袁龍宇, 雷浩霖, 李燕芳, 肖漢祥, 魏洪義, 張振飛,*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 廣州 510640; 2. 廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室, 廣州 510640;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南昌 330045)

稻水象甲Lissorhoptrusorvzophitus屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae),是一種嚴重危害水稻生產(chǎn)的世界性檢疫害蟲;成蟲取食水稻嫩葉的上表皮以及葉肉,影響水稻葉片光合作用;而幼蟲取食水稻根部,造成植株斷根、倒伏,嚴重影響水稻產(chǎn)量(譚文珠和黃鳳翔, 2016)。國際自然保護聯(lián)盟(International Union for Conservation of Nature, IUCN)已將其列為全球100種最具威脅的外來入侵生物之一(Grigarick and Beards, 1965),我國也將之列為水稻上重點檢測的檢疫性害蟲(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部, 2020)。稻水象甲原產(chǎn)于北美洲,20世紀70年代初,孤雌生殖型稻水象甲始傳入亞洲日本,我國于1988年在河北省唐?？h首次發(fā)現(xiàn)稻水象甲(方世凱等, 2008)。目前稻水象甲已擴散至我國23個省(自治區(qū)、直轄市)463個縣(市或地區(qū))(河江等, 2020)。2017年廣東省首次在梅州市五華縣安流鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)稻水象甲,此后,梅州市平遠縣也報道了稻水象甲的發(fā)生。

在我國不同稻水象甲發(fā)生區(qū),該蟲發(fā)生世代數(shù)及越冬習(xí)性等明顯不同,這對有效控制該蟲的擴散危害帶來了難度。在遼寧省東港市,稻水象甲每年發(fā)生1代(田春暉等, 1997),但在遼陽地區(qū)年發(fā)生1代并存在1個不完整世代的第2代(劉建武和陳雅麗, 2010),而在雙季稻區(qū)的浙江省臺州市年發(fā)生2代,但第2代蟲源有限,對晚稻不構(gòu)成威脅(林云彪等, 1997)。在越冬習(xí)性方面,該蟲在遼陽地區(qū)主要集中在山坡的土堆里越冬,越冬時不取食,卵巢不發(fā)育(曲輝等, 1998);在滇中地區(qū)其主要集中在田埂的土堆里越冬,越冬時取食少量再生稻,卵巢發(fā)育等級低(峗薇等, 2011)。由于廣東省處于我國亞熱帶和熱帶季風(fēng)氣候區(qū),適于部分農(nóng)作物害蟲的終年繁殖(齊國君和呂利華, 2016)。因此,該蟲傳入廣東省定殖后的生物學(xué)特性,是首先需要探明的重要問題。目前廣東省尚無該蟲生物學(xué)特性的研究報道。

基于此,本研究首先于廣東省梅州市開展了稻水象甲的年生活史調(diào)查,同時結(jié)合室內(nèi)籠罩飼養(yǎng)實驗進一步明確其發(fā)生規(guī)律。其次,通過PCR技術(shù)檢測和分析越冬稻水象甲成蟲中腸內(nèi)容物中的植物DNA,鑒別該蟲越冬期間取食的植物種類,分析其在廣東省潛在越冬生境。最后,使用特征序列擴增區(qū)(sequence characterized amplified region, SCAR)標記技術(shù)分析了稻水象甲越冬期的主要捕食性天敵。上述研究結(jié)果可為廣東稻區(qū)稻水象甲疫情的有效防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試昆蟲:稻水象甲越冬成蟲采自廣東省梅州市平遠縣石正鎮(zhèn)東臺村(24.5272°N, 115.8366°E);該蟲生活史研究的蟲態(tài)采自廣東省梅州市五華縣雙華鎮(zhèn)潮塘村(23.7871°N, 115.8029°E)。

1.1.2儀器:Optika LAB-2 光學(xué)立體顯微鏡,Optika公司(意大利);VHX-S650E超景深顯微鏡,基恩士(中國)有限公司;Biometra TRIO三槽PCR儀,德國耶拿分析儀器股份公司;CAVOY Power BU多用途電泳儀,北京凱元盛世科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2 稻水象甲生活史調(diào)查

