何秀義 ，安禎祥 ，何遠利 ，劉義 ，何松 （.貴州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，貴陽 55000；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴陽 55000）

肝纖維化是多種致病因素（乙醇、藥物、毒素等）導致的慢性肝損傷，以細胞外基質的異常沉積為主要特征，若患者得不到及時治療，可能會引起肝硬化、肝癌等疾病，嚴重時還會威脅生命[1]。當肝臟受到損傷時，肝細胞發(fā)生凋亡，進而誘導肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）、巨噬細胞、庫普弗細胞產(chǎn)生促纖維化因子來促進HSC的反式分化和肌成纖維細胞的激活，導致肝纖維化[2]。因此，抑制肝細胞凋亡可減少HSC的激活，從而延緩肝纖維化的進程。

南五味子，也叫華中五味子，屬木蘭科，其藥用部位為成熟的干燥果實，味酸，五行屬木，入肝經(jīng)，可滋肝陰、補肝體，具有收斂、益氣生津、補腎安神、保肝等功效[3]。安五脂素是從南五味子中提取的一種木脂素類化合物，具有保肝、抗氧化、抗炎、抑制肝細胞壞死等作用[4]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，安五脂素具有多種藥理活性，是一種潛在的肝損傷治療藥物[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，安五脂素可通過調節(jié)胱天蛋白酶3和B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）/Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）發(fā)揮抗細胞凋亡的作用[6]，但其是否可通過上述途徑抑制肝細胞凋亡導致的肝纖維化尚不清楚。因此，本課題擬對安五脂素對肝纖維化的作用及機制進行研究，旨在為該藥的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括AUW-220D型電子分析天平（日本島津公司）、ZS-2型板式酶標儀（北京新風機電技術公司）、TGL-20M型臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀貝克儀器儀表有限公司）、Scientz-ⅡD型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、LIDE 200型掃描儀[佳能（中國）有限公司]、ST60-4型微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）、Mini Trans-Blot型蛋白轉印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、4600SF型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、CX23型光學顯微鏡（濟南博坤科學儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品及試劑

安五脂素對照品（批號AFBH2603，純度≥98%）購自成都埃法生物科技有限公司；秋水仙堿片（國藥準字H53020166，批號20211203，規(guī)格0.5 mg）購自云南植物藥業(yè)有限公司；CCl4（批號20200522）購自天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；橄欖油（批號20221001）購自上海嘉里食品工業(yè)有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號分別為C009-2-1、C010-2-1）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號9054-89-1）購自湖北日昇昌科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號XY-SHSJH-1017）購自上海烜雅生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（批號20220825）購自武漢呵爾醫(yī)療科技發(fā)展有限公司；Masson染色液（批號20221230）購自南京建成科技有限公司；蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒（批號分別為60345、30324）均購自北京康為世紀生物科技有限公司；ECL高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（貨號WE0308）購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體、Bax抗體（批號分別為GR3360941-5、1010423-7、GR3360948-18、GR1008474-3）均購自英國Abcam公司；兔源Bcl-2抗體（貨號A-01209）購自上海齊天生物科技有限公司；鼠源多克隆抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，貨號ybs-2188R）購自上海研謹生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（貨號C86-SSA005）購自上海創(chuàng)賽科技有限公司；水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠50只，體重180～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0008。大鼠由貴州中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，自行進食和飲水。本研究通過貴州中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（批件號20220094）。

2 方法

2.1 動物分組及造模

將50只雄性SD大鼠在實驗前喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組，模型組，秋水仙堿片組，安五脂素高、低劑量組，每組10只。除正常組大鼠腹腔注射等量橄欖油和生理鹽水外，其余各組大鼠均腹腔注射50% CCl4橄欖油混合溶液（1.5 mL/kg），每周2次，持續(xù)8周，以復制肝纖維化大鼠模型[7]。造模結束后，分別抽取正常組和模型組1只大鼠處死，取肝臟進行HE病理檢測，以METAVIR評分為依據(jù)評估造模是否成功[8]。

