羅睿杰,曹素英

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

干細胞廣泛存在于動物生長發(fā)育的各個階段,按其分化潛能分為五類,全能干細胞、多能干細胞、多潛能干細胞、寡能干細胞、專能干細胞,這五類干細胞起源于動物生長發(fā)育的不同時期,其分化潛力依次下降[1]。全能干細胞一般可以分化成完整個體和胎盤等胚外組織;多能干細胞具有發(fā)育成胚胎全部三胚層各種細胞的能力,但一般不能形成胚外組織;多潛能干細胞能分化成單一胚層的多種細胞;寡能或?qū)Ｄ芨杉毎荒芊只癁樯砉δ芟嘟膸追N(寡能)或一種(專能)細胞[1-2]。其中,多能干細胞由于具有在無限增殖中保持穩(wěn)定及在一定誘導(dǎo)條件下分化為各種細胞的能力即具有較強的分化潛能,在生物醫(yī)藥、動物育種等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景,成為干細胞領(lǐng)域研究的熱點。

1 依據(jù)小鼠多能干細胞建立干細胞鑒定標(biāo)準

1.1 由小鼠胚胎干細胞建立多能性鑒定標(biāo)準

各種哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中,關(guān)鍵事件和細胞多能性變化規(guī)律大致相同。對于大部分哺乳動物,受精卵及其最初兩次卵裂形成的卵裂球一般被認為是全能干細胞;在八細胞期之后,發(fā)生致密化和極化,產(chǎn)生內(nèi)細胞團(inner cell mass, ICM)和滋養(yǎng)層(trophectoderm, TE),此過程為哺乳動物早期胚胎的第一次譜系分化[3];隨后,第二次譜系分化開始,ICM中進一步產(chǎn)生上胚層(epiblast, EPI)和下胚層(hypoblast, HYPO),胚胎細胞的全能性在兩次譜系分化過程中逐漸喪失,到胚胎附植前后,其中各種細胞均已不具備同時產(chǎn)生完整胚胎和胚外組織的能力[4]。

小鼠是經(jīng)典的生物實驗?zāi)Ｊ絼游?在早期胚胎及多能干細胞領(lǐng)域,小鼠的研究進展明顯快于其他物種,很多干細胞的狀態(tài)和相關(guān)概念最初也是根據(jù)小鼠的干細胞特征被定義。最早的胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)于1981年從小鼠ICM中分離得到[5],隨后幾十年內(nèi),大量研究著眼于獲得更接近體內(nèi)早期胚胎狀態(tài),且能在體外穩(wěn)定維持這種狀態(tài)的多能干細胞[6-8]。對小鼠早期胚胎及小鼠ESCs的研究發(fā)現(xiàn),隨著胚胎發(fā)育的進行,來自不同時期ICM的ESCs多能性狀態(tài)有所不同,由此定義了小鼠多能干細胞的初始(naive)和始發(fā)(primed)狀態(tài),以及后來定義的介于二者之間的形成(formative)狀態(tài)[9]。其中,naive狀態(tài)的ESCs來自小鼠妊娠第4天(簡記為E4,下同)前早期胚胎,這類細胞與體內(nèi)胚胎附植前EPI高度類似,能形成隆起、邊緣清晰的克隆,能進行單細胞傳代,能產(chǎn)生嵌合體后代,能得到四倍體補償個體,被認為是最理想的多能干細胞[8,10]。primed狀態(tài)定義為小鼠胚胎附植后到原節(jié)前期胚胎的EPI(約E7后逐漸產(chǎn)生)所處的狀態(tài),通常稱為上胚層干細胞(epiblast stem cells, EpiSCs);在formative狀態(tài)被定義后,primed干細胞的定義變?yōu)樵c早期至原節(jié)前期胚胎(約E6-8)中分離出的EpiSCs[11]。小鼠的primed狀態(tài)干細胞一般克隆形態(tài)扁平,不能進行單細胞傳代,不能產(chǎn)生生殖系嵌合和四倍體補償個體[12]。formative狀態(tài)于2021年被正式定義,是介于naive和primed之間的一種過渡狀態(tài),存在于小鼠約E5.5～E6.5體內(nèi)胚胎中,其分化潛力、基因甲基化程度、嵌合體形成能力也介于naive和primed之間[13-15]。研究表明,不同狀態(tài)的多能干細胞在細胞形態(tài)[16]、基因表達[17]、表觀遺傳特征[18]、發(fā)育潛力[2]等方面存在區(qū)別。

