韓 笑,王雪蓮

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科,上海 201700

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最為常見的一種類型,每年約有15萬例新發(fā)病例,約占所有非霍奇金淋巴瘤的30%,DLBCL具有高度侵襲性,發(fā)病后可累及全身多個(gè)臟器。目前,利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松方案已經(jīng)成為治療DLBCL的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案,大大提高了患者的生存率,由于該病異質(zhì)性大,仍有近1/3的患者容易復(fù)發(fā)或者產(chǎn)生耐藥性。在過去的幾十年里,基于臨床病理學(xué)特征的預(yù)后因子,包括AnnArbor分期、國際預(yù)后指數(shù)(IPI)等被廣泛應(yīng)用于評價(jià)DLBCL患者的預(yù)后,然而,IPI和治療方案一致的患者卻有著不同的預(yù)后[1]。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的小細(xì)胞外囊泡,在人體體液中廣泛分布,不同組織來源的外泌體攜帶的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)也不完全相同。目前,關(guān)于外泌體的研究主要集中在腫瘤血管生成、免疫、腫瘤微環(huán)境等方面,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性[2]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體具有調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能,反之,巨噬細(xì)胞來源的外泌體亦具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的作用;腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)可以通過與外泌體互相作用,在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。目前有研究主要集中在肝癌、肺癌、前列腺癌和卵巢癌等[3],而巨噬細(xì)胞來源的外泌體對DLBCL的影響及機(jī)制尚不清楚,探尋新的DLBCL疾病預(yù)后標(biāo)志物及機(jī)制可為深入研究DLBCL的發(fā)病機(jī)制及防治提供新思路。本研究主要探討巨噬細(xì)胞來源的外泌體對人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為進(jìn)一步研究DLBCL的發(fā)病機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 巨噬細(xì)胞株(RAW264.7細(xì)胞)、人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑 RPMI1640購自美國Corning公司;青/鏈霉素購自美國Gibco公司;Dil染料購自北京索萊寶科技公司;CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫染液均購自上海碧云天生物科技公司;外泌體染色濾柱購自上海碧云天生物科技公司;人源重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子購自美國ThermoFisher公司;胎牛血清購自天根生化科技有限公司。

1.3方法

1.3.1體外巨噬細(xì)胞極化模型構(gòu)建 將RAW264.7細(xì)胞株用含10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),當(dāng)RAW264.7細(xì)胞株達(dá)到2×106/mL時(shí),將細(xì)胞懸液放入離心管中離心處理,當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好且懸浮細(xì)胞總量達(dá)107個(gè)時(shí),接種于12 孔板中,用白細(xì)胞介素(IL)-4和IL-13慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞,12 h后去上清液,更換培養(yǎng)基,72 h 后在培養(yǎng)液中加入嘌呤霉素(1 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)7 d,在藥物篩選下最后存活的細(xì)胞為穩(wěn)定株,即為M2型巨噬細(xì)胞,然后收集用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2外泌體提取 取標(biāo)本15 mL放入離心管中,加入磷酸鹽緩沖液(PBS),配平后以300×g、4 ℃離心10 min,取上清液轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中,配平后以2 000×g、4 ℃離心10 min,轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)配套的離心管中,配平所收集的超速離心機(jī)配套離心管中的上清液后以10 000×g、4 ℃離心30 min,取上清液轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)配套的離心管中;配平所收集的超速離心機(jī)配套離心管中的上清液后以100 000×g、4 ℃離心70 min,取透明沉淀,并用250、150 μL的PBS重懸,所得即為外泌體溶液,按檢測要求分裝后于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.3.3透射電鏡檢測外泌體形態(tài) 將50 μL外泌體標(biāo)本滴在200目的銅網(wǎng)上,室溫下孵育5 min,然后用濾紙吸去銅網(wǎng)邊緣多余的液體,接著用1%磷鎢酸負(fù)染色1 min,用蒸餾水沖洗銅網(wǎng)1～2次,再用濾紙吸去多余的液體,干燥后,用TEM-1400plus透射電鏡在80 kV下觀察銅網(wǎng)。

1.3.4納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(NTA)檢測外泌體水平和粒徑 將外泌體標(biāo)本的水平用PBS稀釋,采用ZetaViewPMX110儀器進(jìn)行檢測,并用ZetaView8.04.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5免疫熒光法檢測外泌體傳遞 將適量Dil染料加入外泌體中,避光染色20 min,經(jīng)外泌體染色濾柱去除多余的染料。以加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為外泌體組,以未加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為對照組,處理后的外泌體加入DLBCL細(xì)胞中培養(yǎng),在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,用4%甲醛固定并采用熒光顯微鏡觀察兩組人DLBCL細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。