于2019年3-11月在廣東省梅州市五華縣和平遠縣發(fā)生區(qū)田間觀察稻水象甲,采用五點調(diào)查法,隨機調(diào)查25叢,觀察水稻植株是否其上有稻水象甲成蟲危害;之后,將受害水稻植株拔起,將水稻根部浸泡于裝有飽和食鹽水的塑料桶中充分攪拌,靜置10 min后在桶中漂浮物中觀察稻水象甲幼蟲;最后,洗凈稻株根部泥土觀察其是否攜帶蟲蛹,并剝開水稻莖稈檢查蟲卵。并在五華縣雙華鎮(zhèn)潮塘村農(nóng)田旁設(shè)置3個養(yǎng)蟲籠(長×寬×高=50 cm×50 cm×70 cm),每個養(yǎng)蟲籠移栽3叢水稻,每叢接入稻水象甲成蟲10頭;每10 d觀察1次和記錄該蟲蟲齡、數(shù)量、發(fā)育歷期、卵巢發(fā)育等級及成蟲取食斑。

1.3 稻水象甲越冬特性調(diào)查

1.3.1越冬生境調(diào)查:于2020年12月下旬在平遠縣的東臺村和南臺村(24.5272°N, 115.8366°E)以及五華縣的潮塘村和桂嶺村(23.8390°N, 115.8167°E)進行稻水象甲越冬生境調(diào)查。重點對調(diào)查點的稻樁、田埂、沼澤地、路邊、坡地和林帶等區(qū)域進行系統(tǒng)調(diào)查。采用目測觀察法以及查土法,稻樁、田埂和沼澤地采用目測觀察法,每種環(huán)境調(diào)查667 m2;路邊、坡地和林帶采用查土法,每種環(huán)境隨機選擇5個樣點挖取長×寬=50 cm×50 cm以及深5 cm的土壤過篩后在陽光下觀察是否有稻水象甲成蟲。

1.3.2越冬期稻水象甲卵巢發(fā)育情況:取2020年12月越冬成蟲和2021年4月水稻分蘗期于平遠縣的東臺村和五華縣潮塘村采集的成蟲,放入PBS緩沖液中,在體視鏡下用鑷子先去除其鞘翅和膜翅,再輕輕將其腹部與胸部分離,從側(cè)面用鑷子撕開腹部背面薄膜,剔除消化道和脂肪體等非生殖器官的組織,即可看到完整的生殖器官,觀察其卵巢發(fā)育程度并記錄所含卵粒數(shù),卵巢發(fā)育程度分級參考翟保平等(1999)。

1.3.3稻水象甲越冬寄主植物特異引物設(shè)計與檢測靈敏度:選擇李氏禾Leersiahexandraycf4(GenBank登錄號:KF797362.1)、雙穗雀稗PaspalumdistichumndhF(GenBank登錄號: KF852892.1)和水稻OryzasativaAGL20(GenBank登錄號: AY332476.1) 3個基因設(shè)計特異性引物(表1),以同生境內(nèi)其他植物和饑餓處理的稻水象甲成蟲DNA為對照驗證引物特異性。結(jié)果表明,李氏禾LH-ycf4擴增效果明顯,且條帶單一清晰,擴增片段大小為216 bp。引物對同域其他3種植物DNA無擴增效果,物種特異性強;PD-ndhF對雙穗雀稗擴增條帶單一,擴增片段為247 bp,物種特異性強;OS-AGL對水稻DNA擴增效果單一,擴增片段為203 bp。引物對同域其他植物和稻水象甲成蟲DNA無擴增效果,物種特異性強(圖1)。

圖1 PCR鑒定李氏禾ycf4(A)、雙穗雀稗ndhF(B)和水稻AGL20(C)特異性引物的特異性Fig. 1 PCR identification of the specificity of specific primers of Leersia hexandra ycf4 (A),Paspalum distichum ndhF (B) and Oryza sativa AGL20 (C)M: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; LH: 李氏禾 L. hexandra; PD: 雙穗雀稗P. distichum; OS: 水稻 O. sativa; PO: 二歧蓼 Polygonim dichotomum; LO: 稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus. 圖7同。The same for Fig. 7.

