王雅璐，張淑雅，汪晶，舒孌，王小莉，蘇克雷?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院，國家中醫(yī)藥管理局中藥口服制劑釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028）

銀青抗感口服液是江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的醫(yī)療機構(gòu)制劑，是江蘇省名老中醫(yī)朱啟勇主任醫(yī)師在銀翹散和桑菊飲的基礎(chǔ)上加減化裁而成，由金銀花、大青葉、板藍(lán)根、野菊花、荊芥、連翹、炙甘草等共10味藥組成；具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒等功效，主治伴有發(fā)熱、頭脹痛、咽喉紅腫疼痛、咳嗽、痰黏或黃、鼻塞黃涕等癥狀的感冒（風(fēng)熱證）［1］。風(fēng)熱感冒是風(fēng)熱之邪犯表、肺氣失和所致，是感受風(fēng)熱之邪所致的表證。“風(fēng)熱感冒”一詞最早出現(xiàn)在《諸病源候論·風(fēng)熱候》，載其：“風(fēng)熱病者，風(fēng)熱之氣，先從皮毛入于肺也。肺為五臟上蓋，候身之皮毛，若膚腠虛，則風(fēng)熱之氣，先傷皮毛，乃入肺也。其狀使人惡風(fēng)寒戰(zhàn)，目欲脫，涕唾出?！敝委熞诵翛鼋獗?、發(fā)散風(fēng)熱，常用銀翹散、桑菊飲等［2］。處方中的金銀花與連翹是治療新型冠狀病毒感染的“三方三藥”中連花清瘟顆粒、金花清感顆粒的共同藥材［3］。在新型冠狀病毒流行期間，銀青抗感方亦在臨床發(fā)揮了重要的作用，可以有效應(yīng)對新型冠狀病毒引起的體溫升高、流涕、咽喉疼痛等癥狀。

中藥指紋圖譜能全面、定量地反映中藥所包含的化學(xué)信息，被廣泛應(yīng)用于中藥和中藥制劑的質(zhì)量控制研究工作［4-11］。銀青抗感口服液藥理作用及質(zhì)量控制的研究較少，故本研究建立了銀青抗感口服液高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合動物模型評價其解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，為全面控制和評價銀青抗感口服液的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號：Agilent 1260）；微量分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型號：XP-6）；離心機（上海安亭科技儀器廠，型號：TGL-16B）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司，型號：AG-22331）；細(xì)胞分析儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：Attune NxT）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司，型號：Ⅸ-73）；電子溫度計（德特寵物有限公司，型號：D-10）；酶標(biāo)儀（Thermo，型號：Multiskan FC）；洗板機（HEALES，型號：PW-812）。

1.2 試劑及藥品

阿司匹林維生素C 泡騰片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準(zhǔn)字J20140076）；干酵母（安琪酵母有限公司，國藥準(zhǔn)字H51023524）；地塞米松（信宜有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020793）；二甲苯（南京化學(xué)試劑，批號：C0650110223）；乙酸（南京化學(xué)試劑，批號：A116166）；綠原酸（含量96.8%）、蒙花苷（含量 ≥ 98%）、連翹苷（含量98.9%）（中國食品藥品檢定研究院，批號：110753-201817、111528-202112、110821-200711）；新綠原酸（含量99.67%）、隱綠原酸（含量99.07%）、異綠原酸A（含量98.66%）、異綠原酸B（含量99.05%）、異綠原酸C（含量99.84%）、連翹酯苷A（含量98.33%）（成都曼思特生物技術(shù)有限公司，批號：MUST-20031002、MUST-20042403、MUST-21011110、MUST-20031602、MUST-20031603、MUST-21031105）；表告伊春（含量 ≥ 98%）（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：150715）；大鼠TNF-α、IL-1β 及IL-6 ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特有限公司，貨號：EL-R0012c、EL-R2856c、EL-R0015c）；銀青抗感口服液［江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室研制，批號：20210820（S1）、20210827（S2）、20210903（S3）、20210910（S4）、20210917（S5）、20210924（S6）、20210930（S7）、20211008（S8）、202101015（S9）、20211022（S10）］。

1.3 動物

SD 大鼠（SPF 級）62 只，江蘇中醫(yī)藥研究院動物中心提供，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0025，批號：202127438；KM 小鼠（SPF 級）48 只（江蘇中醫(yī)藥研究院動物中心），體質(zhì)量（20±5）g，雌雄各半，動物許可證號：SYXK（蘇）2021-0025，批號：202120812、202120813。

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立與評價

2.1.1 色譜條件

色譜柱采用SunfireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相，進(jìn)行梯度洗脫（0～22 min：10%A；22～27 min：10%～15%A；27～60 min：15%A；60～95 min：15%～20%A；95～120 min ：20%～32%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：327、245、202 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液

