禹靜，劉續(xù)春，李振華

（1.黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院，河南 駐馬店 463000；2.鄭州市中心醫(yī)院，河南 鄭州 450001）

糖尿病腎病是慢性腎臟疾病以及終末期腎衰竭的主要病因，也是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥和主要的死亡病因［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)，全球大約有30%～40%的糖尿病患者會(huì)伴隨疾病的遷延和進(jìn)展成為糖尿病腎病，伴有終末期腎病的患者五年生存率低于20%［2］。因此，延緩或阻止糖尿病腎病進(jìn)展對(duì)于改善患者生存質(zhì)量具有重要的臨床意義。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要包括纖維化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及糖脂代謝紊亂等。眾多研究已證實(shí)，腎纖維化是糖尿病腎病進(jìn)行性加重的重要因素［3］。因此，積極尋找能夠抑制腎纖維化的新型治療藥物或方式對(duì)于改善糖尿病腎病進(jìn)展具有重大的意義。

中醫(yī)藥在治療糖尿病腎病方面療效確切。溫補(bǔ)固腎方以溫陽(yáng)補(bǔ)腎固腎為治療根本大法，佐以收澀補(bǔ)氣之品［4］，本課題組前期研究顯示，其能夠通過(guò)下調(diào)collagen Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達(dá)抑制腎纖維化，從而改善糖尿病腎損傷［5］。但是有關(guān)溫補(bǔ)固腎方對(duì)糖尿病腎纖維的調(diào)控機(jī)制尚不明晰。自噬是細(xì)胞中代謝產(chǎn)物及錯(cuò)誤折疊蛋白降解的重要途徑，即細(xì)胞能夠通過(guò)降解自噬小體內(nèi)包裹的損傷細(xì)胞器、病原體以及蛋白質(zhì)，從而維持細(xì)胞正常的生理功能［6］。研究顯示，在糖尿病腎病大鼠中自噬水平被顯著性抑制，而激活細(xì)胞自噬能夠顯著抑制糖尿病腎病腎纖維化，改善糖腎損傷［3］。可見(jiàn)，細(xì)胞自噬與糖尿病腎纖維化的關(guān)系密切，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬可能是抑制腎纖維化，改善糖尿病腎病的重要機(jī)制。AMPK/mTOR 途徑是調(diào)節(jié)自噬的重要途徑之一，AMPK 激活后能夠激活TSC1/2 蛋白，進(jìn)而抑制mTOR 活化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬形成［7］。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建糖尿病腎病大鼠模型，探究溫補(bǔ)固腎方能否通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR 通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，抑制糖尿病腎纖維化，并最終改善糖腎損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2021-0002，100只，體質(zhì)量180～210 g。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間正常飲食、飲水，晝夜12 h/12 h 交替光照，溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度45%～55%，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20191002），符合3R原則。

1.1.2 藥物與試劑

溫補(bǔ)固腎方制劑由廣東一方制藥有限公司提供，組方：黨參0.1 g，山茱萸0.12 g，芡實(shí)0.2 g，枸杞子0.1 g，覆盆子0.1 g，菟絲子 0.1 g，淫羊藿 0.1 g，益智仁 0.1 g；達(dá)格列凈片（AstraZeneca Pharmaceuticals LP，規(guī)格：10 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20170040）；AMPK 抑制劑Compound C（美國(guó)Selleck公司，貨號(hào)：S7306）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、PAS 染色試劑盒、Masson 染色試劑盒、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、發(fā)光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司，貨號(hào)：C0105S、T4106、T4104、P0011、P0018 FS、A0409、A0413）；免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：SP-9001）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：S8050、20151211、P1126）；α-SMA 抗體、E-Cadherin 抗體、LC3 抗體、AMPK 抗體、p-AMPK 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab5694、ab76055、ab192890、ab271188、ab131357、ab134903、ab137133）。

1.1.3 儀器

血糖儀（瑞士Roche 公司，型號(hào)：卓越精采型）；多功能酶標(biāo)儀（長(zhǎng)春樂(lè)鏷科技有限公司，型號(hào)：LP-5117）；熒光倒置顯微鏡（日本/奧林巴斯Olympus，型號(hào)：CKX53）；高速冷凍離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：H3-18KR）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)公司，型號(hào)：Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病腎病模型構(gòu)建、分組及干預(yù)