干細胞多能性的鑒定標(biāo)準也在早期研究的基礎(chǔ)上建立,包括六個層面[18]:1)體外分化,在體外誘導(dǎo)條件下分化為三胚層細胞,通過檢測三胚層特異性蛋白進行鑒定;2)畸胎瘤實驗,將多能干細胞注入免疫缺陷鼠皮下,使其在體內(nèi)條件下自發(fā)分化,在所得畸胎瘤中檢測三胚層特異性蛋白;3)嵌合體實驗,將供體干細胞注入桑椹胚或早期囊胚階段的胚胎中,待嵌合胚胎形成后,檢測供體細胞對胚胎和胎兒發(fā)育的貢獻;4)生殖系嵌合,在形成嵌合胚胎的基礎(chǔ)上,在生殖器官中檢出供體細胞的貢獻,并產(chǎn)生功能性配子;5)四倍體補償,將供體干細胞注入四倍體囊胚,產(chǎn)生完全由供體發(fā)育成的胚胎;6)單細胞嵌合,多能性是每一個多能干細胞都應(yīng)該具有的性質(zhì),將單個多能干細胞注入四倍體囊胚,令單個供體干細胞發(fā)育成完整胚胎,是目前干細胞多能性最嚴格的標(biāo)準。這六個層面嚴格程度依次遞進,一般認為至少通過生殖系嵌合實驗的干細胞可以被稱為naive干細胞,其中一些naive干細胞已經(jīng)可以通過四倍體補償實驗;primed干細胞一般需要通過畸胎瘤形成實驗,少數(shù)primed干細胞注入囊胚后,嵌合體中可以檢出極微量的供體干細胞貢獻[19]。

1.2 由小鼠誘導(dǎo)多能干細胞建立重編程鑒定標(biāo)準

直接研究和使用早期胚胎中的干細胞面臨兩項最重要的問題:第一,難以從早期胚胎中獲取狀態(tài)良好的干細胞,這是因為胚胎發(fā)育是一個連續(xù)的過程,細胞的多能性在整個過程中逐漸衰退,這一過程非常迅速,理想的多能干細胞僅存在于一個極小的時間窗口中[13-14,20];第二,獲取和研究人ESCs涉及對人類胚胎的采集和破壞,存在醫(yī)學(xué)倫理問題,因此在動物上得出的試驗結(jié)果難以遷移到人上進行測試[21-22]。

哺乳動物體細胞克隆最早于1996年成功,這一技術(shù)的誕生證明了高度分化的細胞可以通過重編程重獲多能性[23]。受到哺乳動物克隆的啟發(fā),研究人員開始關(guān)注如何利用體細胞重編程等技術(shù),將體細胞去分化以產(chǎn)生多能性細胞。2006年,Takahashi和Yamanaka[24]將OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC(OSKM) 4種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細胞,從中分離得到了最早的誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。該細胞系具有和ESCs相似的增殖能力、分化潛力等特性。隨后,人[25]、大鼠[26]、猴[27]、豬[28-30]、牛[31]、羊[32-33]、馬[34]等的iPSCs先后建立。誘導(dǎo)體系也由最初的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逐漸改進,產(chǎn)生了非整合型載體誘導(dǎo)[35]和化學(xué)重編程[36]等非轉(zhuǎn)基因重編程體系,為iPSCs的獲取和應(yīng)用提供了更加安全、高效的途徑。采用類似的思路,針對其它干細胞特點設(shè)計因子組合,也可以獲得誘導(dǎo)滋養(yǎng)層干細胞、誘導(dǎo)胚外內(nèi)胚層干細胞等不同類型的干細胞[37]。

雖然iPSCs不是直接取自早期胚胎,但由于其具有和ESCs相似的特征,可以按其與各狀態(tài)ESCs的相似性定義iPSCs的多能性狀態(tài)。鑒定iPSCs是否完全重新編程的幾個標(biāo)準已經(jīng)確立,包括4個方面[38]:1)與ESCs高度相似的形態(tài)特征和自我更新能力;2)遺傳和表觀遺傳學(xué)特征與ESCs高度相似,可通過免疫熒光染色等方法從iPSCs中檢出ESCs特異性關(guān)鍵多能性因子和表面抗原;3)外源基因沉默,多能性的維持不依賴于轉(zhuǎn)基因表達;4)分化潛力,包括“1.1”中所述多能性鑒定的六個層面。不同于多能性鑒定,完全重編程的四種判斷標(biāo)準是平行的,即只有同時符合這4點要求的干細胞才是“真正的iPSCs”。小鼠iPSCs已經(jīng)通過上述驗證,而多數(shù)大家畜iPSCs存在誘導(dǎo)效率低[13]、致瘤性[39]、多能性維持依賴于外源因子[40]等問題,與體內(nèi)胚胎中的多能干細胞還存在較大的差距。

