劉翠翠 吳亞星 張淑婷 李向鑫 張 靜

徐州醫(yī)科大學徐州臨床學院，江蘇徐州 221000

牙周炎引起的牙槽骨吸收是造成牙齒松動甚至脫落的主要病因[1]，臨床上通過常規(guī)的牙周治療較難完全恢復牙周組織的結(jié)構(gòu)和功能，因此如何促進牙槽骨的修復及再生是治療牙周炎的重要環(huán)節(jié)。

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）近年來在修復牙周炎引起的骨組織缺損方面得到了廣泛應(yīng)用[2-5]。研究證實，BMMSC 發(fā)揮抗感染功能的一個重要機制是其能分泌可溶性因子，使BMMSC 與免疫細胞相互作用，誘導調(diào)節(jié)性T 細胞形成[6-7]，調(diào)節(jié)性T 細胞通過調(diào)節(jié)損傷局部微環(huán)境、減少炎癥因子分泌發(fā)揮其抗感染和免疫抑制作用[8-9]。近年研究顯示，調(diào)節(jié)性T 細胞外泌體能夠發(fā)揮與其同樣的作用，是調(diào)節(jié)性T 細胞發(fā)揮生物功能不可或缺的組成部分[10]。前期研究證實炎性環(huán)境下BMMSC 上清液中高表達的轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowthfactor，TGF）-β1促進了BMMSC 內(nèi)骨向分化標志物的表達[11]。然而調(diào)節(jié)性T 細胞是否參與了BMMSC 的骨向分化及其是否通過外泌體來調(diào)控BMMSC 的骨向分化目前仍不清楚。因此，本研究通過調(diào)節(jié)性T 細胞與BMMSC 共培養(yǎng)來明確其在BMMSC 骨向分化中的作用，同時對調(diào)節(jié)性T 細胞外泌體在骨向分化中的作用進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BMMSC（ScienCell，USA）；CD4+T 細胞分離試劑盒（Miltenyi Biotec，GER）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性試劑盒；茜素紅、ALP 染色試劑盒（Sigma-Aldrich）；鈣含量試劑盒（Sigma-Aldrich）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離和誘導CD4+初始T 細胞分化為調(diào)節(jié)性T細胞 小鼠脾細胞用CD4+T 細胞分離試劑盒分離出幼稚CD4+初始T 細胞（CD4+na?ve T cells，Th0）。采用抗CD3、抗CD28、TGF-β 和白細胞介素（interleukin，IL）-2激活分離的Th0。用FITC 偶聯(lián)抗CD45RA 和APC 偶聯(lián)抗CD4 抗體染色及PE 標記的抗Foxp3 抗體染色，流式細胞術(shù)鑒定。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬徐州市中心醫(yī)院倫理委員會批準（XZXY-LJ-20170217-003）。

1.2.2 分組方法 漿細胞分為對照組、實驗組、抑制組。對照組：Th0 與BMMSC 共培養(yǎng)并礦化誘導；實驗組：將Th0 誘導為調(diào)節(jié)性T 細胞后，與BMMSC 共培養(yǎng)并礦化誘導；抑制組：在實驗組基礎(chǔ)上加入10 μmol/L GW4869（外泌體抑制劑）并礦化誘導。三組分別于0、7 d 進行ALP 染色，7 d 進行ALP 活性檢測，0 d 和21 d進行茜素紅染色，21 d 進行鈣含量分析及7 d 進行骨向分化基因的檢測，所有實驗均重復3 次。

1.2.3 ALP 染色及活性檢測 在0、7 d 進行ALP 染色，染色面積應(yīng)用Image J 軟件定量分析；7 d 時用ALP活性試劑盒檢測ALP 活性，酶標儀在520 nm 波長測定OD 值。

1.2.4 茜素紅染色及鈣含量分析 第0、21 天使用茜素紅染色，鏡下觀察染色及礦化結(jié)節(jié)形成情況；第21 天使用鈣含量試劑盒檢測562 nm 波長處OD 值，確定鈣濃度。

1.2.5 骨向分化基因的檢測 在7 d 時提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 反應(yīng)體系總體積20 μl，加入SYNER Green qPCR Master Mix 10 μl，正反向引物各0.4 μl，相應(yīng)cDNA 2 μl，Nuclease-Free water 補足至20 μl。按95℃預變性10 s；95℃5 s，60℃34 s，共40 個循環(huán)，以GAPDH 為內(nèi)參基因，檢測ALP、OCN、Runx2 成骨相關(guān)基因的表達。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 9.3.1 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均值±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞術(shù)鑒定調(diào)節(jié)性T 細胞