SD 大鼠腹腔一次性注射STZ（60 mg/kg）構(gòu)建糖尿病腎病模型。判定標(biāo)準(zhǔn)：STZ 注射后3 d，血糖值均 ≥16.7 mmol/L，且尿液蛋白呈現(xiàn)陽(yáng)性者，被確認(rèn)為模型構(gòu)建成功。雄性SPF 級(jí)SD 大鼠100 只，除對(duì)照組20 只外，均采用腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg）構(gòu)建糖尿病腎病模型。其中60 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病腎病組、達(dá)格列凈組（1.0 mg/kg）、溫補(bǔ)固腎方低、中、高劑量組（0.92、1.84、3.68 g/kg），每組各10 只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用STZ 誘導(dǎo)糖尿病腎病模型。溫補(bǔ)固腎方低劑量組劑量為0.92 g/kg，中、高劑量組分別為低劑量組的2 倍和4 倍。達(dá)格列凈組給予1.0 mg/kg 劑量達(dá)格列凈灌胃。對(duì)照組及糖尿病腎病組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。以上各組大鼠1次/d，連續(xù)灌胃12 周。剩余40 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病腎病組、溫補(bǔ)固腎方高劑量組（3.68 g/kg）、溫補(bǔ)固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組（20 mg/kg），每組各10 只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用STZ 誘導(dǎo)糖尿病腎病模型。溫補(bǔ)固腎方高劑量組大鼠給予3.68 g/kg劑量灌胃。溫補(bǔ)固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組大鼠給予3.68 g/kg 溫補(bǔ)固腎方灌胃，同時(shí)予以腹腔注射AMPK 抑制劑Compound C 20 mg/kg［8］。對(duì)照組及糖尿病腎病組大鼠予以腹腔注射等量生理鹽水。以上各組大鼠均為1次/d，干預(yù)12周。

1.2.2 腎功能生化指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠分別干預(yù)12 周后，每組隨機(jī)取6 只大鼠進(jìn)行尾靜脈采血，測(cè)定血糖值。收集尿液，按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)測(cè)定尿蛋白、肌酐及尿素氮含量。

1.2.3 腎組織病理學(xué)觀察

將腎組織放于10%的多聚甲醛中固定24 h、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、組織石蠟包埋、切片3～5 μm，行HE、PAS 及Masson 染色，顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化及心肌纖維化程度。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)α-SMA和E-Cadherin表達(dá)

每組隨機(jī)取6 只大鼠進(jìn)行腎組織切片，經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復(fù)、組織封閉后，滴加α-SMA 抗體及E-Cadherin 抗體（1∶500），孵育過(guò)夜，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h，滴加DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染，于400倍顯微鏡下觀察腎組織α-SMA 及E-Cadherin 著色情況，并通過(guò)ImageJ 軟件計(jì)算腎組織α-SMA 及E-Cadherin 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，以胞漿或胞膜呈棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。

免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率（%）=免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%

1.2.5 電鏡觀察自噬小體及腎組織病理變化

將腎組織修剪成大小為1 mm×1 mm×1 mm組織塊，在1%四氧化鋨中固定3 h。采用分級(jí)乙醇和丙酮梯度脫水后，將樣品嵌入Spurr 樹(shù)脂中，并切成70 nm厚的薄片，最后采用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，并用10 000 倍透射電子顯微鏡觀察自噬小體形態(tài)與數(shù)量。2.5%戊二醛固定腎組織，制備切片，電鏡下觀察腎組織病理形態(tài)變化。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)腎組織LC3-Ⅱ、p-AMPK、p-mTOR表達(dá)

給藥12周后，立即將大鼠處死，剪取大鼠腎組織并提取總蛋白，按照1∶5質(zhì)量與體積比加入細(xì)胞裂解液，于4 ℃條件下裂解40 min；BCA法測(cè)定各組大鼠腎組織蛋白質(zhì)濃度；蛋白上樣（按照每孔上樣量30 μg計(jì)算得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；5% BSA室溫封閉2 h；分別加p-AMPK抗體（1∶1 000）、AMPK抗體（1∶1 000）、p-mTOR抗體（1∶500）、mTOR抗體（1∶1 000）、LC3抗體（1∶1 000）及β-actin抗體（1∶2000），4 ℃孵育過(guò)夜；加對(duì)應(yīng)的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫孵育1～2 h；TBST洗滌3次，每次5 min，滴加顯影液，顯影并拍照。通過(guò)Image J 軟件定量分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用多因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能情況比較