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

植物特異性引物的靈敏性是稻水象甲腸道內(nèi)容物檢測的關(guān)鍵。將李氏禾DNA稀釋成5個濃度的DNA樣品,分別為10.160, 5.080, 1.016, 0.508和0.102 ng/μL;將雙穗雀稗D(zhuǎn)NA稀釋成5個濃度的DNA樣品,分別為9.760, 4.880, 0.976, 0.488和0.098 ng/μL;將水稻DNA稀釋成5個濃度的DNA樣品,分別為10.389, 5.194, 1.039, 0.519和0.104 ng/μL;以不同濃度DNA樣品為模板進行PCR擴增,使用凝膠電泳查看結(jié)果。結(jié)果表明,李氏禾DNA在0.102 ng/μL濃度下仍可檢測出,灰度值為4 864.933;雙穗雀稗D(zhuǎn)NA在0.098 ng/μL濃度下仍可檢測出,灰度值為7 660.004;水稻DNA在0.104 ng/μL濃度下仍可檢測出,灰度值為13 917.368(圖2)。由此可知,這些引物的靈敏度很高,可用于稻水象甲寄主植物種類的鑒別。

圖2 PCR鑒定李氏禾ycf4(A)、雙穗雀稗ndhF(B)和 水稻AGL20(C)特異性引物的靈敏度Fig. 2 PCR identification of the sensitivity of specific primers of Leersia hexandra ycf4 (A),Paspalum distichum ndhF (B) and Oryza sativa AGL20(C)M: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; 1-5: 分別為10.160, 5.080, 1.016, 0.508 和0.102 ng/μL的李氏禾DNA (10.160, 5.080, 1.016, 0.508 and 0.102 ng/μL of DNA of L. hexandra, respectively); 6-10: 分別為9.760, 4.880, 0.976, 0.488和0.098 ng/μL的雙穗雀稗D(zhuǎn)NA (9.760, 4.880, 0.976, 0.488 and 0.098 ng/μL of DNA of P. distichum, respectively); 11-15: 分別為10.389, 5.194, 1.039, 0.519 和0.104 ng/μL的水稻DNA(10.389, 5.194, 1.039, 0.519 and 0.104 ng/μL of DNA of O. sativa, respectively).

1.3.4越冬稻水象甲成蟲中腸內(nèi)容物檢測:將12月越冬期采集的稻水象甲成蟲在體視鏡下解剖出中腸,使用動物基因組DNA提取試劑盒(北京擎科生物科技有限公司)提取中腸內(nèi)的總DNA。以中腸總DNA為模板,使用寄主植物特異引物和GenStar 2×HiFiTaq PCR StarMix進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(25 μL): PCR Mix 12.5 μL, DNA模板 1 μL, 正反向引物各1 μL, ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 30個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。將反應(yīng)產(chǎn)物作為模板再進行一輪巢式PCR反應(yīng),反應(yīng)體系與條件同上。反應(yīng)完成后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.5稻水象甲SCAR特異引物的設(shè)計與靈敏度檢測:選擇稻水象甲的COⅠ基因(GenBank登錄號: KC510131.1)設(shè)計特異性引物(F: 5′-TCTCTCAT CGGAGATGACCA-3′; R: 5′-TGTCCATCCTGTACCT ACTCCT-3′),產(chǎn)物長度為246 bp。以同域內(nèi)其他昆蟲(稻象甲Echinocnemussquameus、大螟Sesamiainferens、二化螟Chilosuppressalis、臺灣稻螟C.auricilius、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda、斜紋夜蛾S.litura、稻苞蟲Parnaraguttata、褐飛虱Nilaparvatalugens和白背飛虱Sogatellafurcifera)幼蟲DNA為對照驗證引物特異性。結(jié)果表明,引物對稻水象甲DNA具有明顯的擴增且條帶單一清晰,而對其他10種昆蟲幼蟲DNA無擴增效果(圖3)。

