范堯夫,許 娟,孫洪平,曹 琳
(南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科,江蘇 南京 210028)
目前全球有超過4.63 億糖尿病患者,到2045 年糖尿病患病人數(shù)將達到7 億[1-2]。在糖尿病人群中,約90%以上為2 型糖尿?。═2DM),其主要病理特征是胰島素抵抗及胰島β 細胞功能障礙[3]。目前針對T2DM 的治療主要以化學藥物為主,雖然降糖療效確切,但常伴隨各種不良反應的發(fā)生。研究已證實,肝臟糖異生作用的增加是糖尿病發(fā)病機制中極為關(guān)鍵的一點,且該作用可貫穿T2DM 的整個病程。因此,調(diào)控肝臟異常糖異生作用,減少肝糖原輸入是治療T2DM 的重要且有前景的方法。近年來,中醫(yī)藥在改善糖脂代謝方面取得了顯著成效。葛根芩連湯作為治療早中期腸道濕熱型T2DM 的代表方劑收錄于《中國2 型糖尿病防治指南》[4]。葛根芩連湯出自《傷寒論》,具有清利濕熱功效,在改善肝臟胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝糖異生方面具有獨特優(yōu)勢[5-6],但是其治療T2DM 的確切機制和靶點并不明確。本研究運用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術(shù),構(gòu)建“藥物-靶點-通路” 多維網(wǎng)絡,探討葛根芩連湯治療T2DM 的分子機制,并通過在體實驗驗證其可能機制,為葛根芩連湯改善糖脂代謝提供依據(jù)。
1.1.1 葛根芩連湯有效成分、靶點篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺 (TCMSP),以藥物口服生物利用度(OB) ≥30%、類藥性(DL) ≥0.18 為篩選標準,獲取葛根芩連湯有效成分,再借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫,將其信息轉(zhuǎn)換為對應的靶標基因。
1.1.2 2 型糖尿病疾病相關(guān)靶點基因收集 以“type 2 diabetes mellitus” 為檢索詞,檢索 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中T2DM 靶點基因,刪除重復靶點,利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行人源基因轉(zhuǎn)換。
1.1.3 葛根芩連湯有效成分、T2DM 共同靶點基因的篩選及韋恩圖構(gòu)建 運用Rx64 軟件處理葛根芩連湯有效成分的靶點數(shù)據(jù)和T2DM 疾病靶點基因數(shù)據(jù),然后進行匹配和交集基因篩選,繪制韋恩圖。
1.1.4 有效成分-潛在作用靶點調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建 采用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點” 網(wǎng)絡圖,應用“Network Analysis” 功能對網(wǎng)絡的拓撲屬性進行分析,根據(jù)Degree 值篩選出具有核心調(diào)控作用的化合物。
1.1.5 靶蛋白相互作用 (PPI) 網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選 采用STRING (https: / /string-db.org) 在線數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病共同靶點進行PPI 分析,物種定位為人,設定置信度閾值>0.90,將篩選的蛋白導入Cytoscape 3.8.2 軟件中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡,對節(jié)點連接度進行分析,篩選出核心靶點。
1.1.6 基因功能及生物通路富集分析 利用R 語言軟件包對潛在靶基因進行基因本體(GO) 功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG) 富集分析,設定閾值P<0.05。GO 分析中從生物過程(biological process,BP)、細胞組成 (cellular component,CC)、分子功能 (molecular function,MF) 3 個方面來探究潛在靶基因的功能水平,KEGG 分析中識別葛根芩連湯干預T2DM 的生物學通路,以揭示其對T2DM 的干預機制。
1.2.1 動物 C57BL/6J 小鼠40 只,雄性,SPF 級,12 周齡,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (滬) 2012-0002],飼養(yǎng)條件為相對濕度50% ~70%。所有實驗涉及動物的飼養(yǎng)和實驗過程均嚴格遵守南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實驗動物管理與保護的相關(guān)準則。
