陳文哲,張向樂(lè),顧峰幸,趙振翔,李康麗,薛釗寧,鄭海學(xué),張小麗*,朱紫祥*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)與生物安全學(xué)院,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染偶蹄類動(dòng)物引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,易感動(dòng)物包括豬、牛、羊等家畜以及70多種野生動(dòng)物,嚴(yán)重時(shí)能引起動(dòng)物死亡[1,2]。患病動(dòng)物常在口腔、蹄部、乳房等部位出現(xiàn)大小不一的水泡[3,4]。FMD傳染性強(qiáng),傳播途徑廣,特別是在集約化養(yǎng)殖中極易發(fā)生,對(duì)畜牧業(yè)養(yǎng)殖造成巨大的危害,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)列為需報(bào)告?zhèn)魅静?在我國(guó)被列為一類動(dòng)物傳染病。中國(guó)作為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展大國(guó),防控口蹄疫不僅對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展有重大作用,同時(shí)對(duì)全球口蹄疫防控具有重要意義[5]。FMDV屬于微RNA病毒科(Picornaviridae)、 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus),被分為7個(gè)血清型,分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型,各型間沒(méi)有有效的交叉保護(hù)性,甚至同一血清型的不同毒株之間也沒(méi)有完全保護(hù)反應(yīng)。世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率和廣泛的多樣性使FMD的預(yù)防和控制面臨巨大挑戰(zhàn)[5-7]。因此,鑒定出重要的宿主限制因子并解析其抑制FMDV復(fù)制的機(jī)制,對(duì)口蹄疫防控和凈化具有重要意義。

CRISPR-CAS9技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的基因編輯和基因調(diào)解、基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)CRISPR-CAS9系統(tǒng)篩選出一批對(duì)FMDV具有調(diào)節(jié)作用的宿主蛋白,通過(guò)對(duì)表型進(jìn)行初步驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)宿主G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2, GRK2)對(duì)FMDV復(fù)制具有顯著的調(diào)節(jié)作用。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase, GRKs)家族由7個(gè)結(jié)構(gòu)上有同源序列的絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶成員組成,包括1個(gè)絲氨酸-蘇氨酸同源的中心催化區(qū)、1個(gè)底物識(shí)別和含有G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白樣結(jié)構(gòu)的氨基末端區(qū)以及1個(gè)作用于胞膜的羧基末端區(qū)[8]。根據(jù)序列和功能的相似性可以分為3個(gè)亞家族。該亞家族成員廣泛存在于各種組織,作用底物廣,并且具有重復(fù)的底物特異性。GRK2是在1980年研究β2腎上腺素受體(β2AR)同源減敏機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)的[9],它分布廣泛,能使已被激動(dòng)劑激活的β2AR磷酸化。最近發(fā)現(xiàn),激動(dòng)劑刺激哺乳動(dòng)物細(xì)胞后,能夠誘導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors, GPCR)、GRK2和Gβγ在細(xì)胞膜上形成穩(wěn)定的復(fù)合體,該復(fù)合體形成是GRK2細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位和發(fā)揮功能的必要條件[10]。此外,GRK2能特異地使活化的GPCR發(fā)生磷酸化,進(jìn)而引起GPCR脫敏,阻止受體本身再次偶聯(lián)G蛋白,從而有效地降低細(xì)胞膜上功能受體的水平,使受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)消失或降低[11-12]。

GRK2在病毒復(fù)制過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Le Sommer等[13]研究發(fā)現(xiàn)GRK2能夠調(diào)控登革熱病毒、丙型肝炎病毒以及黃熱病病毒(yellow fever virus, YFV)的復(fù)制,是黃病毒科的一個(gè)廣譜宿主因子。GRK2是黃熱病病毒復(fù)制所必須的,能夠獨(dú)立調(diào)控生命周期的多個(gè)階段,包括病毒進(jìn)入、RNA的合成及基因組擴(kuò)增。GRK2在流感病毒(influenza virus, IAV)脫殼過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。Yngüez等[14]在研究針對(duì)流感病毒的新藥物靶點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)GRK2是IAV感染初始階段的關(guān)鍵激酶。但是,GRK2在FMDV感染的過(guò)程中發(fā)揮著與YFV和IAV截然不同的效應(yīng),且GRK2對(duì)FMDV復(fù)制的影響尚未有報(bào)道。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建豬GRK2真核表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)、siRNA干擾方法以及和病毒蛋白的相互作用,探究GRK2在FMDV感染過(guò)程中發(fā)揮的作用。本研究為闡明宿主蛋白GRK2抵抗病毒復(fù)制的機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為控制FMD的流行提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞、菌體和載體

