鄺小林
(西安市環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所,陜西 西安 710075)
根據(jù)HJ 1001—2018《水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測(cè)定 酶底物法》標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,總大腸菌群和糞大腸菌群是指分別在37 ℃和44.5 ℃培養(yǎng)24 h能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶,分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-吡喃半乳糖苷生成黃色鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌[1],總大腸菌群和糞大腸菌群是水質(zhì)檢測(cè)中的重要指標(biāo)之一,常用于衡量水質(zhì)污染程度和致病風(fēng)險(xiǎn)。目前,我國(guó)用于水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的快速檢測(cè)方法有很多,例如紙片法、濾膜法、酶底物法等,但是由于酶底物法易于操作、靈敏性高、準(zhǔn)確率高、費(fèi)用少的特點(diǎn),被普遍用于水質(zhì)總大腸菌群和糞大腸菌群的快速檢測(cè)中[2]。
然而,針對(duì)地下水、地表水和生活污水和工廠廢水中總大腸菌群和糞大腸菌群測(cè)定,標(biāo)準(zhǔn)HJ 1001—2018雖然規(guī)定了根據(jù)水質(zhì)樣品污染程度來確定接種量來減少水質(zhì)樣品色度對(duì)菌群檢測(cè)結(jié)果的影響,但是水質(zhì)樣品色度較深也會(huì)影響陽(yáng)性孔數(shù)的判讀以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。與此同時(shí),水質(zhì)色度對(duì)于水質(zhì)檢測(cè)存在干擾[3],但是關(guān)于水質(zhì)樣品色度對(duì)酶底物法測(cè)定總大腸菌群和糞大腸菌群的具體影響,至今還未見相關(guān)研究。鑒于此,為了深入探究水質(zhì)樣品的色度變化對(duì)總大腸菌群和糞大腸菌群測(cè)定的影響,本文設(shè)置了5個(gè)水質(zhì)樣品色度,采用酶底物法對(duì)其總大腸菌群和糞大腸菌群數(shù)值進(jìn)行測(cè)定,并利用統(tǒng)計(jì)分析法對(duì)其差異進(jìn)行了科學(xué)評(píng)估。
本實(shí)驗(yàn)采用的總大腸菌群和糞大腸菌群(HJQC-004)購(gòu)買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。
1.2.1 試劑
本實(shí)驗(yàn)采用的科立得酶底物培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤均購(gòu)買于美國(guó)愛德士生物科技公司;無菌水由實(shí)驗(yàn)室純水儀并經(jīng)高壓蒸汽滅菌(121 ℃,20 min)制得。
1.2.2 儀器
本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)儀器:97孔定量盤(美國(guó)愛德士生物科技公司);程控定量封口機(jī)(美國(guó)愛德士生物科技公司);恒溫培養(yǎng)箱(上??坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司);半自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);純水儀(南京易普易達(dá)有限公司)。
選取適當(dāng)棕褐色液體為色度樣品原液,將其于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min處理制得無菌色度樣品原液。
1.4.1 色度梯度
根據(jù)實(shí)際要求,將色度樣品原液按照2∶1的比例進(jìn)行稀釋并得到了相應(yīng)的色度梯度。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了五個(gè)樣品色度梯度。
1.4.2 色度測(cè)定[4]
按照自然倍數(shù)稀釋法,取靜置15 min后的澄清樣品倒入50 mL具塞比色管至50 mL刻度線,量取25 mL樣品并加入25 mL水稀釋混勻備用,按照2倍稀釋方法由小到大逐級(jí)進(jìn)行稀釋,每稀釋一次后按照目視比色方法觀察,直至剛好與水無法區(qū)別時(shí)停止稀釋,則得到樣品的稀釋倍數(shù)。
1.4.3 樣品接種與培養(yǎng)[1]
量取95 mL樣品色度稀釋液于無菌瓶中,加入5 mL菌液,按照比例加入培養(yǎng)基。充分搖勻溶解后,將其全部轉(zhuǎn)移至97孔定量盤中,消除氣泡并封口。將封口后的97孔定量盤放置恒溫培養(yǎng)箱,于(37±1)℃或(44.5±0.5)℃培養(yǎng)24 h。
1.4.4 質(zhì)量控制
每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),用無菌水按照1.4.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白質(zhì)量控制。
1.4.5 結(jié)果分析與計(jì)算
利用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤,對(duì)樣品培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行判讀。樣品呈陽(yáng)性反應(yīng),即變黃且顏色比標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤顏色深或相同,并記錄陽(yáng)性孔數(shù)。對(duì)照97孔定量盤法MPN表,查得樣品對(duì)應(yīng)的總大腸菌群和糞大腸菌群結(jié)果,如若樣品進(jìn)行了稀釋,需進(jìn)行相應(yīng)換算。數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計(jì)分析方法,數(shù)據(jù)結(jié)果表示方式采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差,組間數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)[5]。