2 大家畜多能干細胞研究進展

大家畜既可以為人類提供食物、毛皮,也可供役使、休閑旅游、體育競賽等活動,一些家畜還可以用于人類醫(yī)學(xué)研究。大家畜干細胞在動物育種、人造肉生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)研究模型建立等方面有廣闊的應(yīng)用前景。目前,大家畜干細胞的研究進展落后于小鼠,大部分家畜干細胞仍存在一些顯著缺陷,大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家畜多能干細胞的有效方法尚未建立。

2.1 種間差異限制家畜干細胞研究與應(yīng)用

所有哺乳動物胚胎發(fā)育過程大致相似,但大量研究已經(jīng)證明,大家畜在生殖周期[41]、早期胚胎發(fā)育[42-43]、胚胎著床時間[44]、多能性調(diào)控機制[45]、表觀遺傳[42]等方面與小鼠有顯著不同,這些不同是將產(chǎn)生小鼠多能干細胞的方法直接遷移到大家畜上難以得到優(yōu)質(zhì)干細胞的主要原因[17,46]。

與小鼠等經(jīng)典實驗動物相比,大家畜的生殖周期長,繁殖率低[41],因此,很難根據(jù)在小鼠實驗中得到的結(jié)果準確推導(dǎo)出豬、牛、羊等動物體內(nèi)胚胎的生長發(fā)育規(guī)律。與小鼠相比,家畜早期胚胎中多能干細胞的多能性維持機制更復(fù)雜,需要更多因子的支持[47]。此外,家畜外胚層發(fā)育方面與小鼠也存在明顯不同[42],在這些方面,家畜與人類更加接近[43,48],因此在近幾年的涉及干細胞的醫(yī)學(xué)研究中,豬等家畜作為模式動物的比例明顯增加。然而大家畜與人也存在很多種間差異,例如豬和人的胎盤結(jié)構(gòu)、早期胚胎代謝調(diào)控、細胞膜蛋白等方面存在明顯不同[17]。

以上種間差異使得直接借鑒小鼠的研究成果進行家畜多能干細胞的分離是不可行的,因此,獲得高質(zhì)量家畜干細胞以期用于家畜育種研究的進展緩慢。同時,種間差異也導(dǎo)致很多在大家畜上得到的結(jié)論在推廣到人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域時面臨許多障礙,限制了家畜干細胞在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2 家畜干細胞多能性調(diào)控

研究干細胞多能性調(diào)控機理是建立多能干細胞系的基礎(chǔ),干細胞建系的嘗試也可以進一步推動對多能性調(diào)控的研究。大家畜干細胞多能性維持機制較為復(fù)雜,有關(guān)的信號通路包括JAK/STAT、Activin/Nodal、FGF/ERK、Wnt/β-catenin等。通過阻斷或抑制相關(guān)信號通路,可以使早期胚胎發(fā)育停滯在特定時期[49-51],這是從動物胚胎中獲取多能干細胞的主要方法;強制表達某些關(guān)鍵因子,可以改變細胞的多能性,實現(xiàn)不同類型、不同狀態(tài)干細胞之間的相互轉(zhuǎn)換[52-53],還可以將已分化的體細胞去分化制備不同類型的誘導(dǎo)多能干細胞[24]。對體細胞與干細胞之間、不同類型干細胞之間相互轉(zhuǎn)化的研究,可以幫助人們更好地理解細胞命運決定以及多能性轉(zhuǎn)變的機理。