2.2 動物給藥及取材

大鼠造模結束后，從第9周開始灌胃給藥或蒸餾水，每組灌胃體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃4周。其中，正常組和模型組大鼠給予等量蒸餾水；安五脂素高、低劑量組參照文獻方法[9]，經(jīng)等效劑量折算為低劑量組大鼠給藥0.7 mg/kg，按照4倍劑量設置高劑量組，故予安五脂素高劑量組2.8 mg/kg；秋水仙堿片組大鼠給藥劑量為0.1 mg/kg[10]。上述干預結束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，稱重后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心后分離出血清，保存至-80 ℃冰箱；摘取新鮮肝臟，稱定肝臟質量后將新鮮的肝右葉組織固定于4%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)的HE染色和Masson染色；其余肝組織凍存于-80 ℃冰箱中，用于Western blot檢測。

2.3 大鼠一般情況觀察

實驗期間每天觀察大鼠的一般情況，包括飲食、毛發(fā)光澤度、活動度、呼吸、體重、有無鼻出血、死亡等情況。

2.4 大鼠肝指數(shù)的計算

根據(jù)“2.2”項下各組大鼠體重和肝臟質量結果，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)＝大鼠肝臟質量（g）/大鼠體重（g）×100%。

2.5 大鼠血清中ALT、AST、SOD、MDA含量的測定

取“2.2”項下血清，按照試劑盒說明書，采用比色法檢測大鼠血清中ALT、AST、SOD、MDA的含量。

2.6 大鼠肝組織病理形態(tài)學和肝纖維化程度的觀察

取“2.2”項下固定于4%多聚甲醛溶液中的肝組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、脫蠟、切片、烤片后進行組織學染色，即HE染色和Masson染色，在光學顯微鏡下觀察每組大鼠肝纖維化的病理情況。從Masson染色圖片里每組取3張圖片，利用Image J軟件計算膠原容積分數(shù)。膠原容積分數(shù)（%）＝膠原陽性的藍色面積/總面積×100%。

2.7 大鼠肝組織中PI3K/Akt通路及凋亡相關蛋白表達水平的測定

采用Western blot法進行測定。每組取3只凍存于-80 ℃冰箱中的大鼠肝組織，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，提取蛋白。采用BCA法進行定量后，對蛋白進行加熱變性處理，經(jīng)制膠、電泳、轉膜后，以10%牛血清白蛋白封閉1 h，洗膜，分別加入PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶3 000、1∶30 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶10 000），于4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育1 h后，用洗液漂洗3次，向PVDF膜上滴加化學發(fā)光試劑進行顯影、拍照。采用Gel-Pro Analyzer軟件測定并分析目標蛋白條帶的灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示上述蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析。方差齊性時，組間比較采用LSD檢驗；不滿足方差齊性時，以Tamhane’sT2檢驗進行組間對比。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 各組大鼠的一般情況

正常組大鼠飲食正常，被毛濃密有光澤，活動有力，呼吸正常，鼻部無出血，體重穩(wěn)定增長；與正常組大鼠比較，模型組大鼠飲食量下降，被毛稀疏、蓬亂，反應遲鈍，體重增長速率減慢或體重降低；其余各組與模型組比較，上述各種情況均有所改善。實驗期間，正常組和模型組大鼠無死亡，秋水仙堿片組、安五脂素高劑量組大鼠各死亡3只，安五脂素低劑量組大鼠死亡2只，共死亡8只大鼠。

3.2 安五脂素對各組大鼠肝指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝指數(shù)顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿片及安五脂素高、低劑量組大鼠肝指數(shù)均顯著下降（P＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠體重、肝臟質量和肝指數(shù)的檢測結果（±s）