口蹄疫O型毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室保存。PK-15、HEK-293 T和BHK-21細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫與新發(fā)病流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。真核表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-His(-)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、蛋白Marker購(gòu)自 TaKaRa公司;0.25%-EDTA胰酶溶液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自Gibco公司;jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Polyplus Transfection公司;硝酸纖維素膜、RNA抽提試劑Trizol均購(gòu)自Invitrogen公司;DNA Gel Extraction Kit、QIAGEN Plasmid Plus均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;qRT SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Mix 購(gòu)自諾唯贊公司;PBS溶液和一抗稀釋液購(gòu)自碧云天公司;ECL顯色劑購(gòu)自Thermo Scientific公司;氨芐霉素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DH5α感受態(tài)購(gòu)自健順生物公司。

鼠抗Myc單克隆抗體 (M4439)、鼠抗Flag單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體(A5441)均購(gòu)自Sigma公司、山羊抗小鼠IgG的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗和山羊抗兔IgG的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗均購(gòu)自購(gòu)自武漢博士得生物工程有限公司;鼠抗GRK2單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz 生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及基因克隆

Trizol裂解提取細(xì)胞總RNA:PBS洗滌PK-15細(xì)胞2次,加入1 mL Trizol室溫裂解6 min;加入200 μL氯仿震蕩混勻,室溫靜置3 min,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min;吸取上清并加入等體積異丙醇,-20 ℃放置30 min,4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min;棄上清,75%乙醇洗滌沉淀,4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min,棄上清,室溫晾干,加入20 μL無(wú)RNase水溶解RNA,測(cè)定RNA濃度。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20 μL):4 μL 提取的RNA,4 μL 5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ,無(wú)RNase水20 μL。反應(yīng)程序:50 ℃ 15 min,85 ℃ 10 s,4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)(25 μL):Primer Star 12.5 μL,cDNA 3 μL,上、下游引物各0.5 μL,加水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序:98 ℃ 3 min;98 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。退火溫度及延伸時(shí)間根據(jù)引物片段和擴(kuò)增長(zhǎng)度確定。擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

表1 本試驗(yàn)中應(yīng)用到的定量引物序列及siRNA序列

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建

將上述(1.3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、純化回收并送樣測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證正確后,用XbaⅠ、Hind Ⅲ雙酶切PCR產(chǎn)物。酶切體系:10×M Buffer 5 μL;XbaⅠ 2 μL;Hind Ⅲ 2 μL;目的片段(膠回收GRK2)2 μg,補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)程序:置于37 ℃金屬浴中酶切10 min。將上述酶切后的目的片段與載體pcDNATM3.1/myc-His(-)進(jìn)行T4連接。連接體系:T4 DNA Ligase 1 μL,10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL,載體1 μL,目的片段7 μL。反應(yīng)程序:16 ℃金屬浴中連接3 h。利用DH5α大腸桿菌轉(zhuǎn)化,提取質(zhì)粒送樣測(cè)序。經(jīng)測(cè)序分析證實(shí),成功構(gòu)建豬GRK2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,將其命名為p-GRK2-myc。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

收取細(xì)胞樣品,提取RNA后反轉(zhuǎn)錄。qPCR體系:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,補(bǔ)水至10 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性3 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線:60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)3次,用2-ΔΔCt測(cè)定相對(duì)表達(dá)量,并將甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為內(nèi)參從而標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)樣品中的轉(zhuǎn)錄物的量。擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

蛋白質(zhì)樣品的制備:PBS洗滌細(xì)胞2次,加入120～140 μL細(xì)胞裂解液,冰上裂解5 min后反復(fù)吹打細(xì)胞樣品,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,金屬浴100 ℃ 15 min,12 000 r·min-1離心5 min 備用。