本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)色度梯度的樣品,每個(gè)色度樣品具體數(shù)值如表1所示。色度0樣品的色度數(shù)值為0倍,色度1樣品的色度數(shù)值為16倍,色度2樣品的色度數(shù)值為32倍,色度3樣品的色度數(shù)值為64倍,色度4樣品的色度數(shù)值為128倍。
表1 樣品色度
將無菌水按照1.4.3步驟進(jìn)行接種培養(yǎng),接種無菌水的97孔定量盤呈陰性,表明本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制結(jié)果合格,本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果有效,符合質(zhì)控要求。
為了評(píng)估樣品色度對(duì)總大腸菌群的判讀影響,本實(shí)驗(yàn)按照HJ 1001—2018標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)5個(gè)色度樣品進(jìn)行檢測(cè)分析,色度檢測(cè)的顏色變化結(jié)果如圖1所示,色度0樣品、色度1樣品、色度2樣品和色度3樣品的陽(yáng)性反應(yīng)可判讀,大孔數(shù)全為陽(yáng)性,虛線方框表示其可判讀陽(yáng)性小孔,色度4樣品的陽(yáng)性反應(yīng)無法判讀。在5個(gè)色度樣品接種總大腸菌群數(shù)一致的情況下,隨著樣品色度的增加,陽(yáng)性反應(yīng)的可判讀陽(yáng)性孔數(shù)逐漸減少,最終在色度達(dá)到128倍時(shí)陽(yáng)性孔數(shù)顯示無法判讀。
圖1 總大腸菌群檢測(cè)結(jié)果
另外,為了進(jìn)一步測(cè)試色度對(duì)總大腸菌群檢測(cè)值的影響,本實(shí)驗(yàn)將5個(gè)色度樣品的總大腸菌群的MPN值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分析結(jié)果如下圖2a所示。色度0樣品的總大腸菌群為371.2±14.1,色度1樣品的總大腸菌群為348.9±4.5,色度2樣品的總大腸菌群為240.7±3.7,色度3樣品的總大腸菌群為205.2±2.4,色度4樣品的總大腸菌群無法判讀且記為0。由此可見,隨著樣品色度的增加,樣品的總大腸菌群檢測(cè)值呈現(xiàn)變小的趨勢(shì)。
圖2 不同色度樣品的菌群檢測(cè)結(jié)果
顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),樣品其余色度的大腸菌群數(shù)檢測(cè)值與其色度0的檢測(cè)值的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示色度1樣品的總大腸菌群與色度0樣品的總大腸菌群相比在P<0.01水平上無顯著性差異,其余3個(gè)樣品色度(色度2、色度3和色度4)總大腸菌群的變化與色度0樣品的總大腸菌群相比均存在較大變化,且在P<0.01水平上差異顯著。
同樣,為了評(píng)估樣品色度對(duì)糞大腸菌群的判讀與檢測(cè)值的影響,本實(shí)驗(yàn)按照HJ 1001—2018要求對(duì)5個(gè)色度樣品進(jìn)行檢測(cè)分析,色度檢測(cè)的顏色變化結(jié)果如圖3所示,色度0樣品、色度1樣品和色度2樣品的陽(yáng)性反應(yīng)可判讀,實(shí)線方框?yàn)榉顷?yáng)性大孔,其余大孔為陽(yáng)性大孔,虛線方框?yàn)榭膳凶x陽(yáng)性小孔,色度3樣品和色度4樣品的陽(yáng)性反應(yīng)無法判讀。在5個(gè)色度樣品接種糞大腸菌群數(shù)一致的情況下,隨著樣品色度的增加,陽(yáng)性反應(yīng)的可判讀陽(yáng)性孔數(shù)逐漸減少,在色度達(dá)到64倍和128倍時(shí)陽(yáng)性孔數(shù)均顯示無法判讀。另外,5個(gè)色度樣品的糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果如圖2b所示,色度0樣品的糞大腸菌群為126.3±7.3,色度1樣品的糞大腸菌群為109.4±8.5,色度2樣品的糞大腸菌群為85.1±9.9,色度3樣品的糞大腸菌群無法判讀且記為0,色度4樣品的糞大腸菌群無法判讀且記為0。與此同時(shí),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示色度1樣品的糞大腸菌群與色度0樣品的糞大腸菌群相比在P<0.01水平上無顯著性差異,其余3個(gè)樣品色度(色度2、色度3和色度4)的糞大腸菌群的變化與色度0樣品的糞大腸菌群相比均存在較大變化,且在P<0.01水平上差異顯著。
圖3 糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果
本研究發(fā)現(xiàn)水質(zhì)樣品色度變化對(duì)酶底物法測(cè)定總大腸菌群和糞大腸菌群存在一定的影響,與于云江等[3]研究水質(zhì)色度干擾水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)在總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)含量不高的情況下,隨著水質(zhì)樣品色度的增加,酶底物檢測(cè)總大腸菌群和糞大腸菌群的可判讀陽(yáng)性孔數(shù)會(huì)逐漸減少,總大腸菌群和糞大腸菌群的MPN檢測(cè)值也會(huì)逐漸變小。
本研究結(jié)果表明總大腸菌群在樣品色度達(dá)到128時(shí)陽(yáng)性孔數(shù)無法判讀,糞大腸菌群在樣品色度達(dá)到64時(shí)陽(yáng)性孔數(shù)無法判讀,說明水質(zhì)樣品色度變化會(huì)影響酶底物法陽(yáng)性孔判讀,從而在一定程度上降低其測(cè)定有色水質(zhì)樣品總大腸菌群和糞大腸菌群結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。由此可見,當(dāng)水質(zhì)樣品中總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)含量不高且顏色較深的情況下不宜采用酶底物法來測(cè)定二者的菌群數(shù)。
綜上所述,本研究關(guān)于評(píng)估水質(zhì)樣品色度變化對(duì)酶底物法測(cè)定總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群的影響得到的結(jié)論,為準(zhǔn)確檢測(cè)水質(zhì)樣品中總大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)提供一定的科學(xué)依據(jù)。