胡紫平,王立剛,宗文成,侯任達(dá),蘇艷芳,牛乃琪,王立賢,王 源,張龍超*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,青島 266109)

中國是世界上地方豬品種遺傳資源最豐富的國家之一[1]。許多中國地方豬種有著自己獨特的特點,如產(chǎn)仔數(shù)高[2]、抗病力強(qiáng)[3]及抗逆性強(qiáng)[4]等。但是由于商品豬種的引入,導(dǎo)致本土豬品種的生存空間減少,許多本土豬品種的數(shù)量和群體規(guī)模都急劇下降,遺傳資源瀕臨滅絕[5]。因此,評估本土豬種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)勢在必行,以開發(fā)基于基因的選擇工具和品種保護(hù)。隨著單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片和重測序技術(shù)的發(fā)展,可以分析個體的基因型信息[6],構(gòu)建個體或群體間的遺傳關(guān)系,這極大的幫助了中國本土豬種選育和保種工作。近年來,基于SNP芯片和重測序數(shù)據(jù)分析,對金華豬[7]、寧鄉(xiāng)豬[8]、江曲海豬[9]、安慶六白豬[10]和萊蕪豬[11]等一些品種進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)的研究,有助于推動遺傳資源的研究和保護(hù)。Wang等[12]對江西省3個地方品種東鄉(xiāng)斑點豬、萍鄉(xiāng)兩頭烏、玉山黑豬的研究發(fā)現(xiàn),東鄉(xiāng)斑點豬和玉山黑豬最近經(jīng)歷了嚴(yán)重的近親繁殖。這兩個品種顯示出較大的純合度值,連鎖不平衡的長程范圍和觀察到的雜合度降低。相比之下,萍鄉(xiāng)兩頭烏遺傳多樣性豐富,近交個體少。Meng等[13]利用全基因組SNP芯片數(shù)據(jù)分析閩豬保守種群的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),閩豬保護(hù)種群的遺傳多樣性水平不足,近5代中,保守種群近親繁殖程度顯著提高,有效種群含量大幅下降。由于歐洲商品豬種的滲入,以及育種過程的不科學(xué),有必要構(gòu)建閩豬核心保護(hù)種群的分子譜系。

劍白香豬是我國珍貴的豬品種遺傳資源,原產(chǎn)于貴州省黔東南苗族侗族自治州劍河縣,是小型豬的代表豬種[14]。劍白香豬頭部、尾部為黑色,中間白色,稱之為兩頭烏;耳尖下垂、腹部微凹,四肢短小,總體體型矮小,故而當(dāng)?shù)赜址Q之為蘿卜豬[14]。劍白香豬具有肉質(zhì)細(xì)嫩,肉香味美的特點[15],是我國重要的遺傳資源之一。受非洲豬瘟影響,劍白香豬能繁母豬的規(guī)模從2018年以前的500頭以上迅速銳減至如今的150頭以下,種業(yè)安全受到極大威脅。并且,對于劍白香豬當(dāng)前群體結(jié)構(gòu)的研究尚未見報道。因此,本研究利用SNP芯片信息,對劍白香豬當(dāng)前群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,以便掌握劍白香豬群體的遺傳現(xiàn)狀,為劍白香豬種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù),也為劍白香豬的種業(yè)安全和群體復(fù)壯提供重要的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以貴州省黔東南苗族侗族自治縣南寨鎮(zhèn)、柳川鎮(zhèn)、岑松鎮(zhèn)和磻溪鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的138頭劍白香豬(母豬119頭,公豬19頭)為研究對象,采集耳組織樣本并放入冷凍保存管中,后迅速放入-20 ℃冰箱中保存,用“苯酚-氯仿法”提取樣品DNA。

1.2 基因分型和質(zhì)量控制

利用Porcine SNP50 BeadChip(Illumina, United States)芯片對138個劍白香豬DNA樣品進(jìn)行全基因組SNPs檢測,累計得到50 697個SNPs用于后續(xù)分析。使用plink(v1.90)進(jìn)行SNP數(shù)據(jù)質(zhì)量控制,質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下:剔除個體缺失率>10%的個體;剔除SNP缺失率>10%的個體;剔除最小等位基因頻率<5%的個體;剔除性染色體上的SNPs。質(zhì)控后共獲得了137個劍白香豬個體的基因型數(shù)據(jù),得到19 518個SNPs用于后續(xù)分析。