CD4+初始T 細胞經(jīng)免疫磁珠分離后，CD4+陽性細胞比例為97.26%，F(xiàn)oxp3+陽性細胞比例為85.96%，純度均＞85%，根據(jù)免疫表型確定為調(diào)節(jié)性T 細胞。見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)鑒定調(diào)節(jié)性T 細胞（n=3）

2.2 ALP 染色及活性檢測

實驗組ALP 染色較對照組染色深，染色面積較大（P＜0.05）；抑制組ALP 染色面積小于實驗組（P＜0.01）；實驗組ALP 活性高于對照組（P＜0.01），抑制組ALP 活性低于實驗組（P＜0.01）。見圖2。

圖2 ALP 染色及ALP 活性檢測（n=3）

2.3 各組茜素紅染色及鈣含量分析

實驗組較對照組礦化結(jié)節(jié)形成多，染色明顯，抑制組比實驗組礦化結(jié)節(jié)形成明顯減少。實驗組內(nèi)鈣含量高于對照組，抑制組鈣含量低于實驗組（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組茜素紅染色及鈣含量分析（n=3）

2.4 各組骨向分化基因相對表達量比較

實驗組ALP、OCN、Runx2 mRNA 相對表達比對照組（P＜0.01）；抑制組ALP、OCN、Runx2 mRNA 相對表達量低于實驗組（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組骨向分化基因相對表達量比較（n=3）

3 討論

干細胞的分化受其生存微環(huán)境的調(diào)控，涉及眾多細胞、因子、基因等的表達，構(gòu)成了影響干細胞定向分化的復雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[12]。研究證實調(diào)節(jié)性T 細胞在維持體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)功能細胞[13-15]。調(diào)節(jié)性T 細胞和BMMSC 二者聯(lián)合治療能提高臨床療效[16-17]。Caplan 等[18]報道創(chuàng)傷性腦損傷后應(yīng)用調(diào)節(jié)性T 細胞和BMMSC 聯(lián)合治療比單一療法更有效減少神經(jīng)和外周炎癥反應(yīng)。因此，研究調(diào)節(jié)性T 細胞在BMMSC 骨向分化中的作用對修復炎癥導致的牙周骨缺損具有重要意義。

本研究將調(diào)節(jié)性T 細胞與BMMSC 共培養(yǎng)來觀察其在BMMSC 骨向分化中的作用，表現(xiàn)為ALP 染色深，ALP 活性高，茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)形成較多和鈣含量增高，成骨基因ALP、OCN 和Runx2 表達均顯著高于對照組，證實調(diào)節(jié)性T 細胞能夠促進BMMSC 骨向分化。與文獻報道的調(diào)節(jié)性T 細胞提高BMMSC 介導的骨形成的結(jié)果一致[19-20]。

外泌體是由多種細胞合成并分泌至胞外的囊泡，包含多種生物活性物質(zhì)，可傳遞細胞間信息及物質(zhì)交換，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[21]。調(diào)節(jié)性T 細胞外泌體影響T 效應(yīng)細胞因子的產(chǎn)生并防止人體皮膚同種異體移植損傷[22]；調(diào)節(jié)性T細胞外泌體在腦缺血性卒中治療中通過激活PI3K/Akt信號傳導對小膠質(zhì)細胞引起的OGD/R 損傷具有保護作用[23]。研究證實調(diào)節(jié)性T 細胞來源外泌體內(nèi)miR-709 能夠減輕脊髓損傷后小膠質(zhì)細胞焦下垂并促進運動功能恢復[24]。使用CD4+T 細胞外泌體可作為新型抗腫瘤治療的策略[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)性T 細胞與BMMSC 共培養(yǎng)中加入外泌體抑制劑GW4869后，BMMSC 成骨分化能力明顯降低。因此，初步推測調(diào)節(jié)性T 細胞可能是通過其分泌的外泌體參與調(diào)節(jié)BMMSC 的骨向分化。然而，調(diào)節(jié)性T 細胞來源的外泌體是如何參與BMMSC 的骨向分化過程，其機制有待進一步研究與探討。