分別精密稱定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹酯苷A、蒙花苷、連翹苷、表告伊春對照品于容量瓶中，加75%甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為58.210、170.720、61.400、67.290、69.480、73.480、46.140、23.350、87.560、58.360 μg/mL的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液

精密量取銀青抗感口服液5 mL，置250 mL容量瓶中，加超純水定容，混勻。取稀釋液5 mL，精密量取，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，混勻，離心，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9 號峰異綠原酸B 為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD均≤ 0.37%，相對峰面積的RSD 均 ≤ 3.7%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9號峰異綠原酸B為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD 均 ≤ 0.37%，相對峰面積的RSD 均 ≤4.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性考察

精密量取編號為S1 的銀青抗感口服液（批號：20210820）5 mL，平行6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄各共有峰的保留時間及峰面積［12］。以9 號峰異綠原酸B為參照峰，計算可知各共有峰的相對保留時間的RSD均 ≤ 0.39%，相對峰面積的RSD 均 ≤ 2.48%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 特征指紋圖譜的生成與相似度評價

按“2.1.3”項下制備編號為S1～S10 的10 批銀青抗感口服液的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣并記錄各樣品色譜圖，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）［13］。以S1為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.3 min，生成銀青抗感口服液的對照特征指紋圖譜和10批銀青抗感口服液的HPLC特征圖譜匹配圖［12］，結(jié)果見圖1 和圖2。其中，共確認(rèn)保留時間穩(wěn)定的共有峰16個，以9號峰異綠原酸B為參照峰，指認(rèn)出10個化合物結(jié)果，分別是1號峰（新綠原酸）、2號峰（綠原酸）、3 號峰（隱綠原酸）、8 號峰（連翹酯苷A）、9 號峰（異綠原酸B）、10 號峰（異綠原酸A）、11 號峰（異綠原酸C）、13 號峰（蒙花苷）、14 號峰（表告伊春）以及16 號峰（連翹苷），結(jié)果見圖3。

圖1 銀青抗感口服液的對照特征圖譜

圖2 10 批銀青抗感口服液樣品特征圖譜

圖3 銀青抗感口服液的對照特征指紋圖譜（R）及混合對照品的 HPLC 圖譜

以9 號峰異綠原酸B 為參照峰，計算S1～S10 號樣品的特征指紋圖譜與對照特征指紋圖譜的相似度，分別為0.912、0.926、0.950、0.948、0.940、0.950、0.953、0.956、0.946，均＞0.9，說明樣品穩(wěn)定性、均一性較好。

2.2 銀青抗感口服液藥效學(xué)評價

2.2.1 給藥溶液的制備

不同濃度銀青抗感口服液的制備：取銀青抗感口服液（生藥量為1.373 g/mL）分別減壓濃縮至生藥量為2.162、2.343 g/mL備用。

陽性藥物的制備：取0.8 g阿司匹林維生素C 泡騰片用水分別配制成濃度為0.008 4 g/mL和0.014 1 g/mL的藥液備用；取0.75 mg 地塞米松用水配制成濃度為0.011 4 mg/mL的藥液備用。

2.2.2 實驗動物分組及給藥

解熱實驗：取SD 大鼠62 只，每天測量肛溫2 次（間隔60 min），連續(xù)3 d，選取溫度差小于0.3 ℃，且在36.6～38.8 ℃范圍內(nèi)的大鼠進(jìn)行實驗［14］。依據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高劑量、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。除空白組外，其余各組大鼠背部皮下注射15%干酵母（10 mL/kg）致熱。陽性藥物組按阿司匹林10 mL/kg（濃度為0.008 4 g/mL），高劑量組按20 mL/kg（濃度為2.162 g/mL）、中劑量組按15 mL/kg（濃度為1.373 g/mL）、低劑量組按7.86 mL/kg（濃度為1.373 g/mL）分別灌胃藥液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水。

抗炎實驗：取KM小鼠48只，依據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。陽性藥物組按地塞米松0.1 mL/10 g，高劑量組按0.27 mL/10 g（濃度為2.343 g/mL）、中劑量組按0.14 mL/10 g（濃度為2.162 g/mL）、低劑量按0.11 mL/10 g（濃度為1.373 g/mL）分別灌胃藥液，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)7 d。

鎮(zhèn)痛實驗：取KM小鼠48只，依據(jù)隨機數(shù)字表隨機分為空白組（等劑量生理鹽水）、模型組、陽性藥物組和銀青抗感口服液高、中、低劑量組（簡稱高、中、低劑量組）。陽性藥物組按0.1 mL/10 g（濃度為0.0141 g/mL），高、中、低劑量組按“2.2.3”項下劑量灌胃，每日1 次，連續(xù)7 d。