JAK/STAT信號通路中的核心因子是STAT3,該通路的激活使得STAT3形成同質(zhì)或異質(zhì)二聚體,二聚體入核后可激活TFCP2L1、KLF4、ESRRB、GBX2等對naive ESCs維持有重要作用的基因;白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)是JAK/STAT信號通路的重要激活因子,LIF可以與細胞表面LIFR-GP130受體結(jié)合,激活JAK,進一步使STAT3磷酸化,促使STAT3二聚體形成[54]。通過在培養(yǎng)體系中添加LIF,充分激活JAK/STAT信號通路是小鼠ESCs維持多能性的重要條件[6];在一些大家畜干細胞建系的研究中,撤去LIF不利于豬和羊干細胞維持多能性狀態(tài)[55-56],另一些研究表明,LIF對豬干細胞多能性的獲得有重要作用,但不是多能性維持的必要條件[57];Kim等[58]通過微陣列測序分析發(fā)現(xiàn)STAT3的活化是建立牛ESCs的關(guān)鍵因素。

Activin/Nodal信號通路作用廣泛,調(diào)控包括早期胚胎細胞命運決定、器官發(fā)生、成體組織穩(wěn)態(tài)等在內(nèi)的很多過程[59]。Activin和Nodal與跨膜受體結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SMAD蛋白,SMAD入核后誘導(dǎo)染色體特定位點的表觀遺傳修飾發(fā)生改變,從而激活或抑制相應(yīng)基因的表達[60]。小鼠EpiSCs和人ESCs依賴Activin A維持多能性[61-62];在家畜中,抑制Activin/Nodal信號通路會導(dǎo)致豬多能干細胞克隆形態(tài)無法維持[57]。

FGF/ERK信號通路受成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)調(diào)控,FGF與細胞膜上受體結(jié)合,引發(fā)MEK和ERK級聯(lián)磷酸化,ERK入核激活下游靶基因[63]。FGF/ERK信號通路對不同物種干細胞的作用不同。對于小鼠,激活FGF/ERK信號通路誘導(dǎo)ESCs分化[64],FGF受體抑制劑PD0325901有助于維持小鼠ESCs的多能性[65-66];對于人ESCs和人EpiSCs,在培養(yǎng)體系中添加FGF以激活FGF/ERK通路,可以促進干細胞自我更新[12,62];對于牛,PD0325901對ESCs維持沒有顯著作用[67];對于豬,外源FGF可以促進ESCs原代克隆產(chǎn)生[68],從EpiSCs培養(yǎng)體系中撤去FGF會導(dǎo)致其無法正常增殖和傳代[57];對于羊ESCs和iPSCs,撤去FGF都會導(dǎo)致多能性無法維持[69-70]。

Wnt/β-catenin信號通路受干細胞自分泌或旁分泌的Wnt控制,當(dāng)Wnt存在時,具有分解β-catenin功能的“降解復(fù)合物”招募至細胞膜,其中GSK3活性受到抑制,無法促進β-catenin降解,細胞質(zhì)中的β-catenin可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)移入核,從而調(diào)控細胞分化;當(dāng)缺少Wnt配體時,細胞內(nèi)“降解復(fù)合物”中的GSK3和CK1促進β-catenin磷酸化,使其在細胞質(zhì)中降解[51]。Wnt信號在多能性調(diào)控中具有雙重作用[71],通過添加Wnt3a或GSK3α/β抑制劑CHIR99021激活信號通路,并添加LIF激活JAK/STAT,可以促進小鼠ESCs維持和自我更新[8,72],對Wnt/β-catenin信號通路進行調(diào)節(jié)可使小鼠ESCs向EPI樣干細胞轉(zhuǎn)化[20];在人ESCs和EpiSCs中,激活Wnt/β-catenin信號通路會導(dǎo)致干細胞分化[73],缺乏Wnt通路活性可以使人ESCs向滋養(yǎng)層干細胞轉(zhuǎn)化[74];在家畜中,抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是多能干細胞維持的一個必要因素,豬、牛、羊ESCs的維持均依賴于Wnt/β-catenin通路抑制劑IWP2、IWR1或XAV939[75-77]。

2.3 家畜多能干細胞系的建立

2.3.1 家畜ESCs建系的嘗試 早期的家畜ESCs大部分參考小鼠或人ESCs建系的方法,從家畜早期胚胎中分離建系。1990年前后,研究人員進行了豬[78]、牛[79]、羊[80]ESCs體外培養(yǎng)的最早嘗試。由于對干細胞維持機理的研究不夠深入,當(dāng)時的家畜ESCs多數(shù)不能長期維持,分化潛力也存在明顯的缺陷,只能稱為“類ESCs”。