1.2.2 藥物 葛根、黃芩、黃連、甘草均購自南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑室吳軍教授鑒定為正品,四者按8 ∶3 ∶3 ∶2 比例進行配制[5],采用傳統(tǒng)水煎法提取后濃縮至生藥量1.56 g/mL,取部分濃縮液稀釋至0.78 g/mL,分瓶保存于-20 ℃冰箱中。
1.2.3 試劑與儀器 鹽酸吡格列酮片(江蘇德源藥業(yè)股份有限公司,批號H20110048)。腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞介素17 (IL-17) ELISA 試劑盒和TNF-α、核因子κB (NF-κB)、β-actin 抗體 (英國Abcam 公司,批號ab46070、ab100702、ab215188、ab16502、ab6276 )。Biospectrum 凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP 公司); 組織切片機(德國Leica 公司); 光學顯微鏡(日本Olympus 公司)。
1.2.4 建模與給藥 40 只小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后隨機分為正常組(8 只) 和造模組(32 只)。正常組給予普通飼料喂養(yǎng),造模組給予高脂飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司,批號2017416,含脂量60%) 喂養(yǎng),4 周后腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液(45 mg/kg),持續(xù)3 d,注射后72 h,經(jīng)尾靜脈檢測隨機血糖≥16.7 mmol/L,即為造模成功。將造模組分為模型組、吡格列酮組和葛根芩連湯低、高劑量組,每組8 只,吡格列酮組灌胃吡格列酮30 mg/kg,葛根芩連湯低、高劑量組灌胃葛根芩連湯10、20 g/kg[5],正常組和模型組灌胃等量蒸餾水,每天1 次,持續(xù)8 周,每周稱量小鼠體質(zhì)量以調(diào)整灌胃量。
1.2.5 指標檢測 造模成功后,每周固定時間采大鼠尾靜脈血,用血糖儀檢測空腹血糖(FBG)。末次給藥后小鼠禁食不禁水24 h,稱量體質(zhì)量,心臟采血后處死,全血離心后取血清,于-20 ℃下保存,根據(jù)ELISA 試劑盒說明書檢測血清空腹胰島素(FINS)、TNF-α、IL-17 水平; 采用穩(wěn)態(tài)模型(HOMA) 評估胰島素抵抗(IR) 數(shù)值,公式為HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。取各組大鼠肝組織,部分于10%福爾馬林中固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE 染色,部分冷凍保存,Western blot 法檢測KEGG 富集核心通路中相關(guān)蛋白表達,勻漿后使用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白,采用BCA 試劑盒測定濃度,進行10% SDS-PAGE 電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,孵育一抗、二抗,化學發(fā)光法曝光、顯影,使用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測各蛋白條帶灰度值。
1.2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理,符合正態(tài)分布的計量資料以(±s) 表示,組間比較采用單因素方差分析; 不符合正態(tài)分布或方差不齊者采用非參數(shù)秩和檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。
2.1 葛根芩連湯有效成分及靶點篩選 葛根芩連湯化學成分共489 種,按OB≥30%、DL≥0.18 條件篩選后得到146種有效成分,其中葛根4 種,黃芩36 種,黃連14 種,甘草92 種,刪除重復后共140 種,見表1。再使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫對上述有效成分對應的靶點進行人源基因轉(zhuǎn)換,去重合并后得到212 個靶點。
表1 葛根芩連湯有效成分(OB 值前二十位)
2.2 藥物-疾病共同靶點 將 GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中10 821 個T2DM 靶標基因利用Venn 作圖軟件,得到204 個葛根芩連湯治療T2DM 相關(guān)的潛在靶點,見圖1。
圖1 葛根芩連湯與T2DM 交集靶點Venn 圖