2.2.3 標(biāo)本收集

解熱實驗中于初次給藥后0.5、1、2、3、4 h 分別測定大鼠體溫，腹主動脈取血并分離血清，保存于-80 ℃冰箱，備用。

抗炎實驗中第7 天給藥結(jié)束1 h 后，除空白組外，其他各組小鼠右耳正反面均勻涂抹40 μL 二甲苯溶液，誘導(dǎo)小鼠耳組織發(fā)炎腫脹，左耳不涂抹作為自體對照（對照組不處理）。0.5 h后眼眶取血，記錄血常規(guī)指標(biāo)；頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用6 mm打孔器在兩只耳朵相同部位打耳片，稱重［15］。稱重后的耳組織一部分置于10%甲醛中固定，另一部分存入-80 ℃冰箱備用。

鎮(zhèn)痛實驗中第7天給藥結(jié)束1 h后，除空白組外，其他各組小鼠按0.1 mL/10 g腹腔注射0.6%醋酸溶液，引起小鼠疼痛［16-18］。觀察并記錄20 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)（以腹部內(nèi)凹，軀干與后腿伸展，臀部高起為陽性反應(yīng)）。

2.3 觀察指標(biāo)

ELISA 試劑盒測定血清中的內(nèi)源性致熱因子TNF-α 和IL-1β、IL-6 水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。取耳組織置于4%的甲醛固定，按常規(guī)步驟進(jìn)行HE 染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察耳組織病理形態(tài)的變化。記錄小鼠扭體次數(shù)，計算鎮(zhèn)痛抑制率。

鎮(zhèn)痛抑制率（%）=（模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）×100%

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件分析實驗結(jié)果，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差進(jìn)行分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較

給藥1 h 后，各給藥組的體溫差與模型組相比均降低，表明藥物開始發(fā)揮療效。給藥2 h 后，各給藥組與模型組相比，P＜0.01。結(jié)果顯示，陽性藥物組療效最佳，高、中、低劑量組均具有降低體溫的作用，且體溫隨著劑量的增加而降低。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較（±s，℃）

表1 各組大鼠造模后不同時間點體溫差比較（±s，℃）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組4 h 0.08±0.09 1.01±0.17##0.24±0.28**0.33±0.17**0.41±0.10**0.49±0.07**n 10 10 10 10 10 10給藥劑量/（mL/kg）10 10 10 20 15.75 7.88 0 h 0.11±0.17 0.94±0.19##0.92±0.15##0.93±0.16##0.94±0.21##0.95±0.27##0.5 h 0.08±0.13 1.02±0.23##0.94±0.14 0.96±0.15 1.06±0.20 1.05±0.26 1 h 0.11±0.14 0.98±0.18##0.35±0.22**0.48±0.36**0.64±0.24**0.88±0.38 2 h 0.06±0.16 1.04±0.26##0.30±0.22**0.41±0.49**0.49±0.46**0.74±0.28**3 h 0.11±0.17 1.24±0.38##0.27±0.28**0.37±0.17**0.47±0.26**0.56±0.18**

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較

ELISA 結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組中內(nèi)源性致熱源TNF-α、IL-1β 及IL-6 的含量均有明顯的降低（P＜0.01），表明銀青抗感口服液的高、中、低劑量組均有解熱作用。同時這3 種因子也是重要的促炎因子，進(jìn)一步說明銀青抗感口服液還具有一定的抗炎作用。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組IL-6 28.76±3.16 57.51±4.50##35.75±2.81**37.63±3.12**43.33±2.94**50.15±3.41**n8 8 8 8 8 8 TNF-α 43.43±4.43 96.76±4.71##54.12±3.91**52.47±3.95**69.71±4.84**83.11±6.46**IL-1β 92.06±5.56 144.01±5.47##103.80±7.21**100.90±5.63**117.85±5.65**129.12±5.99**

3.3 各組小鼠白細(xì)胞計數(shù)水平比較

抗炎實驗觀察到，與模型組相比，陽性藥物組和高劑量組均可明顯降低白細(xì)胞計數(shù)（P＜0.01）；中劑量組有降低白細(xì)胞計數(shù)的作用（P＜0.05）；低劑量組不明顯。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠白細(xì)胞計數(shù)水平比較（±s）

表3 各組小鼠白細(xì)胞計數(shù)水平比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

白細(xì)胞計數(shù)/（109/L）2.32±0.90 4.97±0.87##2.97±0.62**2.97±0.97**3.90±0.56*4.87±1.01組別空白組模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組n 6 6 6 6 6 6