隨著對多能性調(diào)控通路的研究開展,一些具有調(diào)節(jié)信號通路活性功能的因子被用于家畜干細胞建系,家畜干細胞系的質(zhì)量也得到了明顯提升。2009年,Cao等[67]在牛ESCs建系的過程中使用了FGF,結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加FGF有助于牛ESCs的維持。次年,Vassiliev等[19]嘗試用LIF、Activin A、FGF2穩(wěn)定豬ESCs,得到了1株ESCs,并得到了嵌合體,但該細胞系仍不能在體外長期穩(wěn)定維持。2011年,Zhao等[70]從綿羊E6-E8胚胎ICM中分離ESCs,在添加CHIR99021和FGF的培養(yǎng)體系中獲得了能傳30代的綿羊ESCs,該綿羊ESCs表達多種多能干細胞標(biāo)志物,注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)觀察到畸胎瘤產(chǎn)生,但僅能從畸胎瘤中找到外胚層和中胚層組織。2012年,在含有GSK3β抑制劑CHIR99021和MEK抑制劑PD184352的培養(yǎng)體系下,1株可傳100代的豬ESCs成功建系[81]。2013年,兩項關(guān)于牛ESCs的研究表明,CHIR99021和PD0325901能有效促進牛ESCs表達干細胞標(biāo)志物[82-83]。2018年,Bogliotti等[84]在牛ESCs建系上取得了重大進展,該研究參考了人ESCs的培養(yǎng)方法,使用添加FGF2和IWR-1的“CTFR”培養(yǎng)體系,從體外胚胎中獲取了具有primed狀態(tài)多能性特征的牛ESCs。該細胞系能進行中長期傳代,70代后仍具有多能干細胞的正常形態(tài)、核型、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳學(xué)特征,并能產(chǎn)生畸胎瘤,沒有產(chǎn)生嵌合體。隨后,Vilarino等[77]基于該培養(yǎng)體系獲得了綿羊ESCs,該細胞系能穩(wěn)定傳代40代以上,形態(tài)、核型、多能性標(biāo)志物表達穩(wěn)定,能形成包含三胚層組織的畸胎瘤,未能形成嵌合體。這些研究同時也表明牛和羊ESCs的產(chǎn)生與維持依賴于培養(yǎng)基中IWR1和FGF的添加。2021年,Yu等[14]在含有FGF、Activin A、CHIR99021和PD0325901的培養(yǎng)體系中獲得了馬ESCs和非轉(zhuǎn)基因馬iPSCs。

這些早期研究表明,對于各種大家畜,干細胞多能性維持所依賴的信號通路相對保守,對JAK/STAT、Activin/Nodal、FGF/ERK、Wnt/β-catenin等通路的調(diào)節(jié)是大家畜ESCs成功建系的關(guān)鍵。

2.3.2 家畜iPSCs建系的嘗試 在家畜iPSCs的早期研究中,除傳統(tǒng)的OSKM四因子外,NANOG、LIN28、TERT等因子也常被補充到誘導(dǎo)體系中。綜合相關(guān)文獻報道,在OSKM的基礎(chǔ)上增補因子對牛[31,85]、羊[33]iPSCs誘導(dǎo)效率有明顯影響,但對iPSCs多能性的影響有限;外源因子的物種來源對iPSCs的誘導(dǎo)效率和質(zhì)量有一定影響,使用同種因子誘導(dǎo)iPSCs通常具有較高的效率和比較理想的多能性狀態(tài)[86]。

后期關(guān)于iPSCs的研究多圍繞誘導(dǎo)體系的開發(fā)與優(yōu)化[87]、改進培養(yǎng)條件以提高iPSCs產(chǎn)生效率[88]和減少iPSCs凋亡[89]等問題開展研究。2021年,Yoshimatsu等[76]通過化學(xué)小分子誘導(dǎo)法,在大家畜中實現(xiàn)了非轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)、內(nèi)源基因維持的重編程,誘導(dǎo)豬等多種哺乳動物成纖維細胞重編程,獲得了iPSCs,并成功誘導(dǎo)其分化為三胚層組織。非轉(zhuǎn)基因iPSCs具有與ESCs相似的特征,來源比ESCs更廣泛,且被認為比轉(zhuǎn)基因iPSCs更安全,有望成為干細胞研究、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域新的有力工具。