圖3 PCR鑒定稻水象甲COI引物在不同水稻害蟲中的特異性Fig. 3 PCR identification of the specificity of COI primers of Lissorhoptrus orvzophitus in different rice pests insectsM: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; LO: 稻水象甲成蟲DNA(DNA of L. oryzophilus adults); LLO: 稻水象甲幼蟲DNA(DNA of L. oryzophilus larva); ES: 稻象甲幼蟲DNA(DNA of Echinocnemus squameus larva); SI: 大螟幼蟲DNA(DNA of Sesamia inferens larva); CS: 二化螟幼蟲DNA(DNA of Chilo suppressalis larva); CA: 臺灣稻螟幼蟲DNA(DNA of Chilo auricilius larva); CM: 稻縱卷葉螟幼蟲DNA(DNA of Cnaphalocrocis medinalis larva); SF: 草地貪夜蛾幼蟲DNA(DNA of Spodoptera frugiperda larva); SL: 斜紋夜蛾幼蟲DNA(DNA of Spodoptera litura larva); PG: 稻苞蟲幼蟲DNA(DNA of Parnara guttata larva); NL: 褐飛虱幼蟲DNA(DNA of Nilaparvata lugens larva); SFH: 白背飛虱幼蟲DNA(DNA of Sogatella furcifera larva).

稻水象甲SCAR引物靈敏性是天敵腸道內(nèi)容物檢測的關(guān)鍵。將提取的稻水象甲DNA稀釋成5個濃度的DNA樣品,分別為 103.114, 51.557, 10.311, 5.156和1.031 ng/μL。以不同濃度DNA樣品為模板進行PCR擴增,凝膠電泳查看結(jié)果。結(jié)果表明,在1.031 ng/μL濃度DNA仍可檢測出,灰度值為3 682.154(圖4)。由此可知,這些引物的靈敏度很高,可用于稻水象甲捕食性天敵物種檢測。

圖4 PCR鑒定稻水象甲SCAR引物的靈敏度Fig. 4 PCR identification of the sensitivity of SCAR primers of Lissorhoptrus orvzophitusSCAR: 特征序列擴增區(qū)Sequence characterized amplified region; M: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; 1-5: 分別為103.114, 51.557, 10.311, 5.156 和 1.031 ng/μL稻水象甲成蟲DNA (103.114, 51.557, 10.311, 5.156 and 1.031 ng/μL of DNA of L. orvzophitus adults, respectively).

1.3.6越冬生境蜘蛛腸道內(nèi)容物檢測:于12月在稻水象甲越冬生境采集游獵型蜘蛛,并將這些蜘蛛浸泡于無水乙醇中,使用1.2.3節(jié)中的DNA提取試劑盒提取成蛛腹部的總DNA。以提取的蜘蛛腹部總DNA為模板使用稻水象甲SCAR引物和GenStar 2×HiFiTaq PCR StarMix進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(25 μL): PCR Mix 12.5 μL, DNA模板 1 μL, 正反向引物(0.5 μmol/L)各1 μL, ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 30個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。將反應(yīng)產(chǎn)物作為模板再進行一輪PCR反應(yīng),反應(yīng)完成后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Office Excel整理分析稻水象甲發(fā)育歷期;電泳圖使用Adobe Photoshop處理;稻水象甲卵巢發(fā)育等級以及卵粒數(shù)使用Graphpad 8.0通過t檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 稻水象甲生活史

結(jié)合在梅州市五華縣開展的籠罩觀察實驗和大田定點調(diào)查研究,發(fā)現(xiàn)稻水象甲在廣東雙季稻地區(qū)一年發(fā)生2代,具有越冬和越夏的習(xí)性。稻水象甲的生育期與水稻的生育期高度重合。水稻的分蘗期和拔節(jié)期是稻水象甲成蟲主要發(fā)生期,也是水稻受害最嚴重的時期。通過室內(nèi)飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn),稻水象甲幼蟲共4 齡,幼蟲發(fā)育需要20 d左右,且幼蟲各齡期歷期與蟲齡呈正相關(guān)關(guān)系;蛹歷期為(8.26±0.24) d;卵歷期(7.26±0.05) d;成蟲歷期最長,為(110.26±0.46) d(表2),一個完整的世代需要(140.86±1.05) d(表2)。