電泳:按照聚丙烯酰胺凝膠電泳所示方法配制濃縮膠和分離膠。將上述樣品加入蛋白膠泳道,電壓80 V 30 min,120 V 1 h。轉(zhuǎn)印:將上述蛋白膠與NC膜組裝并放入轉(zhuǎn)印裝置,冰上恒流200 mA 2 h。封閉:5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h。一抗孵育:1×TBST清洗NC膜上殘余奶粉,加入稀釋過(guò)的一抗(Myc 1∶3 000;HA 1∶5 000;GRK2 1∶1 000;β-actin 1∶1 500),4 ℃搖床過(guò)夜。二抗孵育:1×TBST洗NC膜3次,每次10 min;加入1×TBST稀釋的二抗(山羊抗小鼠IgG的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗和山羊抗兔IgG的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗均1∶5 000稀釋),室溫?fù)u床孵育2 h。顯影:1×TBST洗NC膜3次,每次10 min;取ECL化學(xué)發(fā)光顯色液浸泡NC膜15～30 s,通過(guò)凝膠成像儀曝光和采集圖像。

1.7 間接免疫熒光(indirect fluorescence assay,IFA)

用包被液包被好的共聚焦專用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24 h后進(jìn)行細(xì)胞固定。吸去培養(yǎng)基,用PBS輕輕洗3次,每次1 mL,室溫靜置5 min,用預(yù)冷的多聚甲醛固定20～30 min。吸去固定液,用PBS輕洗3次,每次1 mL,室溫靜置5 min。室溫下用0.2%～0.3%PBS配制的曲拉通處理10 min,用PBS輕洗3次,每次1 mL,室溫靜置5 min。加入1 mL 5%BSA室溫封閉1 h,PBS輕洗3次后進(jìn)行一抗過(guò)夜孵育(1∶100稀釋)。PBS輕洗3次,每次5 min后,避光加入稀釋后的熒光二抗(1∶500稀釋),室溫1 h。PBS輕洗3次,每次5 min后,進(jìn)行細(xì)胞核染色。配制DAPI細(xì)胞核染色液,避光染色,室溫作用10 min,PBS清洗3次,激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.8 病毒感染及病毒滴度測(cè)定

病毒感染:在12孔板中培養(yǎng)PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí),轉(zhuǎn)染p-GRK2-myc質(zhì)粒600 ng。轉(zhuǎn)染24 h后,吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS輕洗1次,接種用細(xì)胞維持液(1%FBS培養(yǎng)液)稀釋的1 MOI病毒,感染12 h后,收集上清,用于測(cè)定上清中的病毒滴度。

病毒滴度的測(cè)定(TCID50):用96孔板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞,用細(xì)胞維持液對(duì)病毒上清進(jìn)行倍比稀釋(10-1～10-11),每個(gè)稀釋度接種一列細(xì)胞,感染72 h后顯微鏡下觀察,記錄每個(gè)稀釋度產(chǎn)生CPE的細(xì)胞孔的數(shù)目,根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50,重復(fù)3次測(cè)定,取平均值為最終病毒滴度。

1.9 siRNA干擾試驗(yàn)

GRK2的豬源siRNA由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,siRNA序列見(jiàn)表1。

在12孔板中培養(yǎng)PK-15細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%時(shí),轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組(Negative control,NC)和針對(duì)GRK2的siRNA,轉(zhuǎn)染48 h后,利用qPCR方法檢測(cè)GRK2的干擾效率。在證實(shí)合成的siRNA可以下調(diào)GRK2的表達(dá)后,在PK-15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染NC siRNA和GRK2 siRNA,48 h后,以1 MOI FMDV感染細(xì)胞,設(shè)置Mock組,12 h后,收集細(xì)胞,提取總RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè),比較分析GRK2和FMDV mRNA的差異。

2 結(jié) 果

2.1 豬GRK2 基因的擴(kuò)增和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用針對(duì)GRK2的引物對(duì)GRK2基因進(jìn)行擴(kuò)增,1%瓊脂糖凝膠電泳如圖1A所示,出現(xiàn)約2 096 bp的片段,與預(yù)期大小相符合。測(cè)序結(jié)果表明該片段正確,為豬GRK2基因完整的CDS序列。對(duì)回收的GRK2目的片段和pcDNATM3.1/myc-His(-)真核表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切(圖1B),回收后連接并轉(zhuǎn)化,進(jìn)而提取質(zhì)粒。對(duì)提取出的質(zhì)粒進(jìn)行XbaⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定,均證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1C)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明成功構(gòu)建豬GRK2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒p-GRK2-myc。