2.3 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建與核心靶點 利用STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件,構(gòu)建了包含204 個藥物-疾病共同靶點的PPI 網(wǎng)絡,見圖2。采用網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)篩選得到核心靶點18個,處于核心位置前十的關(guān)鍵靶點有JUN、AKT1、STAT3、MAPK3、FOS、MAPK1、MYC、MAPK14、ERS1、TP53,見圖3。
圖2 葛根芩連湯與T2DM 共同靶點PPI 網(wǎng)絡
圖3 PPI 核心靶點篩選流程圖
2.4 “中藥有效成分-靶點-疾病” 網(wǎng)絡圖構(gòu)建 將葛根芩連湯的4 味中藥、140 種有效成分、204 個潛在靶點采用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建“中藥有效成分-靶點-疾病” 可視化網(wǎng)絡,通過“Network Analyzer” 功能對節(jié)點、邊的數(shù)據(jù)進行拓撲分析,發(fā)現(xiàn)19 種活性成分的degree、BC、CC 均高于平均值,其中排名前三的為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、漢黃芩素(wogonin),見圖4。
圖4 “中藥有效成分-靶點-疾病” 可視化網(wǎng)絡圖
2.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 將藥物-疾病共同靶點經(jīng)R 語言處理后進行GO 功能、KEGG 通路富集分析。選取BP、CC、MF 顯著性排名前十者構(gòu)成GO 富集氣泡圖。GO-BP 主要涉及對藥物的反應、細胞對化學應激的反應、對金屬離子的反應等,GO-CC 主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等,GO-MF 主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ特異的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酰胺結(jié)合等,見圖5。對藥物-疾病共同靶點進行KEGG 通路富集分析,共得到119 條信號通路,選取排名前二十者繪制氣泡圖,進行可視化分析,見圖6。進一步對GO 生物過程和KEGG 通路按照P值篩選分析,結(jié)果顯示,TNF 通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路在T2DM 的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用,見圖7。
圖5 葛根芩連湯治療T2DM 的GO 功能富集分析
圖6 葛根芩連湯治療T2DM 的KEGG 通路分析
圖7 TNF 通路過程分析
2.6 葛根芩連湯對T2DM 小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平的影響 與正常組比較,模型組小鼠體質(zhì)量增加 (P<0.01),F(xiàn)BG、FINS 及HOMA-IR 水平均升高(P<0.01); 與模型組比較,各給藥組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平均降低 (P<0.05,P<0.01),見圖8。
圖8 各組小鼠體質(zhì)量、FBG、FINS 及HOMA-IR 水平變化(±s,n=8)
2.7 葛根芩連湯對T2DM 小鼠肝組織病理形態(tài)的影響 與正常組比較,模型組小鼠可見肝細胞結(jié)構(gòu)不規(guī)則,肝臟脂質(zhì)沉積、空泡變性及水樣變性; 與模型組比較,各給藥組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)稍腫大,呈放射狀排列,肝臟組織形態(tài)學紊亂減輕,可見散在脂肪空泡,邊界稍模糊,見圖9。
圖9 各組小鼠肝組織HE 染色(×400)
2.8 葛根芩連湯對T2DM 小鼠血清TNF-α、IL-17 水平的影響 與正常組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平升高(P<0.01); 與模型組比較,各給藥組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平降低(P<0.01),見表2。
表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較(±s,n=8)
表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-17 水平比較(±s,n=8)