2.3.3 建立穩(wěn)定的豬多能干細胞系 雖然關(guān)于建立豬ESCs和豬iPSCs的報道很多,但前者不能長期穩(wěn)定傳代,后者缺乏naive干細胞的一些特性,如TBX3和KLF4的表達等,很多iPSCs外源因子無法沉默[90-91],二者都未達到體內(nèi)多能干細胞的多能性狀態(tài),大部分只能稱作“類ESCs”、“類iPSCs”。為了在大家畜中產(chǎn)生“真正的多能干細胞”,需要對胚胎發(fā)育早期的多能性變化規(guī)律進行深入研究。近年來,一些研究揭示了豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組的譜系特異性、干細胞多能性變化和X染色體失活的特征[2,43,92],報道了豬與人或猴早期胚胎的種間差異[17]。2021年,Yoshimatsu等[76]報道了一種不含轉(zhuǎn)基因的豬多能干細胞,該細胞能在含有Wnt信號通路抑制劑IWP2的培養(yǎng)基中長期保持多能性,表明抑制Wnt信號通路可能是豬多能干細胞維持的關(guān)鍵。

在這些研究的基礎(chǔ)上,穩(wěn)定的豬原腸化前上胚層干細胞(pre-gastrulation epiblast stem cells, pgEpiSCs)成功建系[57]。該研究使用Wnt抑制劑IWR-1-endo和GSK3β抑制劑CHIR99021對Wnt信號通路進行綜合調(diào)節(jié),抑制早期胚胎向原腸胚發(fā)育,并促進干細胞穩(wěn)定增殖,用SRC抑制劑WH-4-023阻斷上皮-間充質(zhì)自發(fā)轉(zhuǎn)化,使用人源LIF(L)、Activin A(A)、FGF(F)穩(wěn)定并增強干細胞的多能性,開發(fā)了包含三種抑制劑和三種細胞因子的新型“3i/LAF”培養(yǎng)體系?；谠撆囵B(yǎng)體系,從豬E10外胚層細胞中建立了可穩(wěn)定傳代240代以上,核型和分化潛能仍保持穩(wěn)定的多能干細胞系,并對其進行了3次連續(xù)基因編輯,產(chǎn)生了多基因編輯仔豬。隨后,不依賴外源基因的豬iPSCs也在該體系中成功產(chǎn)生,該細胞系與pgEpiSCs具有相似性,能夠在體外長期穩(wěn)定維持多能性[93]。

穩(wěn)定豬多能干細胞的成功建系是大家畜干細胞研究的重要突破,多基因編輯的成功可以降低復(fù)雜動物模型制作的成本和難度。此外,牛和羊ESCs的多能性相關(guān)通路與豬具有相似性,穩(wěn)定豬多能干細胞系首先成功建立,對其它大家畜穩(wěn)定多能干細胞的建系有指導(dǎo)和啟發(fā)的作用。

3 大家畜多能干細胞的應(yīng)用前景與展望

多能干細胞因具有多向分化潛力,且易于進行基因編輯,在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、動物育種、醫(yī)學(xué)、食品生產(chǎn)等方面有廣闊的應(yīng)用前景(圖1)。目前,多能干細胞的應(yīng)用還處在研究和探索階段,尚未大規(guī)模應(yīng)用于實際生產(chǎn)。

圖1 家畜多能干細胞的應(yīng)用前景Fig.1 Application prospects of livestock pluripotent stem cells

3.1 在家畜育種與繁殖中的應(yīng)用前景

傳統(tǒng)家畜育種方法要求將每一代家畜飼養(yǎng)到能穩(wěn)定產(chǎn)生配子,這通常需要一年以上的時間。為了繞過這一耗時很長的過程,有科學(xué)家提出了干細胞育種概念。干細胞育種的核心技術(shù)是在體外獲得家畜多能干細胞,將所獲得的多能干細胞誘導(dǎo)分化為生殖細胞,再結(jié)合體外受精、單精子顯微注射等技術(shù)產(chǎn)生受精卵。通過這種方式,可以有效縮短世代間隔、提高育種效率,加速家畜育種進程,還能增加每個個體產(chǎn)生的配子數(shù)目,快速獲得大量遺傳物質(zhì)相同的個體,有利于良種擴繁[94]。

