋅指基序?yàn)镃X4C23HXH，GroupⅡ-a、GroupⅡ-b型鋅指基序?yàn)镃X6C29HXH；GroupⅡ-c的C2H2型鋅指基序?yàn)镃X4C23HXH；GroupⅡ-d、GroupⅡ-e的C2H2型鋅指基序?yàn)镃X5C23HXH；Group Ⅲ的C2HC型鋅指基序CX7C23-HXC。另外，GroupⅡ-c中AsWRKY08、AsWRKY29和Group Ⅲ中AsWRKY07的鋅指基序C2H2發(fā)生了丟失。此外，Group Ⅲ的鋅指基序?yàn)镃2HC，但AsWRKY39發(fā)生了變異，由原來的C2HC變異為C2H2（圖3）。

2.3 大蒜WRKY保守基序分析與基因結(jié)構(gòu)分析

在MEME在線網(wǎng)站設(shè)置10個(gè)保守基序，對(duì)63個(gè)大蒜WRKY蛋白進(jìn)行分析。由圖4可以看出，AsWRKY基因家族中有1～8個(gè)保守基序，GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ中基本都有Motif1（含有WRKYGQK基序）， 可以推測(cè)Motif1是AsWRKY基因家族的核心保守基序，但在Group Ⅱc中發(fā)現(xiàn)AsWRKY56蛋白中不存在WRKYGQK相關(guān)基序，可能是在遺傳進(jìn)化中發(fā)生了丟失。Group Ⅰ中有13個(gè)AsWRKY蛋白含有2個(gè)WRKYGXK基序，與Motif1一樣，Motif3中也含有WRKYGXK基序，說明這2個(gè)保守基序的功能相似，但是其中的AsWRKY17、AsWRKY55蛋白沒有Motif1、Motif3這2個(gè)保守基序，可能是在遺傳進(jìn)化中發(fā)生了丟失。Group Ⅱa、Group Ⅱd和Group Ⅱe中均只含有Motif 1、Motif 2 基序，說明這3個(gè)亞組中蛋白的功能高度相似。

很多AsWRKY家族成員都含有Motif 1、Motif 2，在Group Ⅰ、Group Ⅱ中，除個(gè)別蛋白外，其他蛋白都含有Motif 1、Motif 2基序。另外，Group Ⅲ中有5個(gè)蛋白也含有Motif 1、Motif 2基序。然而，有一部分motif僅在某一類別中出現(xiàn)，如Motif 6、Motif 10僅在Group Ⅲ中存在，Motif 3、Motif 4、Motif 7、Motif 8、Motif 9只在Group Ⅰ中存在。上述結(jié)果表明，同一類型的AsWRKY含有的保守基序相似，但是不同類型的AsWRKY中含有的保守基序不同，推測(cè)某一特定基序可能在不同類型的AsWRKY家族成員中發(fā)揮特定作用。

由圖5可以看出，AsWRKY基因的外顯子、內(nèi)顯子數(shù)分別為2～6、1～5個(gè)，63個(gè)AsWRKY基因都沒有非編碼區(qū)。在GroupⅠ中，AsWRKY18、AsWRKY27的外顯子和內(nèi)含子數(shù)最多，各有6個(gè)外顯子、5個(gè)內(nèi)含子；AsWRKY28、AsWRKY33和AsWRKY02有5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子；AsWRKY17有3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子；AsWRKY55有2個(gè)外顯子、1[CM（21*5]個(gè)內(nèi)含子，其外顯子、內(nèi)含子數(shù)目最少。除此之外，其他基因均只含有4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子。在Group Ⅱa中，僅含有1～2個(gè)外顯子，其中只有AsWRKY15含有1個(gè)內(nèi)含子；在Group Ⅱb中，除AsWRKY40含有6個(gè)外顯子外，其余成員均含有5個(gè)外顯子；Group Ⅱc中有2～5個(gè)外顯子，其中AsWRKY29有5個(gè)外顯子，其外顯子數(shù)目最多，AsWRKY58、AsWRKY53、AsWRKY56和AsWRKY08只有2個(gè)外顯子，數(shù)目最少；在Group Ⅱe中，除AsWRKY54僅含有2個(gè)外顯子之外，其他成員均含有3個(gè)外顯子；在Group Ⅱd的2個(gè)成員中，AsWRKY20含有3個(gè)外顯子，AsWRKY23含有2個(gè)外顯子。Group Ⅲ中的AsWRKY35包含6個(gè)外顯子、5個(gè)內(nèi)含子，其外顯子、內(nèi)含子數(shù)目最多；AsWRKY22有2個(gè)外顯子、1個(gè)內(nèi)含子，其外顯子、內(nèi)含子數(shù)目最少；AsWRKY49、AsWRKY62有4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子。除此之外，其他基因均只含有3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子?？傊?，AsWRKY保守基序和外顯子的差異會(huì)導(dǎo)致其基因結(jié)構(gòu)和功能的差異。