A. GRK2片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果;B. GRK2真核表達(dá)質(zhì)粒p-GRK2-myc的構(gòu)建;C. GRK2雙酶切鑒定;M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. GRK2片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2. GRK2雙酶切產(chǎn)物;3. 空載體雙酶切產(chǎn)物;4. GRK2經(jīng)Xba I和Hind III雙酶切后的產(chǎn)物;5. 陰性對(duì)照(ddH2O)A. Amplification of GRK2 CDS fragments by RT-PCR; B. Construction of GRK2 eukaryotic expression plasmid (p-GRK2-myc); C. Double enzyme digestion of eukaryotic expression plasmid p-GRK2-myc; M. DNA marker; 1. RT-PCR product of GRK2 fragments;2. Double enzyme cleavage product of GRK2; 3. Double enzyme cleavage product of empty vector; 4. The production of GRK2 by Xba I and Hind III; 5. Negative control (ddH2O)圖1 GRK2真核表達(dá)質(zhì)粒p-GRK2-myc的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of GRK2 eukaryotic expression plasmid (p-GRK2-myc)

2.2 豬GRK2真核質(zhì)粒的表達(dá)驗(yàn)證及其細(xì)胞定位分析

PK-15細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNATM3.1/myc-His(-)空載體和p-GRK2-myc表達(dá)質(zhì)粒,24 h后收取細(xì)胞樣品。Western blot結(jié)果顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約為84 ku大小處出現(xiàn)特異性條帶(圖2A),與預(yù)期結(jié)果相符。說(shuō)明p-GRK2-myc質(zhì)粒能在PK-15細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。間接免疫熒光試驗(yàn)顯示,p-GRK2-myc定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖2B)。

A. 蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證p-GRK2-myc質(zhì)粒的表達(dá);B. 間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證GRK2質(zhì)粒的表達(dá)及其細(xì)胞定位A. Confirmation of the expression of p-GRK2-myc plasmid by Western blot; B. Identification of the expression and subcellular localization of the GRK2 Plasmid by indirect fluorescence assay圖2 p-GRK2-myc質(zhì)粒的表達(dá)及其細(xì)胞定位Fig.2 The confirmation of expression of p-GRK2-myc plasmid and the cellular localization analysis of GRK2

2.3 FMDV感染調(diào)控GRK2的表達(dá)

MOI的FMDV感染單層PK-15細(xì)胞,在感染后0、4、8和12 h收集細(xì)胞樣品,結(jié)果顯示,隨著FMDV感染的進(jìn)程,GRK2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這表明FMDV感染可以調(diào)控GRK2的表達(dá)(圖3A、B)。

A. GRK2蛋白水平的變化;B. GRK2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化;C. 口蹄疫病毒mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化;ns. 差異不顯著(P>0.05); *. 差異顯著(P<0.05)A. The change of GRK2 protein expression levels in FMDV-infected cells; B. GRK2 mRNA expression levels in FMDV-infected cells were detected by qPCR; C. FMDV mRNA expression levels in FMDV-infected cells were detected by qPCR. ns. No significant difference (P>0.05);*. Significant difference (P<0.05)圖3 口蹄疫病毒感染調(diào)控內(nèi)源性GRK2的表達(dá)Fig.3 FMDV infection regulates the expression of endogenous GRK2

2.4 過(guò)表達(dá)GRK2抑制FMDV復(fù)制

為進(jìn)一步研究GRK2在FMDV感染過(guò)程中的作用,PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量的p-GRK2-myc表達(dá)質(zhì)粒(0、150、300和600 ng),24 h后用0.1 MOI FMDV感染不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、10和12 h)收樣檢測(cè)GRK2過(guò)表達(dá)細(xì)胞中FMDV mRNA水平、蛋白水平及病毒滴度的變化。結(jié)果表明,隨著GRK2表達(dá)量的增加,FMDV的mRNA水平和蛋白水平都顯著降低(圖4A、B)。同時(shí),隨著感染時(shí)間的推移,GRK2對(duì)FMDV復(fù)制的抑制作用發(fā)生在感染早期且抑制效果很顯著(圖4C)。結(jié)果顯示,GRK2能夠抑制FMDV的復(fù)制,并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(圖4D)。