表1 各組大鼠體重、肝臟質量和肝指數(shù)的檢測結果（±s）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組秋水仙堿片組安五脂素低劑量組安五脂素高劑量組肝指數(shù)/%2.04±0.14 3.99±0.32a 2.51±0.09b 2.74±0.07b 2.26±0.08b n9 9 7 8 7體重/g 417.20±9.61 336.00±19.68a 377.14±17.66b 383.13±17.18b 401.14±8.51b肝臟質量/g 8.53±0.76 13.36±0.77a 9.87±0.68b 10.49±0.54b 9.09±0.50b

3.3 安五脂素對各組大鼠血清中ALT、AST、SOD、MDA含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、MDA含量均顯著升高，SOD含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組大鼠血清中ALT、AST、MDA含量均顯著降低，SOD含量均顯著升高（P＜0.01）。結果見表2。

表2 安五脂素對各組大鼠ALT、AST、SOD、MDA含量的影響（±s）

表2 安五脂素對各組大鼠ALT、AST、SOD、MDA含量的影響（±s）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組秋水仙堿片組安五脂素低劑量組安五脂素高劑量組MDA/（nmol/mL）3.55±0.44 16.80±1.00a 5.56±0.47b 5.37±0.35b 4.07±0.64b n9 9 7 8 7 ALT/（U/L）11.41±1.99 65.43±2.98a 26.09±2.56b 23.18±1.95b 20.52±1.90b AST/（U/L）16.32±2.19 85.29±4.13a 33.13±2.21b 32.20±2.43b 23.52±2.26b SOD/（U/mL）414.68±4.67 296.30±6.25a 388.81±7.87b 383.92±5.47b 397.13±4.87b

3.4 安五脂素對各組大鼠肝組織病理形態(tài)和肝纖維化的影響

HE染色結果（圖1）顯示，正常組大鼠肝組織結構完整，肝索排列成放射狀，無纖維組織增生，無肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤；與正常組比較，模型組大鼠肝組織結構紊亂，有大量膠原纖維組織增生，肝索排列紊亂，匯管區(qū)域可見大量的炎癥細胞浸潤、肝細胞變性和壞死；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組的肝纖維化程度均有所減輕。Masson染色結果（圖1）顯示，正常組大鼠在肝組織匯管區(qū)域可見少量的藍染膠原纖維；模型組大鼠肝組織中見大量藍染膠原纖維，纖維間隔變寬，纖維增生明顯；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組藍染膠原纖維明顯變細，肝纖維化程度均有不同程度的改善。正常組、模型組、秋水仙堿片組和安五脂素高、低劑量組大鼠的膠原容積分數(shù)分別為（2.68±0.96）%、（38.96±4.40）%、（19.75±1.85）%、（13.84±1.59）%、（18.48±1.17）%。與正常組比較，模型組大鼠膠原容積分數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組大鼠膠原容積分數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)及纖維化顯微圖

3.5 安五脂素對大鼠肝組織中PI3K/Akt通路相關蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中PI3k、Akt、p-Akt蛋白表達水平均顯著下調（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組大鼠肝組織PI3k、Akt、p-Akt蛋白表達水平均顯著上調（P＜0.01或P＜0.05）。結果見圖2。

圖2 安五脂素對各組大鼠肝組織中PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響

3.6 安五脂素對大鼠肝組織中凋亡相關蛋白表達水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Bax蛋白表達水平升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，秋水仙堿片組及安五脂素高、低劑量組大鼠Bax蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.01）、Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。結果見圖3。

圖3 安五脂素對各組大鼠肝組織內(nèi)凋亡相關蛋白表達的影響

4 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化或肝癌的重要環(huán)節(jié)，是各種肝損傷的共有病理過程[11]。CCl4是經(jīng)典的肝纖維化誘導劑，可引起肝損傷，導致肝細胞的反復、持續(xù)性壞死，進而發(fā)展為肝纖維化。肝纖維化存在進展為肝硬化的危險性，因此，在肝纖維化早期采取積極有效的措施防止病情進一步惡化具有重要意義。安五脂素是近年來研究發(fā)現(xiàn)具有保肝、抗細胞凋亡、抗氧化的中藥單體，安全性可靠[4]，在本次實驗過程中給藥組大鼠出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，考慮與環(huán)境、大鼠自身因素（攻擊、大鼠習性）等有關。

