劉高源, 史正軍,2, 趙 平,2, 楊海艷,2, 楊 靜,2*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院,云南 昆明 650224; 2.云南省高校特色林木生物質(zhì)資源化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗室;西南林業(yè)大學(xué),云南 昆明 650224)

巨龍竹,主要生長和分布于中國云南省的西南部,竹材結(jié)構(gòu)致密形貌高大,在當(dāng)?shù)刂饕米鹘ㄖ牧虾图揖咴系?巨龍竹生長速度快,生物量含量高,因此在生物質(zhì)燃料應(yīng)用領(lǐng)域具有較高的潛力[1-2]。竹類生物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,三大組分之間相互交聯(lián)形成了致密的天然細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),這種復(fù)雜且性質(zhì)穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成了木質(zhì)纖維生物煉制過程中的天然抗降解屏障。竹類生物質(zhì)中含25%～30%木質(zhì)素,能夠通過共價鍵與糖類物質(zhì)連接形成木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物(LCC),進(jìn)一步增加了木質(zhì)纖維的異質(zhì)性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性,使竹類生物質(zhì)難以被拆分和解聚[3]。有效的預(yù)處理能夠解離木質(zhì)纖維原料天然致密的結(jié)構(gòu),降低木質(zhì)纖維的酶解抗性屏障。主要的預(yù)處理方法包括化學(xué)法預(yù)處理、物理法預(yù)處理、生物法預(yù)處理以及幾種預(yù)處理方法的結(jié)合[4-5]。然而,根據(jù)目前的預(yù)處理水平,完全脫除木質(zhì)纖維原料中的木質(zhì)素需要非常高的成本,并且脫除木質(zhì)素的同時會損失部分的纖維素;其次在高溫預(yù)處理過程中部分木質(zhì)素會從固有的狀態(tài)分離降解,但不會從木質(zhì)纖維原料中脫除,而是重新聚合到底物表面,繼續(xù)影響纖維素酶的水解效率[6-7]。本研究以硫酸作為輔助試劑促進(jìn)過氧化氫與乙酸反應(yīng)生成過氧乙酸(PA),對巨龍竹進(jìn)行預(yù)處理,探究預(yù)處理中硫酸的用量對巨龍竹酶水解和發(fā)酵效率的影響,以及預(yù)處理前后巨龍竹的形貌和結(jié)構(gòu)變化,以期為竹類生物質(zhì)生物精煉糖基化合物和纖維素乙醇的應(yīng)用基礎(chǔ)研究提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

3年生巨龍竹(DendrocalamussinicusChia et J. L. Sun, DS),來自云南省保山市昌寧縣,經(jīng)風(fēng)干、粉碎過篩,選粒徑為0.25～0.38 mm的樣品,備用。纖維素酶(Cellic CTec2),濾紙酶活為250 FPU/mL,β-葡聚糖苷酶酶活為1 120 IU/mL,購于上海Sigma-Aldrich公司;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),購于安琪酵母股份有限公司;酵母提取物,購自北京奧博星生物技術(shù)公司;過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)、乙酸和硫酸等均為分析純。

Agilent 1260 S高效液相色譜(HPLC)儀,美國安捷倫公司;UV-210PC型紫外分光光度計,美國尤尼柯儀器公司;Aeris X射線衍射(XRD)儀,荷蘭帕納科公司;Micrometritics ASAP 2020分析儀,美國麥克默瑞提克儀器公司;X射線光電子能譜(XPS)儀,美國賽默飛公司。

1.2 過氧化氫-乙酸預(yù)處理巨龍竹

取過氧化氫和乙酸溶液各75 mL混合,然后分別加入占總體積0、 0.1%、 0.25%、 0.5%和0.75%的硫酸作為反應(yīng)助劑,配制復(fù)合溶液。10 g巨龍竹粉與150 mL復(fù)合溶液混合,在70 ℃下反應(yīng)2 h后,固液分離,固體殘渣用蒸餾水洗滌至中性,然后在室溫下風(fēng)干用于后續(xù)的化學(xué)成分分析、酶水解和發(fā)酵產(chǎn)乙醇。

1.3 巨龍竹的酶水解

取未處理的巨龍竹原料和預(yù)處理的巨龍竹各1 g,添加10 FPU/g(以底物質(zhì)量計)的纖維素酶,加入適量的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)水解體系(20 mL)的pH值為4.8,在恒溫振蕩箱中50 ℃和150 r/min條件下反應(yīng)72 h。在酶水解過程中的2、 4、 6、 10、 24、 48、 72 h的時間節(jié)點(diǎn)取樣,用HPLC測定葡萄糖和木糖含量,平行實(shí)驗3次,并取平均值。酶水解結(jié)束后取上清液保存于4 ℃冰箱,用作后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的碳源。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)乙醇

將0.216 g釀酒酵母、 0.4 g葡萄糖和0.8 g酵母提取物溶于8 mL蒸餾水中,在35 ℃條件下活化30 min,制成酵母溶液。將1.3節(jié)的酶水解上清液經(jīng)高壓鍋滅菌后,取4 mL,再加入0.5 mL配制的酵母溶液,在35 ℃條件下發(fā)酵18 h。發(fā)酵結(jié)束后,離心取上清液用于測定乙醇質(zhì)量濃度。