2.5 干擾GRK2促進(jìn)FMDV復(fù)制

PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC和針對(duì)GRK2的siRNA,48 h后,利用qPCR方法檢測(cè)GRK2的干擾效率。結(jié)果表明,合成的針對(duì)豬GRK2的siRNA能夠下調(diào)PK-15細(xì)胞中GRK2的轉(zhuǎn)錄水平,干擾效率可以達(dá)到60%～70%(圖5A)。之后在PK-15細(xì)胞中轉(zhuǎn)染等量的NC siRNA和GRK2 siRNA,48 h后,分別感染0.1 MOI的FMDV 12 h,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot和qPCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,下調(diào)GRK2的表達(dá)能夠上調(diào)FMDV的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平(圖5B、 C),同時(shí)GRK2的mRNA水平顯著改變(圖5D),這表明下調(diào)GRK2的表達(dá)可以促進(jìn)FMDV的復(fù)制。

A. GRK2 siRNA干擾效率檢測(cè);B. 下調(diào)表達(dá)GRK2后FMDV mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響檢測(cè);C. 下調(diào)表達(dá)GRK2后FMDV蛋白水平的影響檢測(cè);D. 轉(zhuǎn)染Si-GRK2后干擾效果檢測(cè);*. P<0.05;**. P<0.01A. Detection of silence ratio of GRK2 siRNA; B. Detection of FMDV mRNA transcription level after down-regulated expression of GRK2; C. Detection of FMDV protein levels after down-regulated expression of GRK2; D. Detection of interference effect after transfection with Si-GRK2. *. P<0.05;**. P<0.01圖5 下調(diào)GRK2促進(jìn)FMDV復(fù)制Fig.5 Downregulation of GRK2 expression promotes FMDV replication

2.6 口蹄疫3Cpro抑制GRK2的表達(dá)

GRK2在FMDV感染后期表達(dá)量降低,為探究該蛋白是否被FMDV蛋白酶3Cpro和Lpro切割或裂解,PK-15細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染pcDNATM3.1/Flag(-)空載體和p-GRK2-myc質(zhì)粒、pcDNATM3.1/Flag(-)空載體和3Cpro質(zhì)粒(0、600、1 200 ng)以及p-GRK2-myc質(zhì)粒和病毒蛋白Lpro和3Cpro(0、500、1 000、1 500 ng),24 h后收取細(xì)胞樣品。Western blot檢測(cè)顯示,3Cpro顯著降低GRK2的表達(dá)(圖6A～C),而病毒蛋白Lpro對(duì)GKR2的表達(dá)無(wú)影響(圖6D)。說(shuō)明宿主蛋白GRK2調(diào)控口蹄疫病毒復(fù)制的過(guò)程中,3Cpro通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)GRK2的表達(dá),進(jìn)而維持病毒自身的復(fù)制。

A. 過(guò)表達(dá)3Cpro能抑制GRK2的表達(dá);B. 過(guò)表達(dá)3Cpro能抑制內(nèi)源GRK2的表達(dá);C. 過(guò)表達(dá)3Cpro后GRK2 mRNA水平的變化;D. 過(guò)表達(dá)Lpro不能抑制GRK2的表達(dá);*. P<0.05;**. P<0.01A. Overexpression of 3Cpro inhibited the expression of GRK2; B. Overexpression of 3Cpro inhibited the expression of endogenous GRK2; C. Changes of GRK2 mRNA levels after overexpression of 3Cpro; D. Overexpression of Lpro could not inhibit the expression of GRK2. *. P<0.05;**. P<0.01圖6 口蹄疫3Cpro抑制GRK2的表達(dá)Fig.6 Foot-and-mouth disease 3Cpro inhibits the expression of GRK2

2.7 過(guò)表達(dá)3Cpro能促進(jìn)FMDV的復(fù)制

PK-15細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNATM3.1/Flag(-)空載體和Cpro質(zhì)粒(0、600、1 200 ng),24 h后用0.1 MOI FMDV感染后收樣檢測(cè)細(xì)胞中FMDV轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的變化(圖7A、B)。

2.8 GRK2與3Cpro互作且共定位

293 T細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染pcDNATM3.1/myc-His(-)空載體、p-GRK2-myc質(zhì)粒和3Cpro質(zhì)粒,24 h后收取細(xì)胞樣品。Western blot檢測(cè)顯示,3Cpro與GRK2互作(圖8A),間接免疫熒光試驗(yàn)顯示,GRK2和3Cpro共同定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖8B)。