1.3.6CCK-8法檢測U2932細(xì)胞增殖 取人DLBCL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體共孵育24 h后取計(jì)數(shù)板,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將1.5×104個(gè)/孔接種于96孔板中,以加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為外泌體組,以未加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為對照組,每組設(shè)置為5個(gè)復(fù)孔,將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在每孔0、24、48、72 h加入10 μL CCK溶液,孵育2 h,采用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸光度(A)值。

1.3.7細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測U2932細(xì)胞遷移 取人DLBCL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體共孵育24 h后計(jì)數(shù),接種于6孔板中,在直尺輔助下,采用槍頭劃直線,PBS清洗,培養(yǎng)48 h。以加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細(xì)胞作為對照組,顯微鏡下觀察6孔板中U2932細(xì)胞劃痕,分別在0、48 h的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)隨機(jī)選擇3個(gè)視野拍照,計(jì)算遷移率。

1.3.8Transwell法檢測U2932細(xì)胞侵襲 取人DLBCL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體共孵育24 h后計(jì)數(shù),取2×105個(gè)DLBCL細(xì)胞均勻平鋪到8 μm PET小室中,并加入200 μL不含胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基,將小室放置于24孔板中,下室加入600 μL含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基,然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,隨后將小室取出并用PBS清洗,用棉簽小心將小室內(nèi)的細(xì)胞擦掉,PBS洗3次,接著將小室浸沒于4%甲醛中固定20 min,固定后室溫晾干并放于結(jié)晶紫染液中10 min,PBS沖洗3次后使用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù),以加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細(xì)胞作為對照。

1.3.9流式細(xì)胞術(shù)檢測U2932細(xì)胞凋亡 取人DLBCL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體共孵育接種于培養(yǎng)皿中。以加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為外泌體組,以未加外泌體的DLBCL細(xì)胞作為對照組。采用離子水將10×BindingBuffer稀釋成1×BindingBuffer后,將各組以1 200 r/min離心5 min,PBS重懸,1 200 r/min離心5 min,重懸細(xì)胞,離心后加入BindingBuffer和AnnexinV-FITC混勻,孵育15 min,采用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1外泌體濃度和粒徑 通過透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn),所得的外泌體呈圓形,具有比較明顯的膜結(jié)構(gòu)。NTA檢測結(jié)果顯示,外泌體水平為(5.27±0.36)×1010particles/mL,平均粒徑為121.69 nm,單峰,呈正態(tài)分布,直徑50～150 nm,其密度約為(1.15±0.03)g/mL。

2.2外泌體傳遞 免疫熒光法檢測結(jié)果顯示,外泌體組在人DLBCL細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度分別為22.78±5.42和32.96±4.93,對照組人DLBCL細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度分別為9.03±1.46和8.97±1.35,與對照組比較,外泌體組在人DLBCL細(xì)胞和巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中的傳遞均明顯增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注:與對照組比較,*P<0.05。

2.3人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞增殖能力 CCK-8 法檢測結(jié)果顯示,外泌體組在0、24、48、72 h的A值分別為0.44±0.07、0.63±0.13、0.87±0.21、0.96±0.19,對照組分別為0.42±0.05、0.49±0.08、0.53±0.11、0.61±0.15,外泌體組人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞增殖能力均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞增殖能力比較

2.4人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell法檢測結(jié)果顯示,外泌體組人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞遷移率為(78.92±11.45)%,細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)為(218.54±30.57)個(gè);對照組人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞遷移率為(47.32±8.19)%,細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)為(89.21±13.84)個(gè)。外泌體組細(xì)胞遷移率和細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)均明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.5人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞凋亡能力 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,外泌體組凋亡率為(4.87±1.07)%,對照組為(13.16±4.63)%,外泌體組凋亡率明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注:A為對照組細(xì)胞凋亡;B為外泌體組細(xì)胞凋亡。與對照組比較,*P<0.05。