3.4 HE染色結(jié)果

空白組小鼠耳組織較為狹窄，血管及周圍纖維組織細(xì)胞分層明顯；模型組小鼠耳組織明顯腫脹，血管及周圍纖維組織細(xì)胞分層模糊，出現(xiàn)明顯充血和水腫現(xiàn)象，橫紋肌纖維排列紊亂。不同劑量的銀青抗感合劑對耳組織腫脹程度有不同的改善。陽性藥物組與高劑量組僅存在部分水腫、充血和炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，低劑量組的充血和水腫現(xiàn)象仍十分明顯。結(jié)果見圖4。

圖4 各組小鼠耳組織HE染色結(jié)果圖（×200）

3.5 各組小鼠醋酸扭體實驗結(jié)果比較

與模型組比較，陽性藥物組和高劑量組有明顯鎮(zhèn)痛作用（P＜0.01）；中劑量組小鼠的扭體次數(shù)減少（P＜0.05）；低劑量組無明顯的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠醋酸扭體實驗結(jié)果比較（±s）

表4 各組小鼠醋酸扭體實驗結(jié)果比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別模型組陽性藥物組高劑量組中劑量組低劑量組鎮(zhèn)痛抑制率/%—49.58 48.77 29.75 11.86 n8 8 8 8 8劑量/（mL/10 g）0.10 0.10 0.27 0.14 0.11扭體次數(shù)/次45.38±8.81 22.88±7.10**23.25±6.78**31.88±7.45*40.00±6.07

4 討論

感冒是一種急性感染性呼吸系統(tǒng)疾病，主要由流感病毒導(dǎo)致［19］。臨床用于治療感冒的抗病毒等藥物對患者的肝、腎功能具有一定的損害，而中醫(yī)藥防治該病具有安全性高、全面調(diào)節(jié)的優(yōu)勢［20］。

感冒中最常見的是“風(fēng)熱型”感冒，古籍《風(fēng)熱候》中對感冒屬風(fēng)熱癥的病因病機、表征和治愈過程都有較為詳細(xì)的描述［2］。認(rèn)為風(fēng)邪入侵是風(fēng)熱感冒的主要病因，其病程與個人的正氣盛衰有關(guān)，易感程度與個人體質(zhì)有關(guān)，氣虛皆易感，陰虛易感風(fēng)熱［21］。

銀青抗感方處方量較大、化學(xué)成分復(fù)雜；前期預(yù)實驗中比較了不同比例的流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈系統(tǒng)相較于甲醇系統(tǒng)出峰時間更短，磷酸水溶液相較于甲酸水溶液峰形更好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相。采用DAD 檢測器全波長掃描，結(jié)果表明金銀花（君藥）、野菊花（臣藥）在327 nm 波長下分離度較好，板藍(lán)根（臣藥）在245 nm 下可以檢測出表告伊春含量，連翹（佐藥）在202 nm 波長下色譜峰豐富且分離度較好，故選用327、245、202 nm 這3 個檢測波長。最后對進(jìn)樣前處理進(jìn)行了考察，分別考察溶劑種類（甲醇、水）和除雜方式（離心、過膜），結(jié)果表明樣品濃度為50%的甲醇水溶液時異綠原酸A、B、C 的含量更高。 本研究通過HPLC 建立了銀青抗感口服液樣品的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)了16 個共有峰，并指認(rèn)了其中的10 個共有峰，且結(jié)果表明10 批樣品的相似度均＞0.9，說明 10 批銀青抗感口服液樣品的相似度高，所建立的指紋圖譜能較全面地反映制劑中的整體質(zhì)量。

通過建立3 種不同動物模型，給予不同劑量銀青抗感口服液以評估其藥效。在干酵母致熱實驗中，TNF-α是一種內(nèi)源性致熱源，激活時可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β，IL-6 等因子，三者共同調(diào)節(jié)作用引起體溫升高，同時TNF-α、IL-1β、IL-6 也是典型的促炎因子，可引起炎癥反應(yīng)［22］。筆者觀察到銀青抗感口服液可顯著降低模型大鼠的體溫，ELISA結(jié)果顯示銀青抗感口服液可顯著降低模型鼠血清中的TNF-α、IL-1β及IL-6等因子，表明銀青抗感口服液具有解熱及抗炎的功效。

白細(xì)胞數(shù)是血常規(guī)中的主要成分，具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能，包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。當(dāng)身體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)時，白細(xì)胞計數(shù)會出現(xiàn)病理性升高［16］。筆者發(fā)現(xiàn)銀青抗感口服液可改善模型鼠耳組織的水腫和充血，顯著降低模型鼠血清中白細(xì)胞指數(shù)，降低模型鼠的扭體次數(shù)，表明銀青抗感口服液具有抗炎及鎮(zhèn)痛的功效。

綜上所述，本研究中HPLC 方法結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于銀青抗感口服液方的質(zhì)量評價。藥效學(xué)實驗證明銀青抗感口服液具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛的功效，可為后續(xù)銀青抗感口服液治療風(fēng)熱感冒的機制研究提供依據(jù)。