A. GRK2與3Cpro相互作用;B. GRK2與3Cpro共定位A. GRK2 interacted with exogenous 3Cpro; B. GRK2 is co-located with 3Cpro圖8 GRK2與3Cpro互作且存在共定位Fig.8 GRK2 interacts with the 3Cpro and is co-localized with 3Cpro

3 討 論

豬、牛、羊是FMDV感染的主要宿主之一,我國(guó)又是養(yǎng)殖業(yè)大國(guó),一旦發(fā)生疫情,嚴(yán)重危害我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展。天然免疫是動(dòng)物機(jī)體抵抗病原感染的第一道防線,通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PPRs)識(shí)別入侵機(jī)體的病原體,迅速地激活固有免疫細(xì)胞,通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)釋放免疫因子阻止其入侵[15,16]。研究發(fā)現(xiàn)FMDV是典型的免疫抑制性病毒,感染宿主后可以引發(fā)顯著的免疫抑制,可通過(guò)參與多種細(xì)胞進(jìn)程破壞宿主蛋白的功能,如裂解宿主蛋白、干擾宿主蛋白的表達(dá)、去除宿主蛋白的泛素化以及抑制宿主蛋白的磷酸化,進(jìn)而調(diào)控天然免疫信號(hào)通路,突破天然免疫防線,建立原發(fā)性感染病灶,并開(kāi)始病毒的迅速?gòu)?fù)制。其中,FMDV的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)揮著重要作用[17-18]。而為了抵抗感染,宿主細(xì)胞也通過(guò)調(diào)控各種通路,啟動(dòng)一系列抗病毒反應(yīng),限制FMDV復(fù)制。

GRK2和FMDV之間的關(guān)系目前尚不清楚,本研究通過(guò)擴(kuò)增豬的GRK2基因,對(duì)GRK2與FMDV之間的關(guān)系進(jìn)行了探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FMDV感染PK-15細(xì)胞后,可以顯著調(diào)控內(nèi)源GRK2的表達(dá),這表明二者之間存在必然的聯(lián)系。進(jìn)一步通過(guò)過(guò)表達(dá)試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GRK2的上調(diào)表達(dá)可以抑制FMDV的復(fù)制,下調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)FMDV的復(fù)制,這證明GRK2在FMDV感染后發(fā)揮著重要的抗病毒作用。FMDV感染后GRK2后期表達(dá)量下降,表明部分病毒蛋白調(diào)控了GRK2的表達(dá)。FMDV的3Cpro和Lpro在抑制宿主蛋白表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19-20],作者研究發(fā)現(xiàn),FMDV 3Cpro蛋白能夠抑制GRK2的表達(dá),而Lpro并不影響GRK2的表達(dá)。Lpro在病毒感染早期快速表達(dá),調(diào)控宿主蛋白表達(dá),而3Cpro蛋白表達(dá)晚于Lpro,這也解釋了為何GRK2早期表達(dá)并未收到抑制,而在感染的中后期發(fā)生了下降。3Cpro蛋白下調(diào)GRK2的表達(dá)削弱了GRK2的抗病毒作用,促進(jìn)了病毒自身的復(fù)制。

制藥行業(yè)中50%以上的藥物靶點(diǎn)針對(duì)GPCR,是世界公認(rèn)范圍內(nèi)的主要治療靶點(diǎn)之一,因而突出其重要作用。此外,GPCR激動(dòng)劑通過(guò)調(diào)節(jié)包括趨化性、細(xì)胞存活和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生在內(nèi)的許多巨噬細(xì)胞功能來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[21,22]。因此,GPCR在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞生物學(xué)和先天免疫中起著至關(guān)重要的作用。與GPCR一樣,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類參與先天性和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)的受體,在巨噬細(xì)胞生物學(xué)和先天免疫的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn),TLR2和TLR4的激活顯著降低了巨噬細(xì)胞中arrestin-2蛋白水平,同時(shí)TLR2、3、4和7的表達(dá)顯著增加GRK2蛋白水平的表達(dá)[23]。單核細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,通過(guò)遷移到炎癥部位、分化為巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞、引發(fā)免疫反應(yīng)和殺死致病微生物來(lái)保護(hù)宿主。單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein1, MCP-1),也稱為CCL2,在單核細(xì)胞活化和遷移中起著重要作用。MCP-1的趨化功能通過(guò)與GPCR家族成員CCR2受體的結(jié)合介導(dǎo)。G蛋白偶聯(lián)受體激酶誘導(dǎo)GPCR磷酸化,這導(dǎo)致GPCR脫敏。有研究證明LPS增強(qiáng)MCP-1誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移,通過(guò)p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)GRK2在絲氨酸670處磷酸化,進(jìn)而抑制GRK2向膜的易位,從而阻止GRK2啟動(dòng)的CCR2對(duì)MCP-1的內(nèi)化和脫敏。因此,這導(dǎo)致單核細(xì)胞遷移增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)表明TLR4通過(guò)調(diào)節(jié)GRK2異位增強(qiáng)單核細(xì)胞的趨化性[24]。