哺乳動物的精子由精原細胞經(jīng)多級分裂和分化產(chǎn)生[95]。目前,小鼠多能干細胞向精原干細胞的體外分化誘導(dǎo)研究最成熟,已經(jīng)可以在體外獲得功能性生殖細胞,并由此產(chǎn)生生殖功能正常的后代[96]。在大家畜中,已有多項關(guān)于精原細胞增殖、精子發(fā)生和活性維持等的研究[97-98],但從干細胞建立的生殖細胞仍存在一些不足,培養(yǎng)體系有待改進和完善[94]。

哺乳動物的卵子來源于卵巢中的卵原細胞。卵子的發(fā)生依靠卵巢和卵泡組織的調(diào)控,這種復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)難以在體外模擬[15,22]。由人和小鼠多能干細胞產(chǎn)生卵巢組織或卵原細胞的研究已經(jīng)成功[22,99],為大家畜卵子的體外建立提供了思路。

3.2 在人類醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景

基因編輯是制作疾病模型的一種方法,多能干細胞易于進行基因編輯,且具有強大的增殖和分化能力,因此長期以來一直是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的熱點。多能干細胞與基因編輯、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)結(jié)合,在病理學(xué)研究、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景[45]。多年來,小鼠、人和非人靈長類動物多能干細胞在心臟疾病[100]、血液系統(tǒng)疾病[101]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[102]等領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得一定進展,在藥物試驗方面也有應(yīng)用。但由于體外試驗難以建立完全符合真實動物機體環(huán)境的條件,很多干細胞治療方法在臨床上遭遇失敗[45]。

與小鼠、犬等實驗動物相比,豬在進化上距離人類更近[103],并且在解剖結(jié)構(gòu)[104-105]、生理機能[105-106]、早期胚胎發(fā)育[48]等方面與人類更接近;與猴等非人靈長類動物相比,豬的繁殖率更高,性成熟更早[103],適合作為醫(yī)學(xué)研究中的模式動物。目前,豬已開始成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的實驗動物,豬多能干細胞現(xiàn)已被應(yīng)用于心血管疾病、結(jié)腸癌、骨肉瘤、糖尿病、囊性纖維化、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、阿爾茨海默病、亨廷頓病、免疫系統(tǒng)疾病等人類疾病研究中的動物模型建立[42,106-108]。牛、羊和馬也開始成為研究人類疾病的模式動物。奶牛與人具有相似的生殖周期,具備成為研究人類卵巢和子宮疾病模型的可能[42]。綿羊體型較大,天性溫馴,便于手術(shù)操作,可用于手術(shù)技術(shù)優(yōu)化;呼吸系統(tǒng)與人類相似,可作為哮喘等呼吸道疾病的模型,也被用于鼻噴疫苗研發(fā)[109]。馬與人在運動機能、肌腱組成及結(jié)構(gòu)、肌腱損傷方式上具有相似性,將馬多能干細胞在體外誘導(dǎo)分化為肌腱組織,可以作為研究人類骨骼與肌肉損傷的模型[110]。除制作疾病模型外,多能干細胞已經(jīng)可以被誘導(dǎo)分化為肝[111]、胰腺[112]、神經(jīng)組織[113-114]、肌肉組織[110]、內(nèi)耳組織[115]、腸道[116]等器官(類器官)和組織,與動物體內(nèi)試驗相比,這些由干細胞誘導(dǎo)分化形成的組織便于觀察、檢測和操作;與細胞試驗相比,這些組織可以更有效地模擬體內(nèi)復(fù)雜的環(huán)境,為病理研究、藥物開發(fā)領(lǐng)域提供一種新的體外模型。若能進一步將多能干細胞誘導(dǎo)分化為具有正常結(jié)構(gòu)和功能,并且體積與真實人體器官相近的體外器官,可以填補移植用器官的需求缺口;另一種思路是對動物多能干細胞進行基因編輯,產(chǎn)生基因編輯動物,從動物體內(nèi)獲取不會引起人免疫排斥的異種器官。后者的相關(guān)研究已取得初步成果[117-118]。

3.3 作為細胞培養(yǎng)肉種子細胞

進入21世紀以來,隨著世界各國經(jīng)濟和人口規(guī)模迅速增長,對肉類食品的需求也在持續(xù)上升。在市場需求的拉動下,畜牧業(yè)快速發(fā)展,不僅帶來了大量的碳排放和其他污染,還增大了人畜共患病傳播等公共衛(wèi)生的潛在風(fēng)險;過快的發(fā)展導(dǎo)致很多養(yǎng)殖場飼養(yǎng)密度大、飼養(yǎng)環(huán)境差,也伴隨著動物福利方面的問題。為減少畜牧業(yè)對地球環(huán)境的污染,同時更好地提升動物福利、減少人畜共患病的傳播,迫切需要開發(fā)一種綠色、低碳、安全的肉類替代品。