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠FBG、BUN、Scr和24 h-UA均顯著增加（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組和達(dá)格列凈組大鼠FBG、BUN、Scr 和24 h-UA 均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎功能生化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠腎功能生化指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與糖尿病腎病組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別對(duì)照組糖尿病腎病組達(dá)格列凈組溫補(bǔ)固腎方低劑量組溫補(bǔ)固腎方中劑量組溫補(bǔ)固腎方高劑量組24 h-UA/mg 5.49±1.35 44.13±7.39**11.12±2.31##35.74±4.77#30.43±4.45##28.65±5.74##n6 6 6 6 6 6劑量/（g/kg）——0.001 0.92 1.84 3.68 FBG/（mmol/L）5.28±0.25 28.20±4.05**10.59±2.42##23.66±1.99#18.05±2.29##16.23±2.41##BUN/（μmol/L）6.47±1.16 26.75±4.33**8.95±1.54##17.94±4.30##16.53±1.96##12.63±2.42##Scr/（μmol/L）45.07±7.05 101.16±15.82**49.98±7.59##76.69±12.15#69.45±11.19##52.23±11.05##

2.2 各組大鼠組織病理學(xué)情況比較

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎小球體積增大，間質(zhì)增寬，且腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，可見(jiàn)有部分紫紅色糖原沉積，呈典型的糖尿病腎損傷。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組和達(dá)格列凈組大鼠腎小球體積增大，間質(zhì)增寬以及腎小管上皮細(xì)胞空泡變性程度均有不同程度的減輕，且紫紅色糖原沉積明顯降低。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)圖（×400）

2.3 各組大鼠腎纖維化情況比較

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠α-SMA 表達(dá)顯著升高，E-Cadherin 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組和達(dá)格列凈組大鼠α-SMA 表達(dá)顯著降低，E-Cadherin 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腎組織α-SMA和E-Cadherin表達(dá)

2.4 各組大鼠腎組織細(xì)胞自噬水平情況比較

透射電鏡觀察各組大鼠腎組織自噬小體數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬小體數(shù)量顯著減少。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組和達(dá)格列凈組大鼠自噬小體數(shù)量均顯著增加。Western blot檢測(cè)各組大鼠腎組織自噬標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組和達(dá)格列凈組大鼠腎組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

2.5 各組大鼠AMPK/mTOR通路蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。與糖尿病腎病組組比較，溫補(bǔ)固腎方各治療組和達(dá)格列凈組大鼠p-AMPK/AMPK 比值升高，pmTOR/mTOR比值降低（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腎組織AMPK/mTOR通路蛋白表達(dá)

2.6 AMPK 抑制對(duì)溫補(bǔ)固腎方改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的病理?yè)p傷，腎小球基底膜彌散性不均增厚，且伴有明顯的系膜基質(zhì)增生，膠原沉積增多。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方高劑量組大鼠腎組織病理性損傷減輕，腎小球基底膜增厚程度明顯減輕，膠原沉積減少。與溫補(bǔ)固腎方高劑量組比較，溫補(bǔ)固腎方高劑量組 +AMPK抑制劑組大鼠腎組織病理?yè)p傷加重，腎小球基底膜增厚程度明顯加重，膠原沉積增多。與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方高劑量組大鼠自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，p-AMPK/AMPK 比值升高，p-mTOR/mTOR 比值降低（P＜0.01）。與溫補(bǔ)固腎方高劑量組比較，溫補(bǔ)固腎方高劑量組 + AMPK 抑制劑組大鼠自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 AMPK抑制劑對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織病理形態(tài)及纖維化的影響

圖6 AMPK抑制劑對(duì)AMPK/mTOR通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響

3 討論

糖尿病腎病屬于“腎濁”“水腫”“關(guān)格”“腎勞”“溺毒”等范疇，以水液潴留、腎虛陰陽(yáng)失衡為主要特征，陽(yáng)氣虛衰為糖尿病腎病的主要征象，尤其以腎陽(yáng)虛為主，另伴有瘀血內(nèi)阻之象。因此，中醫(yī)臨床治療糖尿病腎病多以補(bǔ)腎、溫陽(yáng)、固腎為主。溫補(bǔ)固腎方具有補(bǔ)氣健脾、溫陽(yáng)、補(bǔ)腎之功［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，溫補(bǔ)固腎方能夠改善糖尿病腎病腎損傷，抑制腎纖維化［5］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎功能出現(xiàn)明顯病理?yè)p傷，α-SMA 表達(dá)增加，ECadherin 表達(dá)降低，腎組織纖維化程度明顯加重。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組大鼠FBG、BUN、Scr、24 h-UA 水平顯著降低，腎損傷明顯降低，α-SMA表達(dá)降低，E-Cadherin表達(dá)增加，表明溫補(bǔ)固腎方具有抗糖尿病腎纖維化作用。但是，目前有關(guān)溫補(bǔ)固腎方抗纖維化的作用機(jī)制尚不明晰。