1.3 方法

1.3.1 主成分回歸分析 PCA(principal component analysis,PCA)又稱主成分回歸分析或主分量分析, 在統(tǒng)計學(xué)中采用降維思想, 將多變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合變量, 能夠簡化數(shù)據(jù)集, 在多元統(tǒng)計分析中是一種重要的統(tǒng)計方法, 選出主成分以有效利用大量數(shù)據(jù)并降低工作量[16]。所謂主成分就是通過原始變量的線性組合形成的數(shù)個綜合指標(biāo)。目前,PCA已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè),已成為研究畜禽品種分類、來源和進(jìn)化、選育以及各種生產(chǎn)性能的重要工具。使用GCTA(v1.93)來計算劍白香豬的前10個主成分,然后使用前兩個主成分用R(v4.2)腳本來構(gòu)建散點圖。

1.3.2 遺傳距離分析 遺傳距離是一個物種之間或種群之間的遺傳差異的程度,它是由不同個體從共同祖先分化的時間和程度決定的。IBS全稱Identity By State, 又叫做狀態(tài)一致,指兩個或兩個以上的個體具有相同的等位基因序列,IBS遺傳距離可以衡量群體內(nèi)個體間的相似性,評價彼此的親緣關(guān)系[17]。IBS只考慮個體之間遺傳標(biāo)記或等位基因的相似性,而不管他們是否來自同一祖先。因此,不需要親本基因分型?；贗BS的遺傳距離仍然可以在沒有譜系或祖先樣本信息的情況下分析群體的遺傳關(guān)系。使用plink(v1.90)來計算IBS距離,并使用R(v4.2)腳本來構(gòu)建熱圖。

1.3.3 親緣關(guān)系分析 親緣關(guān)系是指兩特定材料的遺傳相似度與任意材料之間的遺傳相似度的相對值。其不僅是評價種群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵參數(shù),也是育種中選擇和品種保護(hù)的依據(jù)。本研究基于SNPs芯片數(shù)據(jù),利用plink(v1.90)、GCTA(v1.93)構(gòu)建親緣關(guān)系矩陣(G矩陣)。結(jié)果利用R(v4.2)可視化。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 雄性個體是保護(hù)種群譜系構(gòu)建的主要載體。因此,對雄性個體進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,并確定它們之間的親屬關(guān)系。按照選育原則,在種群遺傳育種過程中三代不相關(guān),按個體間的親緣系數(shù)小于0.062 5的標(biāo)準(zhǔn)劃分家系。使用plink(v1.90)計算IBD值,基于鄰接法,使用MEGA(v11.0)軟件對公豬個體進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.3.5 ROH分析 通過plink(v 1. 90)軟件檢測基因組上出現(xiàn)的一定數(shù)量和密度SNPs表現(xiàn)為純合的區(qū)域,即為連續(xù)性純合片段(ROH)。主要參數(shù)如下:20個SNPs的滑動窗口沿染色體滑動、每個滑動窗口的雜合子個數(shù)不超過1個、最小長度>500 kb、兩個SNPs最大間隔1 000 kb、SNP個數(shù)/ROH>30、最小SNP密度>100 kb/SNP[18]。然后用R(v4.2)基于ROH計算近交系數(shù)(FROH),基于ROH從基因組數(shù)據(jù)測量純合度定義為ROH覆蓋的基因組總長度除以SNP或序列覆蓋的基因組總長度,如下所示[19]:

式中,∑LROH為一個個體中檢測到的所有ROH的總長度之和,LAUTO為常染色體基因組總長度。

2 結(jié) 果

2.1 主成分分析

劍白香豬群體的主成分分析是利用GCTA計算,PCA圖(圖1)則用計算結(jié)果的第一個主成分和第二個主成分繪制。從圖中可以看出,劍白香豬群體的個體有較好的分散,大致可以劃分為3個部分,主要原因是由于樣本采自幾個不同的場區(qū);分析中PC1和PC2主成分可以解釋的遺傳變異分別為11.90%和7.95%。19頭種公豬未見明顯聚集,這表明劍白香豬群體結(jié)構(gòu)無明顯分層。