2.5 大蒜WRKY基因在不同器官中的表達(dá)模式分析

63個(gè)大蒜WRKY基因在不同組織（鱗莖、根、葉片和假莖）中的表達(dá)模式分析結(jié)果見圖6?？梢钥闯?，63個(gè)AsWRKY基因中除AsWRKY50、AsWRKY22、AsWRKY33、AsWRKY02和AsWRKY04在大蒜不同組織中不表達(dá)外，其他基因在大蒜不同組織中表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達(dá)，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各組織中的相對(duì)表達(dá)量都最高，而AsWRKY03的相對(duì)表達(dá)量在鱗莖膨大的前4個(gè)時(shí)期尤為顯著；AsWRKY01、AsWRKY42和AsWRKY48在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量都很高，但AsWRKY01在LJ1中的相對(duì)表達(dá)量與其他組織相比略低，而AsWRKY42、AsWRKY48在根中的相對(duì)表達(dá)量與其他組織相比略低；AsWRKY47、AsWRKY55、AsWRKY06和AsWRKY46在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量都較高，但AsWRKY47在葉片中的相對(duì)表達(dá)量與其他組織相比略低，AsWRKY06、AsWRKY46在葉片中的相對(duì)表達(dá)量與其他組織相比略低；AsWRKY23、AsWRKY32、AsWRKY52、AsWRKY07和AsWRKY20在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量較低；AsWRKY26、AsWRKY24、AsWRKY40、AsWRKY43、AsWRKY38、AsWRKY08和AsWRKY28的相對(duì)表達(dá)量較低，其中AsWRKY24、AsWRKY40、AsWRKY43和AsWRKY38在根中不表達(dá)；AsWRKY10、AsWRKY54除在鱗莖中不表達(dá)外，在其他組織中均有表達(dá)；AsWRKY59僅在LJ8中表達(dá)。

2.6 大蒜WRKY蛋白互作與基因共表達(dá)分析

在String蛋白互作數(shù)據(jù)庫中，以擬南芥為參數(shù)，進(jìn)行大蒜WRKY蛋白互作及基因共表達(dá)分析（圖7）。由圖7-A可見，AsWRKY11、AsWRKY23、AsWRKY15、AsWRKY37、AsWRKY44、AsWRKY39、AsWRKY55、AsWRKY18、AsWRKY34、AsWRKY22、AsWRKY36、AsWRKY62、AsWRKY24、AsWRKY58、AsWRKY08、AsWRKY57、AsWRKY27和AsWRKY28共18個(gè)蛋白參與互作。其中，AsWRKY55、 AsWRKY15和AsWRKY24處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，彼此間存在較強(qiáng)的相互作用，其余蛋白間也存在或強(qiáng)或弱的相互作用，其中線條越多，表明互作強(qiáng)度越強(qiáng)，線條越少，表明互作強(qiáng)度越弱。AsWRKY共表達(dá)結(jié)果（圖7-B）顯示，一些基因間發(fā)生了共表達(dá)，顏色越深則表明表達(dá)水平越高；AsWRKY39、AsWRKY22、AsWRKY55、AsWRKY62和AsWRKY36等基因的共表達(dá)水平較高，其中AsWRKY55和MPK3、AsWRKY55和AsWRKY15、 AsWRKY55和AsWRKY22、 AsWRKY62和AsWRKY36間的共表達(dá)水平明顯高于其他成員。

