陳自喜 李錦澎 鄭 瑾 相芬芬 康向東 吳 蓉
上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200062
慢性乙型肝炎是常見(jiàn)的感染性疾病,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)在體內(nèi)長(zhǎng)期持續(xù)復(fù)制導(dǎo)致疾病慢性化,從而嚴(yán)重危害患者的健康[1-2]。免疫反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞因子活化、增殖在HBV DNA 長(zhǎng)期復(fù)制中發(fā)揮重要作用[3]。機(jī)體T 淋巴細(xì)胞亞群失衡,免疫功能發(fā)生紊亂,不能及時(shí)有效地識(shí)別、清除入侵的HBV 可導(dǎo)致疾病的長(zhǎng)期化、慢性化[4-6]。目前臨床有效診斷肝細(xì)胞損傷的金標(biāo)準(zhǔn)主要借助肝臟酶等,通過(guò)對(duì)肝臟酶檢測(cè)及時(shí)有效地評(píng)估肝細(xì)胞損傷程度并改善乙型肝炎患者的治療及預(yù)后。本研究通過(guò)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者血清HBV 載量、炎癥因子、外周血T 淋巴細(xì)胞亞群、肝臟酶的表達(dá),進(jìn)一步探究機(jī)體感染HBV 后患者血清病毒載量與機(jī)體免疫功能變化關(guān)系。
收集2019 年3 月至2022 年8 月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院(以下簡(jiǎn)稱“我院”)收治的經(jīng)臨床確診為慢性乙型肝炎的患者85 例。根據(jù)HBV 載量,將其分為HBVDNA 陰性組(HBVDNA<103IU/ml)(29例),HBV DNA 低載量組(HBV DNA 103~105IU/ml)(28 例)和HBV DNA 高載量組(HBV DNA>105IU/ml)(28例)。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)臨床診斷為慢性乙型肝炎患者。排除標(biāo)準(zhǔn):患有自身免疫系統(tǒng)性疾病、代謝性疾病、急性藥物肝損傷。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PTEC-A-2021-28-1)。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司(SLAN-96P);HBV DNA 檢測(cè)試劑盒(22028-2)購(gòu)自湖南圣湘生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。具體操作流程按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,正常的HBV DNA 病毒載量參考范圍<1 000 IU/ml。淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)抗體(89173)和BD Trucount 絕對(duì)計(jì)數(shù)管(2236937)購(gòu)自美國(guó)BD 公司上海有限公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司上海有限公司(BD FACSCanto2)。白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6(C22050118)、IL-8(C22010111)、IL-10(C22010118)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)(C22010119)試劑均購(gòu)自熱景(廊坊)生物技術(shù)有限公司,細(xì)胞因子測(cè)定儀器為熱景C2000。應(yīng)用BECKMAN COULTER 全自動(dòng)生化儀(AU5831)檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,GPT)(AUZ 0960)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)(AUZ0157),具體操作流程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
1.3.1 HBV DNA 載量 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml,室溫靜止后,于4℃,轉(zhuǎn)速3 500 r/min,離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min。反應(yīng)體系:標(biāo)本+49 μl PCR 擴(kuò)增液+1 μl 反應(yīng)酶;反應(yīng)條件:50℃UNG 酶反應(yīng)2 min,95℃Taq 酶活化2 min,95℃變性15 s,58℃退火延伸30 s,共45 個(gè)循環(huán)。
1.3.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù) 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取5 ml 外周靜脈血,吸取50 μl 全血,加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,并加入20 μl 熒光素標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體CD45/CD3/CD4/CD8 混勻,室溫避光20 min,加入450 μl 1×BD 溶血素混勻,于1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.3.3 血清中炎癥因子和GPT、GOT 水平 所有研究對(duì)象于清晨空腹抽取外周靜脈血5 ml,室溫靜止后,于4℃,轉(zhuǎn)速500 r/min,離心半徑13.5 cm 的條件下離心15 min,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF 表達(dá),另采用全自動(dòng)生化儀酶學(xué)法檢測(cè)GPT、GOT 水平。
采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)數(shù)分析相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
HBV DNA 陰性組男16 例,女13 例;年齡50~62歲,平均(56.59±2.70)歲;HBV DNA 低載量組男19 例,女9 例;年齡41~74 歲,平均(56.43±10.66)歲;HBV DNA 高載量組男22 例,女6 例;年齡43~74歲,平均(59.62±9.38)歲。三組一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF水平高于HBV DNA 陰性組,HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 三組炎癥因子水平比較(pg/ml,)
表1 三組炎癥因子水平比較(pg/ml,)
注 與HBV DNA 陰性組比較,aP<0.05;與HBV DNA 低載量組比較,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒;IL:白細(xì)胞介素;TNF:腫瘤壞死因子。