圖1 劍白香豬PCA分析結(jié)果Fig.1 PCA analysis results of Jianbai Xiang pig

2.2 遺傳距離和親緣關(guān)系分析

基于IBS值計算劍白香豬個體間的遺傳距離(1-Dst)和親緣系數(shù),構(gòu)建遺傳距離矩陣和親緣關(guān)系(G)矩陣,并可視化(圖2和圖3)。結(jié)果顯示,群體內(nèi)個體間的遺傳距離范圍為0.000 02～0.355 37,平均值為0.273 0±0.015 8,證明該群體大部分個體間的遺傳距離較大(圖2中偏紅及深紅的方格),少數(shù)個體的遺傳距離較近(圖2中偏白的方格)。大部分的劍白香豬個體間的親緣關(guān)系程度中等(圖3中偏藍(lán)的方格),小部分個體間的親緣關(guān)系較近(圖3中偏白及偏黃的部分)。IBS距離矩陣和G矩陣的結(jié)果表明部分個體存在近交風(fēng)險,配種時需注意近交情況的出現(xiàn)。

圖中每一個小方格代表第一個到最后一個個體兩兩之間的遺傳距離,該值越大(即兩個個體的遺傳距離越大)小方格越接近紅色,反之越接近黃色 Each small square in the figure represents the genetic distance between two individuals from the first to the last one. The larger the value (the greater the genetic distance between the two individuals), the closer the squares are to red, and the closer the genetic distance between the two individuals is to yellow圖2 遺傳距離矩陣可視化結(jié)果Fig.2 Visualization results of genetic distance matrix

圖中每一個方格代表第一個到最后一個個體兩兩之間的親緣關(guān)系值,該值越大越接近橙色,反之越接近藍(lán)色Each square in the figure represents the value of the relationship between the two individuals from the first to the last one. The larger the value, the closer it is to orange, and vice versa圖3 親緣關(guān)系G矩陣可視化結(jié)果Fig.3 Visualization results of genetic relationship G matrix

2.3 基于劍白香豬公豬的進(jìn)化樹分析

基于19頭劍白香豬公豬的遺傳距離用plink(v1.90)及MEGA(v11.0)軟件進(jìn)行聚類分析,并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析劍白香豬群體中公豬的家系結(jié)構(gòu)。以親緣系數(shù)為0.062 5作為劃分家系的閾值。閾值的設(shè)置是基于不同的公豬血統(tǒng)其3代內(nèi)沒有親緣關(guān)系,若3代內(nèi)有親緣關(guān)系即為近交個體,其近交系數(shù)為0.031 25;若個體間沒有近交,其近交系數(shù)至少應(yīng)為0.031 25,那么親緣系數(shù)應(yīng)小于0.062 5[20]。結(jié)果如圖4所示,19頭公豬共劃分為4個家系,每個家系內(nèi)的公豬數(shù)量不等,從左至右分別為2、5、3、9個。

圖中數(shù)字代表公豬樣品編號,紅線代表親緣系數(shù)值為0.062 5The numbers in the figure represent the number of the boar sample, the red line represents a coefficient of affinity value of 0.062 5圖4 19頭公豬遺傳距離聚類圖Fig.4 Clustering diagram of genetic distance of 19 boars

2.4 ROH分析

ROH長度和頻率可反映群體歷史。ROH越長表示親緣關(guān)系越近,長的ROH片段越多表明家系內(nèi)存在近交的可能性越高。從全基因組水平對劍白香豬群體進(jìn)行ROH分析,137頭劍白香豬共檢測到了2 893個ROHs,個體ROH的平均長度約為7.18 Mb;所有ROHs的范圍在0.92～86.86 Mb之間,主要集中在0.9～5.0 Mb之間(占58.17%)(圖5A);從染色體上分析,ROH集中分布較為平均,其中14號染色體的ROH數(shù)量最多,為268個,占9.26%,此外,未在18號染色體上檢測到ROH(圖5B)。對劍白香豬個體分析,個體ROH數(shù)量在5～38個之間(圖5C),劍白香豬個體ROH的總長度分布在11.79～458.75 Mb之間,平均ROH總長度約為151.63 Mb(圖5D)?；贔ROH的結(jié)果表明,劍白香豬群體平均近交系數(shù)為0.27%。