自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。既往研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病中持續(xù)性的高糖能夠抑制自噬相關(guān)蛋白（LC3、Beclin-1）表達(dá)，降低自噬水平，阻礙細(xì)胞器中積累產(chǎn)生的受損蛋白以及細(xì)胞毒性產(chǎn)物的清除，從而導(dǎo)致糖尿病腎病腎損傷以及腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞功能障礙［9-10］。激活細(xì)胞自噬可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷，改善細(xì)胞功能［11］。以上研究表明，自噬水平的不足可能是導(dǎo)致糖尿病腎病進(jìn)展的重要機(jī)制。GUO 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化中，伴有明顯的自噬抑制，提示自噬可能是糖尿病腎纖維化的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。另外，CAO 等［13］研究證實(shí)，激活細(xì)胞自噬能夠抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及糖尿病腎病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠自噬小體數(shù)量明顯減少，且自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)顯著降低。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組大鼠自噬小體數(shù)量均顯著增加，且自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)顯著升高，表明溫補(bǔ)固腎方可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制糖尿病大鼠腎纖維化。細(xì)胞自噬受到多種誘因和基因調(diào)控的影響，如mTOR、AMPK 以及沉默信息調(diào)節(jié)劑T1等，以上信號(hào)通路與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。高糖環(huán)境下上述信號(hào)通路的激活/抑制是誘導(dǎo)/抑制自噬活性的關(guān)鍵，能夠加重/緩解糖尿病腎損傷加重［14-16］。AMPK 和mTOR 是自噬啟動(dòng)環(huán)節(jié)重要的調(diào)節(jié)因子，其構(gòu)成的AMPK/mTOR 信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞自噬形成的重要通路之一［17］。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR 可以形成兩種不同的復(fù)合物，即mTORC1 和mTORC2。在糖尿病腎病大鼠中能夠觀察到mTORC1信號(hào)通路被顯著激活。在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，mTORC1能夠通過(guò)磷酸化ULK1和ATG13，從而抑制細(xì)胞自噬，被認(rèn)為是自噬的負(fù)調(diào)節(jié)劑［18］。與mTOR 通路相反，AMPK 是自噬的正調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病動(dòng)物模型中AMPK 磷酸化水平被顯著抑制。另外，AMPK 能夠抑制mTOR 通路的活化，降低mTORC1對(duì)ULK1 磷酸化的抑制作用，提高ULK1 活性，從而促進(jìn)自噬啟動(dòng)環(huán)節(jié)［19］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠p-AMPK/AMPK 比值顯著降低，p-mTOR/mTOR 比值顯著升高。與糖尿病腎病組比較，溫補(bǔ)固腎方各劑量組大鼠p-AMPK/AMPK 比值顯著升高，p-mTOR/mTOR 比值顯著降低。以上研究結(jié)果初步表明，溫補(bǔ)固腎方能夠通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制糖尿病大鼠腎纖維化。張哲等［20］研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽能夠通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR 信號(hào)通路，增加自噬水平，從而減輕糖尿病心肌病大鼠心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷，而給予AMPK 抑制劑Compound C 可以逆轉(zhuǎn)利拉魯肽對(duì)AMPK/mTOR 通路的作用，抑制自噬，加重糖尿病心肌病心肌炎癥和氧化應(yīng)激損傷。為進(jìn)一步明確AMPK/mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在溫補(bǔ)固腎方治療糖尿病腎纖維化中的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)溫補(bǔ)固腎方干預(yù)組大鼠給予AMPK 抑制劑Compound C。結(jié)果顯示，AMPK 抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)溫補(bǔ)固腎方對(duì)糖尿病腎纖維化的作用，主要表現(xiàn)為p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，膠原沉積及腎損傷加重。

4 結(jié)論

溫補(bǔ)固腎方能夠激活A(yù)MPK/mTOR 通路介導(dǎo)的自噬改善糖尿病大鼠腎纖維化。本研究結(jié)果初步闡明了溫補(bǔ)固腎方治療糖尿病腎纖維化的作用及調(diào)控機(jī)制，為其治療糖尿病腎纖維化提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。