細胞培養(yǎng)肉是一項新興生物技術(shù),主要原理是通過從家畜體內(nèi)直接提取或其他方法獲得具有產(chǎn)生肌肉能力的干細胞,通過細胞工程手段,在發(fā)酵罐等工業(yè)設(shè)備中使其生長,從培養(yǎng)基上而不是畜禽體內(nèi)獲得肉類。與傳統(tǒng)畜牧業(yè)相比,細胞培養(yǎng)肉預(yù)計可以節(jié)約7%～45%的能源、82%～96%的用水、近99%的用地,污染物排放預(yù)計減少78%～96%,且由于培養(yǎng)過程在潔凈工廠、密閉設(shè)備中進行,基本可以杜絕人畜共患病傳播的風(fēng)險[119]。

作為一項新興技術(shù),細胞培養(yǎng)肉仍面臨很多重大技術(shù)瓶頸,如用于培養(yǎng)的干細胞大規(guī)模生產(chǎn)、培養(yǎng)基成分設(shè)計、工業(yè)生產(chǎn)用大型生物反應(yīng)器設(shè)計、3 D組織支架生產(chǎn)、肌肉與脂肪等不同組織之間組裝等[119-120],這些技術(shù)難題都是細胞培養(yǎng)肉發(fā)展需要攻克的重要障礙。

目前,能穩(wěn)定傳代的豬和牛多能干細胞系已經(jīng)建立,為細胞培養(yǎng)肉提供了可能的細胞來源[57,90]。由豬iPSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生骨骼肌的研究已經(jīng)成功[121],包含肌肉纖維、脂肪組織和毛細血管的細胞培養(yǎng)牛肉也已經(jīng)在實驗室成功獲得[122]。雖然細胞培養(yǎng)肉技術(shù)距離向市場大規(guī)模推廣還有很長的距離,但已經(jīng)可以預(yù)見,細胞培養(yǎng)肉具有在未來成為低碳、節(jié)能、安全、營養(yǎng)的新型食品的潛力。

4 總 結(jié)

目前,豬的穩(wěn)定ESCs已經(jīng)成功建系,牛、羊、馬等常見家畜ESCs的建系也取得了一定進展,但后者在穩(wěn)定性方面仍存在不足,無法產(chǎn)生嵌合體或ESCs對嵌合體貢獻極低,未見產(chǎn)生四倍體補償胚胎的報道。不同物種的多能性調(diào)控機制存在差異,想要更好地建立各種家畜的穩(wěn)定ESCs系,需要對這些家畜早期胚胎中多能性調(diào)節(jié)過程進行深入研究。此前的一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)豬、牛、羊等家畜在多能性調(diào)節(jié)通路方面存在相似性,參考穩(wěn)定豬ESCs的建系方法,并結(jié)合其它大家畜的早期胚胎發(fā)育特點,可能有助于其它家畜ESCs的建立。

在iPSCs方面,各種大家畜的iPSCs均已建立,并具備比較穩(wěn)定的多能性,但很多家畜iPSCs的維持依賴外源基因表達,外源基因不能沉默是家畜iPSCs研究中亟待解決的問題。在家畜iPSCs產(chǎn)生嵌合體的嘗試中,iPSCs對嵌合后代的貢獻較低,反映這些iPSCs的多能性仍有不足。此外,對于iPSCs的應(yīng)用,安全性問題仍是主要疑慮之一?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因iPSCs已經(jīng)在小鼠上取得成功,有望成為一種更安全的多能干細胞來源,而大家畜仍需要繼續(xù)探索不依賴轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)方法。

家畜多能干細胞在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、動物育種、再生醫(yī)學(xué)、食品生產(chǎn)等多領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用潛力,但很多領(lǐng)域還無法將研究結(jié)果應(yīng)用到實際生產(chǎn),對家畜多能干細胞開展深入的研究有重要意義。隨著對于家畜干細胞多能性調(diào)控機理的深入解析,相信在不久的將來,多能干細胞可以在各領(lǐng)域大放異彩。