表2 廣東省稻水象甲各發(fā)育階段的歷期Table 2 Duration of various developmental stages ofLissorhoptrus orvzophitus in Guangdong province

2.2 稻水象甲越冬特性

2.2.1稻水象甲越冬生境:2021年1月在平遠縣周正村、東臺村和南臺村以及五華縣潮塘村和桂嶺村總計約400 hm2水稻田附近可能的區(qū)域進行稻水象甲越冬生境調(diào)查,共采集樣本15頭,均在沼澤地內(nèi)發(fā)現(xiàn),并且不同沼澤地的蟲態(tài)發(fā)育基本一致,表明沼澤地是廣東稻水象甲成蟲的越冬生境,越冬生境主要由水稻種植區(qū)、過渡帶和越冬帶組成(圖5)。水稻種植區(qū)含有再生稻,過渡帶有部分再生稻及禾本科雜草,越冬帶常年有水且富含禾本科雜草。

圖5 廣東稻水象甲越冬生境實景(A)和越冬生境示意圖(B)Fig. 5 Actual view (A) and schematic plot (B) of Lissorhoptrus orvzophitus overwintering habitats in Guangdong province

2.2.2越冬稻水象甲的卵巢發(fā)育:將稻水象甲越冬期(12月-翌年2月)和水稻分蘗期(3-4月)捕捉到的稻水象甲成蟲帶回實驗室,解剖結(jié)果顯示,越冬代成蟲(2020年12月下旬至翌年2月下旬)的卵巢以Ⅰ級為主,2月中旬以前Ⅰ級卵巢占100%;稻水象甲在3月下旬取食雜草或秧苗,3月下旬卵巢開始發(fā)育為Ⅱ級,4月下旬開始出現(xiàn)Ⅲ級卵巢的高峰期(圖6)。同時從圖6可以看出,越冬期稻水象甲野外成蟲的平均卵粒數(shù)均為0,水稻分蘗期田間稻水象甲的平均卵粒數(shù)為5粒/頭。值得注意的是,稻水象甲的卵巢發(fā)育為逐級發(fā)育,解剖記錄僅為中輸卵管內(nèi)的成熟卵粒數(shù),未包括卵巢小管內(nèi)未成熟和已產(chǎn)的卵粒。因此,單頭稻水象甲的實際產(chǎn)卵量應(yīng)大于解剖記錄所得結(jié)果。在調(diào)查的100株水稻苗中,稻水象甲65%的產(chǎn)卵部位為水稻基部第1葉鞘,30%在第2葉鞘。田間調(diào)查產(chǎn)卵情況時,需注意水稻苗基部第1葉鞘部分。

2.2.3稻水象甲越冬取食植物:稻水象甲在廣東地區(qū)的越冬生境(圖5)的植物主要有雙穗雀稗、李氏禾等雜草和部分殘留再生稻,在這些植物上發(fā)現(xiàn)了稻水象甲的取食斑。為了確定稻水象甲是否取食上述幾種植物,針對這幾種植物設(shè)計了特異性引物,以進一步明確廣東稻水象甲寄主植物種類。結(jié)果表明,從稻水象甲的越冬生境中提取的稻水象甲成蟲中腸DNA樣本中都檢測到了水稻,李氏禾的檢出率為42.86%,但均沒有檢測到雙穗雀稗(圖7)。由此說明,廣東越冬稻水象甲取食水稻和李氏禾,且以水稻為主。