3 討 論

本研究基于SNP芯片基因型數(shù)據(jù),依次通過PCA、遺傳距離矩陣、G矩陣、NJ聚類,對該劍白香豬群體進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)分析。本試驗從4個方面分析了劍白香豬的群體結(jié)構(gòu),從主成分分析中可以看出劍白香豬群體是一個沒有明顯分層的群體。群體內(nèi)個體間的遺傳距離范圍在0.000 02～0.355 37之間。劍白香豬遺傳距離的平均值約為0.273 0±0.015 8,高于丫杈豬和青峪豬,低于藍(lán)塘豬和馬身豬,分別是0.259 5±0.028 8、0.260 4±0.025 2、0.284 2±0.046 5和0.332 6±0.033 9[21-24],這表明劍白香豬群體具有中等的遺傳距離,但部分個體具有較近的親緣關(guān)系。公豬對于一個群體的繁衍十分重要,家系的劃分都是以公豬為主,若某個群體的公豬只有一個家系,隨著世代的增加和閉鎖繁育,會導(dǎo)致近交系數(shù)增大,種群的多樣性下降[17],進(jìn)而導(dǎo)致種群出現(xiàn)衰退嚴(yán)重甚至面臨滅絕。本試驗結(jié)合遺傳距離將19頭劍白香豬公豬分為4個家系,以親緣系數(shù)0.062 5作為劃分家系的閾值,劃分的標(biāo)準(zhǔn)是三代以內(nèi)無近交,即近交系數(shù)小于0.031 25,親緣關(guān)系大于0.062 5。

目前,ROH已經(jīng)成為評估種群近親繁殖的常用方法[25-26],不同長度ROH片段可以分別區(qū)分古代和近代的近親繁殖歷史[27]。ROH普遍存在于受選擇強(qiáng)度密集的基因組區(qū)域內(nèi),一般來說,選擇強(qiáng)度大的品種具有更長、更多的ROH[28]。中國豬的平均ROH長度差異很大,從金華豬的最低值4.11 Mb到滇南小耳豬的最大值168 Mb[12,29]。本研究中,劍白香豬的ROH平均值為7.18 Mb。與其他品種相比,閩豬的ROH平均值為9.31 Mb[13]、通城豬為23.71 Mb[20],劍白香豬的ROH處于較低水平,可能存在較遠(yuǎn)世代的近親交配。

本研究所得的近交系數(shù)是基于ROH片段計算出的近交系數(shù),相對基于其他類型的基因組或系譜信息所得出的近交系數(shù)更為可靠[30]。此次研究中劍白香豬群體的平均近交系數(shù)值為0.27%。Wang等[31]在研究里岔黑豬的遺傳多樣性時,計算其群體平均近交系數(shù)為0.11[31];Yuan等[32]研究通城豬的遺傳多樣性時,排除了兄弟姐妹對FROH的影響并計算出對于41個沒有同胞個體的FROH為0.04%[32];Liu等[33]分析梁山豬的種群遺傳結(jié)構(gòu),基于ROH計算的近交系數(shù)顯示,全種群的平均值為0.026;戴麗荷等[34]在利用SNP標(biāo)記研究淳安花豬群體時平均近交系數(shù)值為0.199。本研究中劍白香豬的近交系數(shù)處于中等偏低的水平,表明該劍白香豬群體的遺傳多樣性較高。

4 結(jié) 論

本研究使用Porcine SNP50 BeadChip(Illumina, United States)芯片對138個劍白香豬樣本進(jìn)行基因分型,首先利用PCA分析大致了解該群體的遺傳結(jié)構(gòu),分析結(jié)果表明群體內(nèi)的個體有較好的分散,公豬未見明顯的聚集;IBS遺傳距離分析以及基于G矩陣的親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示劍白香豬群體的遺傳距離和親緣關(guān)系中等;NJ聚類分析將19頭公畜劃分為4個家系,家系之間不存在重復(fù)出現(xiàn)的個體?；赗OH分析,該劍白香豬群體的平均ROH長度和FROH處于較低水平,表明群體內(nèi)最近較少出現(xiàn)近親交配的現(xiàn)象;FROH處于較低水平,表明該劍白香豬群體的遺傳多樣性較豐富。