3 討論與結(jié)論

WRKY是植物體內(nèi)含有的一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)在植物受到外界環(huán)境逆境脅迫時(shí)，會(huì)做出相應(yīng)應(yīng)答［6，13-15］。本研究從大蒜基因組數(shù)據(jù)中鑒定了63個(gè)AsWRKY家族成員，與桃中PpWRKY數(shù)量（61個(gè)）［16］相近，但比擬南芥（72個(gè)）［8］、水稻（102個(gè)）［11］、小麥（270個(gè)）［17］、大麥（98個(gè)）［18］少。本研究通過與擬南芥構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，將大蒜AsWRKY家族分成3個(gè)亞家族（Ⅰ亞家族、Ⅱ亞家族和Ⅲ亞家族），Ⅱ亞家族進(jìn)一步分成Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe，這種分類方式與其他研究結(jié)果［5，19-20］一致。染色體定位結(jié)果顯示，基因在8條染色體上呈不均勻分布，其中Chr2上分布得最多，有13個(gè)大蒜AsWRKY基因，Chr7上分布得最少，只有2個(gè)AsWRKY基因。另外，還有AsWRKY58、AsWRKY59、AsWRKY60、AsWRKY61、AsWRKY62和AsWRKY63這6個(gè)基因未定位到染色體上，聚集在0Chr上，而在甜瓜數(shù)據(jù)庫中，0Chr也同樣是指無法定位到染色體上的片段［21］。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，大多數(shù)AsWRKY結(jié)構(gòu)域比較保守，但存在部分蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生了變異，WRKYGQK變異的類型有WTKN、WLKYGQK、WRKYGKK、WTKYGKK、WRKYGEK和WRKYAEK，推測(cè)這種變異可能產(chǎn)生了一些新的生物學(xué)功能，這與香樟蛋白序列比對(duì)的結(jié)果相似［22］。其中，部分大蒜WRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生的變異與山蒼子［23］WRKY蛋白（保守結(jié)構(gòu)域WRKYGQK變異為WRKYGKK）和秋茄［24］WRKY蛋白（KcWRKY14、KcWRKY27這2個(gè)WRKY家族成員的核心結(jié)構(gòu)域分別分別變異為WRKYGEK、WRKYGKK）保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生的變異相似，但是大蒜蛋白的保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變異的類型較多。

保守基序和基因結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，AsWRKY基因家族的保守基序有1～8個(gè)，GroupⅠ、Group Ⅱ和Group Ⅲ中基本同時(shí)含有Motif1（含有WRKYGQK基序），可以推測(cè)Motif1是AsWRKY基因家族特有的保守基序。而 Group Ⅱa、Group Ⅱd和Group Ⅱe中均只含有Motif1、Motif2，說明這3個(gè)亞組中蛋白的功能十分相似，這與棗中有相同motif的基因、功能相同的結(jié)論［25］一致。另外，AsWRKY的外顯子數(shù)量為2～6 個(gè)。由此推測(cè)AsWRKY基因功能差異是由上述兩者導(dǎo)致的［26］。

AsWRKY基因表達(dá)熱圖分析結(jié)果表明，63個(gè)AsWRKY基因中，除AsWRKY50、AsWRKY22、AsWRKY33、AsWRKY02和AsWRKY04這5個(gè)基因在大蒜不同組織中不表達(dá)之外，其他基因在大蒜不同組織中表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)表達(dá)，其中AsWRKY51、AsWRKY03在各組織中的相對(duì)表達(dá)量都最高，且AsWRKY03在 LJ-1、LJ-2、LJ-3和LJ-4中相對(duì)表達(dá)量最高；AsWRKY10、AsWRKY54只在根、假莖和葉片中表達(dá)，且AsWRKY54在G中的相對(duì)表達(dá)量最高；AsWRKY59僅在LJ8中表達(dá)。在本研究中，大蒜AsWRKY在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量與大蒜WOX基因［27］在不同器官中的相對(duì)表達(dá)量差異較大且不相同，這說明不同基因在同一物種、同一器官和組織中的相對(duì)表達(dá)量差異較大。

大蒜蛋白互作結(jié)果表明，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24蛋白處于網(wǎng)絡(luò)中心位置，彼此間存在較強(qiáng)的相互作用，在整個(gè)WRKY調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用［28］。另外，本研究中AsWRKY55的同源蛋白是AtWRKY33，AsWRKY15的同源蛋白是AtWRKY40，AsWRKY 24的同源蛋白是AtWRKY6。有研究表明，擬南芥植株耐鹽性的提高可誘導(dǎo)AtWRKY33基因過量表達(dá)［29］，AtWRKY40蛋白可能參與植物干旱脅迫響應(yīng)過程［30］，AtWRKY6蛋白響應(yīng)擬南芥低磷逆境脅迫，并調(diào)控該過程［31］。因此推測(cè)，AsWRKY55、AsWRKY15和AsWRKY24蛋白也可能存在與擬南芥同源蛋白類似的功能。

本研究基于大蒜全基因組數(shù)據(jù)，初步挖掘了大蒜WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的基本信息，可為進(jìn)一步探討大蒜響應(yīng)逆境脅迫機(jī)制、挖掘關(guān)鍵基因和功能提供一定理論依據(jù)。

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收稿日期：2022-12-21

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31960590）；青海省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：2022-ZJ-YO1）；青海省科協(xié)中青年科技人才托舉工程（編號(hào)：2021QHSKXRCTJ01）。

作者簡(jiǎn)介：隋淑梅（1998—），女，青海海東人，碩士，主要從事蔬菜生理方面的研究。E-mail：1577983588@qq.com。

通信作者：黃思杰，農(nóng)藝師，主要從事生態(tài)農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)方面的研究，E-mail：hsjofrcc@126.com；田 潔，博士，研究員，主要從事園藝蔬菜生理術(shù)研究，E-mail：tiantian8092001@163.com。