2.2.4稻水象甲越冬生境捕食性天敵:生境調(diào)查發(fā)現(xiàn)稻水象甲在廣東地區(qū)的越冬生境中存在許多捕食性天敵。為了確定這些天敵是否捕食稻水象甲,設(shè)計了稻水象甲mtDNACOI特異性引物。以水稻上其他水稻害蟲作為對照,驗證了稻水象甲SCAR引物的特異性并分析了檢測靈敏度(圖3),最終使用PCR方法明確了廣東稻水象甲的一種天敵——溝渠豹蛛Pardosalaura。

越冬生境內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量天敵,特別是游獵型蜘蛛溝渠豹蛛成蛛。因此用稻水象甲SCAR引物檢測溝渠豹蛛成蛛腸道的DNA是否存在稻水象甲DNA殘余,確定天敵對稻水象甲的捕食作用。圖8凝膠電泳結(jié)果顯示15 號泳道中的DNA條帶清晰,說明14號樣品的腸道中存在稻水象甲的 DNA。此結(jié)果證明溝渠豹蛛對稻水象甲具有捕食作用是稻水象甲的捕食性天敵之一。同時也證明,圖5類型的越冬生境中確實存在稻水象甲。

圖8 溝渠豹蛛成蛛腸道中稻水象甲DNA的檢測Fig. 8 Detection of DNA of Lissorhoptrus orvzophitus in the intestinal tract of Pardosa laura adultsM: DNA分子量標準DNA molecular weight marker; LO: 稻水象甲成蟲DNA DNA of L. oryzophilus adults; 1-16: 溝渠豹蛛成蛛腹部DNA DNA of the abdomen of P. laura adults.

3 討論與結(jié)論

稻水象甲是我國水稻上唯一的檢疫性害蟲,嚴重威脅水稻生產(chǎn),對糧食安全和生態(tài)安全有極高的風(fēng)險,截止2015年全國已有23個省份報道發(fā)生(齊國君和呂利華, 2016), 2017年4月于梅州市五華縣首次在廣東省內(nèi)發(fā)現(xiàn)稻水象甲疫情。但是由于我國幅員遼闊,地理環(huán)境差異較大,稻水象甲的發(fā)生世代會隨著當(dāng)?shù)丨h(huán)境、氣候和耕作制度等因素產(chǎn)生較大差異。因此亟需研究稻水象甲定殖廣東的習(xí)性,并結(jié)合防控措施,科學(xué)精準地降低其危害。

廣東稻水象甲發(fā)育歷期有其特殊性,溫度的差異導(dǎo)致廣東地區(qū)稻水象甲的發(fā)育歷期較其他地方更短,只需140 d左右,這也是其一年發(fā)生2個世代的主要原因。浙江省象山縣第2代稻水象甲卵歷期為8.1 d,幼蟲歷期為35 d(蔡燦等, 2002)。而廣東省稻水象甲卵歷期只有7 d,幼蟲歷期更短,只有20 d左右(表2)。廣東稻水象甲全年有2個產(chǎn)卵繁殖期,產(chǎn)卵期主要處于早稻的分蘗期(3月下旬和4月中旬) 和晚稻的分蘗期(7月下旬和8月中旬)。而在貴州省滇中稻區(qū)稻水象甲全年只有1個產(chǎn)卵繁殖期,產(chǎn)卵期主要處于當(dāng)?shù)厮镜姆痔Y期(5月下旬和6月中旬)(尹艷瓊等, 2019)。在浙江南方雙季稻區(qū)一年也可發(fā)生2代(商晗武等, 2003)。稻水象甲在越冬期卵巢發(fā)育受到抑制,在越冬期卵巢發(fā)育等級為Ⅰ級(圖6),而到了水稻分蘗期,稻水象甲遷入大田取食,卵巢快速發(fā)育,到4月中旬卵巢發(fā)育到Ⅲ級,能夠開始產(chǎn)卵,卵巢卵粒數(shù)達到5粒/頭。這一結(jié)果與貴州滇中地區(qū)稻水象甲在7月時的數(shù)據(jù)(尹艷瓊等, 2019)一致。