FMDV 3Cpro蛋白是FMDV基因組編碼中具有酶學(xué)活性的病毒產(chǎn)物之一,是病毒多蛋白的主要裂解酶,且能裂解宿主細(xì)胞的蛋白[19]。研究表明,蛋白質(zhì)帽子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)成分是eIF4G,起RNA 解旋酶的作用,在病毒感染的后期,FMDV 3Cpro也可以裂解eIF4G,從而破壞帽子結(jié)構(gòu)并使宿主細(xì)胞RNA無(wú)法解旋,抑制宿主抗病毒蛋白的合成,但相比于Lpro的裂解過(guò)程稍晚[25],而且只能對(duì)eIF4G只能部分切割,并不能完全阻斷細(xì)胞的翻譯[26-27]。當(dāng)機(jī)體被FMDV所感染后,3Cpro蛋白酶可參與切割宿主細(xì)胞核中的組蛋白3(histone 3, H3),已有研究證明3Cpro蛋白酶在宿主組蛋白H3裂解中起主要作用。當(dāng)3Cpro蛋白酶破壞了H3的完整性后,染色質(zhì)的復(fù)制或轉(zhuǎn)化為染色體的過(guò)程將受到影響,殘缺的H3無(wú)法滿足DNA在轉(zhuǎn)錄起始之前所要求相對(duì)應(yīng)的基因組在空間結(jié)構(gòu)上變化的要求,從而使宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻[28]。除此之外,3Cpro蛋白還可裂解天然免疫調(diào)控關(guān)鍵分子NEMO、降低LGP2的表達(dá)[29]以及阻斷STAT1/STAT2的入核[30]等方式來(lái)拮抗天然免疫信號(hào)。因此,在GRK2拮抗FMDV復(fù)制的過(guò)程中,3Cpro能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯,導(dǎo)致抗病毒基因GRK2的低水平表達(dá),從而逃避宿主細(xì)胞的抗病毒防御反應(yīng)。3Cpro可能通過(guò)水解GRK2發(fā)揮拮抗作用,抑制宿主抗病毒反應(yīng),促進(jìn)自身復(fù)制。

綜上所述,GRK2能夠顯著抑制FMDV的復(fù)制,雖然其抑制FMDV復(fù)制的機(jī)制尚不清楚,但本研究初步證實(shí)了GRK2抑制FMDV復(fù)制的作用,并揭示了病毒如何拮抗其發(fā)揮的抗病毒作用,為深入開(kāi)展宿主蛋白GRK2調(diào)控FMDV復(fù)制的機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ),為FMDV的防控提供了新的視角。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建了豬的GRK2真核表達(dá)質(zhì)粒,并通過(guò)Western blot驗(yàn)證了其表達(dá)和IFA證實(shí)豬的GRK2蛋白定位于細(xì)胞的胞質(zhì)中。感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FMDV可以調(diào)控內(nèi)源性GRK2的表達(dá),呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)。過(guò)表達(dá)試驗(yàn)證實(shí)GKR2的上調(diào)表達(dá)可以明顯的抑制FMDV的復(fù)制,siRNA干擾試驗(yàn)表明下調(diào)表達(dá)GRK2可以促進(jìn)FMDV的復(fù)制。通過(guò)探究GRK2與FMDV的病毒蛋白之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),3Cpro也可抑制GRK2的表達(dá),促進(jìn)病毒自身的復(fù)制。這說(shuō)明GRK2在動(dòng)物機(jī)體抗FMDV感染過(guò)程中發(fā)揮著抗病毒功能,但病毒可以通過(guò)一定方式抑制拮抗其發(fā)揮的抗病毒作用,從而保障病毒自身的復(fù)制。本研究為進(jìn)一步揭示宿主蛋白GRK2的抗病毒作用研究提供了理論基礎(chǔ)。