3 討 論

DLBCL是淋巴瘤中侵襲性較強(qiáng)的一類,無論是在生物學(xué)特征還是在臨床上均具有很大的異質(zhì)性[4]。盡管以抗CD20的Rituximab為代表的治療使DLBCL患者的生存得到明顯改善,但是仍有部分患者完全緩解后容易在疾病早期復(fù)發(fā)或者出現(xiàn)耐藥,對患者預(yù)后的預(yù)測仍然困難[5]。外泌體屬于細(xì)胞外囊泡,起源于細(xì)胞內(nèi)的多泡內(nèi)體,通過內(nèi)向出芽作用,并包裹特異分選的核酸、蛋白、脂質(zhì)等生物大分子產(chǎn)生多個(gè)管腔囊泡,外泌體隨體液流動(dòng)到達(dá)靶細(xì)胞,發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)作用。巨噬細(xì)胞是一群具有高度可塑性的細(xì)胞,是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,根據(jù)環(huán)境的變化,巨噬細(xì)胞可以快速作出反映,表現(xiàn)出不同的表型和功能,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。M1型巨噬細(xì)胞一般被認(rèn)為具有抗腫瘤作用,而M2型巨噬細(xì)胞通常被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,可以通過血管生成和淋巴管生成調(diào)節(jié)、免疫抑制、缺氧誘導(dǎo)等促進(jìn)腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移[6]。巨噬細(xì)胞來源的外泌體參與很多重要的病理、生理過程。XU等[7]通過研究發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過將lncMMPA 轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞并激活糖酵解途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡性發(fā)展;WEI等[8]研究發(fā)現(xiàn),M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過傳遞miR-942 促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展。人們也越來越關(guān)注腫瘤或巨噬細(xì)胞來源的外泌體的基本特征及其之間的相互作用關(guān)系,這些外泌體會(huì)導(dǎo)致治療期間的癌癥進(jìn)展和耐藥性,及其潛在的臨床應(yīng)用前景。目前,關(guān)于巨噬細(xì)胞來源的外泌體在DLBCL中的作用和機(jī)制尚不明確,因此,揭示巨噬細(xì)胞來源的外泌體與DLBCL發(fā)病之間的關(guān)系,探討巨噬細(xì)胞來源的外泌體對DLBCL細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)發(fā)病機(jī)制就顯得非常重要。

本研究采用超速離心法提取外泌體,得到50～150 nm大小的囊泡,分離囊泡的純度較好。同時(shí)采用免疫熒光法檢測外泌體的傳遞情況,結(jié)果顯示,外泌體組在人DLBCL細(xì)胞和巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中的傳遞均明顯增多。為了驗(yàn)證M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體在人DLBCL細(xì)胞中增殖、侵襲、遷移和凋亡的作用,本研究讓人DLBCL細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體共孵育24 h,以未加外泌體的人DLBCL細(xì)胞作為對照,通過各項(xiàng)試驗(yàn)研究結(jié)果表明,加入外泌體的人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均明顯高于對照組,而凋亡能力明顯低于對照組。上述結(jié)果表明,M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體具有調(diào)控人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞的生物學(xué)功能,能夠促進(jìn)人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。癌癥的進(jìn)展與免疫細(xì)胞活性的失調(diào)密切相關(guān),腫瘤相關(guān)外泌體被認(rèn)為是癌癥和免疫細(xì)胞之間交換物質(zhì)的媒介,M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的功能。LING等[9]研究發(fā)現(xiàn),DLBCL分泌的外泌體可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤M2樣表型,并且阻斷藥物誘導(dǎo)的DLBCL細(xì)胞凋亡,不同DLBCL衍生的外泌體可以通過STAT3信號(hào)改變巨噬細(xì)胞的表型,STAT3信號(hào)上調(diào)致癌基因和M2樣表型巨噬細(xì)胞經(jīng)典標(biāo)志物的表達(dá),DLBCL衍生的外泌體可以促使巨噬細(xì)胞極化為促生長的M2樣表型的表達(dá)。此外,LIU等[10]研究發(fā)現(xiàn),從DLBCL釋放的細(xì)胞外囊泡增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的M2極化效應(yīng),DLBCL衍生的細(xì)胞外囊泡通過增加PGC-1β蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的代謝,重編程促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的巨噬細(xì)胞表型,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。LIU等[10]研究表明,DLBCL釋放的外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化成M2型,M2型巨噬細(xì)胞釋放的外泌體又進(jìn)一步促進(jìn)DLBCL進(jìn)展,也進(jìn)一步印證了本研究的結(jié)論,即M2型巨噬細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。

綜上所述,巨噬細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制其凋亡。本研究未進(jìn)行巨噬細(xì)胞來源的外泌體對人DLBCL細(xì)胞系U2932細(xì)胞促進(jìn)作用的具體機(jī)制研究,但通過對DLBCL生物學(xué)行為的觀察,為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞來源的外泌體在DLBCL發(fā)生和發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。