HBV DNA 低、高載量組CD4+百分率、CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 陰性組,CD8+百分率及其絕對(duì)計(jì)數(shù)高于HBV DNA 陰性組(P<0.05)。HBV DNA 高載量組CD4+百分率、CD3+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD8+絕對(duì)計(jì)數(shù)、CD4+/CD8+低于HBV DNA 低載量組,CD8+百分率高于HBV DNA 低載量組(P<0.05)。見(jiàn)表2。
表2 三組T 淋巴細(xì)胞亞群比較()
表2 三組T 淋巴細(xì)胞亞群比較()
注 與HBV DNA 陰性組比較,aP<0.05;與HBV DNA 低載量組比較,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒。
HBV DNA 低、高載量組的GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組,HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組(P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 三組血清肝臟酶水平比較(U/L,)
表3 三組血清肝臟酶水平比較(U/L,)
注 與HBV DNA 陰性組比較,aP<0.05;與HBV DNA 低載量組比較,bP<0.05。HBV:乙型肝炎病毒;GPT:谷丙轉(zhuǎn)氨酶;GOT:谷草轉(zhuǎn)氨酶。
慢性乙型肝炎患者血清IL-6、IL-10、TNF 水平與GPT 水平呈正相關(guān)(r=0.63、0.45、0.61,P<0.001),IL-8與GPT 無(wú)相關(guān)性(r=0.17,P=0.120)。IL-6、IL-10、TNF水平與GOT 水平呈正相關(guān)(r=0.48、0.40、0.49,P<0.001),IL-8 與GOT 無(wú)相關(guān)性(r=0.08,P=0.440)。
慢性乙型肝炎機(jī)制是指機(jī)體受到HBV 侵襲、感染不能及時(shí)有效清除HBV,使機(jī)體長(zhǎng)期陷入免疫耐受狀態(tài),造成患者肝細(xì)胞、肝組織等的慢性破壞、損傷。研究證實(shí),是由于機(jī)體免疫損傷造成[7-9]。慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制與患者遺傳、年齡、肝組織及細(xì)胞內(nèi)炎癥因子活化有關(guān),而機(jī)體炎癥因子在免疫系統(tǒng)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10-12]。肝臟含豐富的肝巨噬細(xì)胞,病原體攻擊肝細(xì)胞后,肝細(xì)胞內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活,促使機(jī)體釋放大量炎癥因子如IL-6、TNF 等[13-16],誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一連串的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng),TNF 加劇肝星狀細(xì)胞增殖,使肝巨噬細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、血小板生長(zhǎng)因子等,同時(shí)TNF 刺激產(chǎn)生大量IL-6 促使中性粒細(xì)胞聚集、活化,誘發(fā)肝纖維化和腎小管壞死等[17-19],釋放的IL-8 等趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織,產(chǎn)生超氧陰離子,激活炎癥細(xì)胞,參與炎癥反應(yīng)發(fā)生,促進(jìn)肝纖維細(xì)胞增殖分化,進(jìn)一步導(dǎo)致慢性乙型肝炎發(fā)生[20-22]。
本研究結(jié)果顯示,HBV DNA 低、高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 陰性組,HBV DNA 高載量組IL-6、IL-8、IL-10、TNF 水平高于HBV DNA 低載量組,提示機(jī)體受到HBV DNA 病毒復(fù)制增多,機(jī)體免疫炎癥因子的活化增強(qiáng),進(jìn)一步提示肝臟器官已經(jīng)損傷。目前臨床評(píng)估肝細(xì)胞受損程度的金標(biāo)準(zhǔn)是肝臟酶GPT、GOT 等的水平,本研究結(jié)果顯示,HBV DNA 低、高載量組GPT、GOT 水平均高于HBV DNA 陰性組,HBV DNA 高載量組GPT、GOT 水平高于HBV DNA 低載量組。相關(guān)性結(jié)果顯示,炎癥因子IL-6、IL-10、TNF 與肝臟酶GPT、GOT 呈正相關(guān),可能是隨著HBV DNA 不斷復(fù)制,病毒載量升高,肝細(xì)胞受損,細(xì)胞通透性增加,轉(zhuǎn)氨酶和釋放的炎癥細(xì)胞因子相互反應(yīng)促使機(jī)體出現(xiàn)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此,慢性HBV 病情評(píng)估應(yīng)結(jié)合肝功能酶、炎癥因子綜合分析,獲得更為準(zhǔn)確且客觀的參考依據(jù)。
外周血T 淋巴亞群在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是慢性乙型肝炎患者免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一。T 淋巴亞群中CD4+T 細(xì)胞促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖和分化,調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞和體液免疫[23-25]。CD8+T 具有很強(qiáng)的殺傷能力,是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的重要免疫細(xì)胞[26]。本研究結(jié)果顯示,與HBV DNA 陰性組比較,HBV DNA 低、高載量組CD4+T 細(xì)胞百分率和絕對(duì)計(jì)數(shù)減少,CD8+T 細(xì)胞百分率和絕對(duì)計(jì)數(shù)增加,CD4+/CD8+降低,提示機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體不足,不能及時(shí)有效地清除HBV,造成HBV DNA 在機(jī)體內(nèi)不斷復(fù)制。CD4+/CD8+是監(jiān)測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能、反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo),隨著復(fù)制的HBV DNA 載量升高,CD4+/CD8+失衡,提示HBV DNA 不斷復(fù)制導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生嚴(yán)重紊亂。
綜上,診治慢性乙型肝炎應(yīng)結(jié)合肝臟酶、炎癥因子和外周血T 淋巴細(xì)胞亞群等指標(biāo)分析,獲得更為準(zhǔn)確且客觀的參考依據(jù),為患者制訂更為有效的治療方案改善預(yù)后。
中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2023年25期