當肝細胞受到損傷時，血清中ALT、AST含量明顯升高[12]，因此本研究將血清中ALT、AST作為肝纖維化導致肝損傷的檢測指標。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCl4誘導后的肝纖維化模型大鼠血清中ALT、AST含量明顯高于正常組；經(jīng)不同劑量的安五脂素干預后，大鼠血清中ALT、AST含量降低，表明安五脂素具有保肝作用。氧化應激反應是導致肝纖維化發(fā)生的主要機制之一，而脂質過氧化反應的代謝物中含有MDA[13]，MDA可誘導脂質過氧化而發(fā)生細胞凋亡[14]；SOD可清除活性氧，抑制脂質過氧化反應。本實驗結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中MDA含量升高、SOD含量降低；予安五脂素干預后，大鼠血清中MDA含量降低、SOD含量升高，提示安五脂素可能通過提高抗氧化能力、抑制氧化應激反應而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。本研究結果還表明，在病理層面上，模型組大鼠肝組織結構紊亂、有大量膠原纖維組織增生、炎癥細胞浸潤、膠原容積分數(shù)明顯升高等；經(jīng)安五脂素干預后，大鼠肝纖維化程度改善、膠原容積分數(shù)降低，由此推測安五脂素可保護肝細胞受損、減緩肝纖維化的發(fā)展進程。

肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡有著密切的關系。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的主要調節(jié)因子，是一種至少帶有1個Bcl-2同源區(qū)域的典型蛋白家族，其中包括抗細胞凋亡蛋白Bcl-2和促細胞凋亡蛋白Bax。Bax可以作為同源二聚體存在，也能與Bcl-2形成異源二聚體，兩者對細胞凋亡具有調控作用——Bcl-2/Bax比值升高抑制細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值降低則促進細胞凋亡[15]。本研究結果表明，模型組大鼠肝組織中Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平下降；經(jīng)安五脂素干預后，Bax蛋白表達水平下降，Bcl-2蛋白表達水平升高，提示安五脂素可通過抑制肝細胞凋亡發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

PI3K/Akt信號通路廣泛存在于多種細胞中，可介導氧化應激反應，導致血清中SOD水平升高、MDA水平下降，抑制肝細胞凋亡，減輕氧化應激反應[16—17]；同時，PI3K/Akt信號通路還可促進細胞增殖，當該通路被激活時，PI3K可催化其下游靶蛋白Akt磷酸化成為p-Akt，而p-Akt能使糖原合成酶激酶-3β磷酸化而失活，從而抑制細胞凋亡[18]。Bcl-2是PI3K/Akt信號通路下游的重要底物蛋白之一，可抑制細胞凋亡，當Akt被激活后，磷酸化的Bcl-2基因相關啟動子與Bcl-2發(fā)生解聚，使Bcl-2游離而發(fā)揮抗凋亡作用[19]。本實驗結果表明，模型組大鼠肝組織中PI3K、Akt及p-Akt的蛋白表達水平均降低，提示在肝纖維化過程中PI3K/Akt信號通路被抑制；經(jīng)安五脂素干預后，PI3K、Akt及p-Akt的蛋白表達水平均升高，提示安五脂可通過激活PI3K/Akt通路起到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，安五脂素可能是通過激活PI3K/Akt號通路降低肝纖維化氧化應激反應、抑制肝細胞凋亡來發(fā)揮抗肝纖維化作用。但本研究尚處于動物實驗階段，相關更深層次的機制有待進一步研究探討。