廣東稻水象甲的越冬模式為稻田-過渡帶(草地)-沼澤地(水草豐盛)(圖5)。沼澤地為其主要的越冬生境,目前沒有在稻田附近土層內(nèi)發(fā)現(xiàn)稻水象甲,這可能與其對溫度、水及過渡寄主植物的依賴性較高有關(guān)。楊茂發(fā)等(2013)研究發(fā)現(xiàn)稻水象甲越冬成蟲在水中的行為時間分配超過40%。稻水象甲越冬代成蟲隨著氣候變暖等適宜條件開始出來取食,先取食田埂及周邊荒地的雜草,7月中旬以及8月上旬再轉(zhuǎn)移到水稻上為害。廣東稻水象甲主要在沼澤地過渡寄主植物再生稻、李氏禾上越冬(圖7)。這一點與貴州、遼寧等地稻水象甲的發(fā)生特點不同,貴州稻水象甲成蟲越冬的主要場所是稻田附近的溝(河)邊表層土壤、田埂的表層土壤中(峗薇等, 2011)。而在遼寧省稻水象甲成蟲的越冬場所主要在山坡、荒草格、林帶的土壤中,土壤上面還常常覆蓋大量或較厚的雜草以及殘葉,有一定的保暖性能,是遼寧省第2年大量蟲源的主要來源(曲輝等, 1998)。稻水象甲在長春地區(qū)主要在稻田周圍向陽地帶的田埂土壤中群集越冬,草皮下的土壤中居多(朱曉敏等, 2005)。產(chǎn)生如此差異的原因主要是在溫度上,廣東地區(qū)冬季溫度常年在5 ℃以上,稻水象甲不需要進入土壤之中進行保溫,而且在廣東的越冬地還存在大量禾本科替代寄主植物,可維持稻水象甲越冬時期的能量需求。

目前,使用特異性引物檢測昆蟲體內(nèi)DNA是最簡單快捷的診斷PCR技術(shù)。本研究利用SCAR標記技術(shù),采集了稻水象甲越冬地多種不同的水草,設(shè)計這些水草的SCAR特異性引物(圖4)。Staudacher等(2011)根據(jù)玉米和小麥的trnL序列開發(fā)出了玉米和小麥的特異性引物,并通過實驗證明金針蟲在取食后72 h內(nèi)都可通過PCR檢測到植物DNA。本研究從稻水象甲成蟲中腸中發(fā)現(xiàn)稻水象甲在越冬時期主要取食的寄主植物是水稻和李氏禾(圖7)。越冬生境寄主植物種類的研究,可以為稻水象甲越冬防控提供理論基礎(chǔ)。

同樣,運用分子標記的方法對天敵腸道內(nèi)害蟲殘體進行檢測,具有操作簡便,反應(yīng)靈敏的特點,適合應(yīng)用于田間害蟲的捕食性天敵種類調(diào)查。在茶園蜘蛛中,通過拍網(wǎng)法所采集到的游獵型蜘蛛經(jīng)過PCR檢測,可以從蜘蛛體內(nèi)大量檢測到茶尺蠖DNA,檢測率達到43%(袁龍宇, 2015)。Yang等(2017)利用qPCR技術(shù)監(jiān)測了目標片段的陽性率和捕食者腸道中的茶小綠葉蟬DNA殘留最小數(shù)量,分別估算了捕食者的捕食率和每個捕食者的捕食數(shù)量。但是 SCAR標記技術(shù)只能確定天敵與稻水象甲的捕食與被捕食的關(guān)系,目前還不能準確評價天敵對稻水象甲控制作用的大小,具體的控制作用有待進一步研究。

綜上所述,本研究通過稻水象甲發(fā)生情況實地調(diào)查、籠罩飼養(yǎng)實驗和卵巢解剖系統(tǒng)研究了稻水象甲在廣東的生活史和越冬規(guī)律。明確了稻水象甲在廣東省越冬時期主要取食的寄主植物是水稻和李氏禾。同時還探明了稻水象甲在廣東省越冬地的主要天敵為游獵型蜘蛛——溝渠豹蛛。這些研究結(jié)果將為廣東省稻水象甲越冬期的預(yù)測預(yù)報及精準防控研究提供理論依據(jù)。