注: 與正常組比較,**P<0.01; 與模型組比較,##P<0.01。
組別IL-17/(pg·mL-1)TNF-α/(ng·L-1)正常組58.04±8.2626.45±2.51模型組103.59±14.02**58.19±7.82**吡格列酮組65.37±9.45##32.27±4.43##葛根芩連湯低劑量組66.78±10.26##31.25±4.60##葛根芩連湯高劑量組62.31±8.62##28.96±2.67##
2.9 葛根芩連湯對T2DM 小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達升高(P<0.01); 與模型組比較,各給藥組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達降低(P<0.01),見圖10。
圖10 各組小鼠肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達變化(±s,n=8)
越來越多研究證實,葛根芩連湯治療T2DM 療效確切[7-11]。《中國2 型糖尿病防治指南(2017 年版) 》 推薦葛根芩連湯用于治療早、中期腸道濕熱證T2DM[4]。然而,中藥復方的物質(zhì)基礎十分復雜,這導致了其作用機制研究的不明確性。近年來,網(wǎng)絡藥理學的興起為中藥復方的研究提供了新的方法和思路,也為更好地理解中藥復方的藥效和療效機制提供了新的途徑。
本研究通過數(shù)據(jù)庫篩選,最終獲得葛根芩連湯140 種有效成分和212 個對應藥物靶點。采用Venn 分析后得到204 個交集靶點; 通過構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡及網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)篩選出關(guān)鍵基因18 個。根據(jù)degree 值篩選前3 位有效成分為槲皮素、山柰酚、漢黃芩素。這3 種成分均屬于黃酮類化合物,可以提高胰島素敏感性和改善胰島β 細胞數(shù)目[12-15]。我國一項大型橫斷面研究顯示槲皮素攝入量與T2DM 的患病率呈負相關(guān)[12]。槲皮素是一種天然多羥基黃酮類化合物,可以降低機體氧化應激水平,抑制INS-1 細胞凋亡,促進胰島素分泌[13]。山柰酚可以增加Akt 和己糖激酶活性,降低肝臟中葡萄糖-6 磷酸酶的活性,并通過抑制肝臟中的糖異生發(fā)揮降糖作用[16]。漢黃芩素可通過胰島素受體-1/PI3K/堿性磷酸酶途徑促進葡萄糖攝取和糖酵解,抑制肝細胞糖異生,改善胰島素抵抗[17]。上述研究表明,葛根芩連湯可能這3 種有效成分作用于關(guān)鍵靶蛋白來發(fā)揮治療T2DM 的作用。
GO 分析表明葛根芩連湯可能作用于多細胞組分產(chǎn)生不同生物學功能,從而發(fā)揮治療T2DM 的功效。KEGG 富集分析結(jié)果顯示葛根芩連湯治療T2DM 的關(guān)鍵靶點主要參與TNF 信號通路等。隨著T2DM 發(fā)病機制的深入研究,很多學者認為T2DM 可能是一種免疫性的炎性反應性疾病,其中TNF-α 參與炎癥反應及糖脂代謝的調(diào)節(jié)[18-20]。Skuratovskaia 等[21]發(fā)現(xiàn),TNF-α 可以抑制胰島素受體底物-1的磷酸化進而導致胰島素抵抗的發(fā)生,增加T2DM 病程的進展。另外研究表明,TNF-α 可以導致血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應,增加內(nèi)皮細胞的粘附性,使血管內(nèi)皮屏障功能受損; 此外,TNF-α 還可以促進血管內(nèi)皮細胞的凋亡,導致內(nèi)皮細胞的損傷和脫落,從而增加糖尿病血管病變的發(fā)生風險[22]。以上研究均表明,TNF-α 信號通路在T2DM 中發(fā)揮重要作用。
為了驗證網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果,動物實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),葛根芩連湯可以有效降低T2DM 小鼠胰島素、HOMA-IR、TNF-α 及IL-17 水平,改善高血糖狀態(tài); 減少肝細胞內(nèi)的脂滴積聚,有助于維持肝細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能; 降低肝組織TNF-α、NF-κB 蛋白表達。本研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡藥理學預測的藥物作用靶點與實際藥物作用靶點有較高的一致性,表明網(wǎng)絡藥理學方法可以較準確地預測藥物與疾病靶點的相互作用關(guān)系。
綜上所述,葛根芩連湯治療T2DM 具有多成分、多靶點特性,其可能通過TNF-α 信號通路抑制炎癥反應發(fā)揮降糖療效,這將為進一步研究葛根芩連湯治療T2DM 的基礎研究提供一定的理論依據(jù)。