1.5 分析與表征

1.5.1物料化學(xué)成分分析 采用美國國家可再生能源實(shí)驗室(NREL)的“兩步酸水解法”測定預(yù)處理前后巨龍竹的纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖)和木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),預(yù)處理殘渣回收率和木質(zhì)素的脫除率按式(1)～(2)計算[8]:

R=(m1/m2)×100%

(1)

D=[1-(m3/m4)]×100%

(2)

式中:R—固體回收率,%;m1—預(yù)處理固體絕干質(zhì)量,g;m2—原料絕干質(zhì)量,g;D—木質(zhì)素的脫除率,%;m3—預(yù)處理殘渣中木質(zhì)素質(zhì)量,g;m4—原料中木質(zhì)素質(zhì)量,g。

1.5.2水解液中還原糖和乙醇測定 水解上清液中的葡萄糖、木糖質(zhì)量濃度和發(fā)酵液中的乙醇質(zhì)量濃度通過HPLC測定,所用分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm),流動相為0.005 mol/L的硫酸,流速為0.6 mL/min,柱溫為55 ℃,示差折光檢測器下進(jìn)行檢測,3次平行實(shí)驗并取平均值。葡萄糖、木糖和乙醇得率按式(3)～(5)計算[9]:

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m5×w1)×100%

(3)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m5×w2)×100%

(4)

Y3=C3/(CG×0.51)×100%

(5)

式中:Y1—葡萄糖得率,%;C1—水解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度,g/L; 0.9—葡聚糖和葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù); 0.02—水解液體積,L;m5—原料絕干質(zhì)量,g;w1—原料中葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;Y2—木糖得率,%;C2—水解液中木糖的質(zhì)量濃度,g/L; 0.88—木聚糖和木糖的轉(zhuǎn)化系數(shù);w2—原料中木聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;Y3—乙醇得率,%;C3—乙醇質(zhì)量濃度,g/L;CG—發(fā)酵液中葡萄糖初始質(zhì)量濃度,g/L; 0.51—葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇理論值。

1.5.3疏水度測定 采用玫瑰紅染色法測定物料的疏水度[10]。分別取預(yù)處理前后的底物0.04、 0.08、 0.12、 0.16和0.20 g于適量玫瑰紅染色液(40 mg/L)中,在50 ℃和150 r/min條件下反應(yīng)24 h。使用紫外分光光度計在波長543 nm處測定上清液的吸光值檢測染料殘余量,被吸附染料與殘余染料比為分割熵(QP值)。以底物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),QP值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性擬合,所得直線的斜率即為物料疏水度,每個樣品測3次,取平均值。

1.5.4酶可及度測定 采用直接紅染色法[11]測定物料的酶可及度。分別將0.08 g竹粉樣品加入8 mL不同質(zhì)量濃度(0、 0.1、 0.5、 1、 2和3 g/L)的剛果紅(DR28)溶液中,在恒溫振蕩箱中以50 ℃和150 r/min的條件反應(yīng)24 h。取上清液于498 nm測定紫外吸光值,計算染料殘余量,用Langmuir吸附等溫曲線擬合竹粉對直接紅染液的最大吸附量,并評價纖維素酶對物料的可及度,每個樣品測3次,取平均值。

1.5.5結(jié)晶度測定 底物的纖維素結(jié)晶度(ICr)通過XRD在耙材為Cu,掃描范圍2θ為5～80°條件下測定,根據(jù)結(jié)晶峰面積與總峰面積的比率計算預(yù)處理樣品的結(jié)晶度。

1.5.6比表面積測定 預(yù)處理前后巨龍竹的比表面積使用BET法測定,用Micrometritics ASAP 2020分析儀在77 K下進(jìn)行氮?dú)馕?脫附。

1.5.7XPS分析 巨龍竹表面元素分析通過XPS測定。測試條件為X射線能量1 486.8 eV,測試電壓15 kV,真空2×10-7Pa。木質(zhì)素和碳水化合物的表面覆蓋率計算公式如下[12]:

SL=(RO/C,P-RO/C,C)/(RO/C,L-RO/C,C)

(6)

SC=1-SL

(7)

式中:SL—木質(zhì)素的表面覆蓋率;RO/C,P—預(yù)處理底物的氧碳比;RO/C,C—碳水化合物的氧碳比,0.83;RO/C,L—木質(zhì)素的氧碳比,0.33;SC—碳水化合物表面覆蓋率。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸用量對過氧乙酸預(yù)處理巨龍竹的影響

2.1.1化學(xué)成分 不同硫酸用量對過氧化氫-乙酸(PA)預(yù)處理巨龍竹化學(xué)成分的影響結(jié)果如表1所示,從表中可以看出,原料巨龍竹的纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖)和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50.53%、 19.18%和27.84%。經(jīng)過未添加硫酸的過氧化氫-乙酸預(yù)處理(DS/PA-0)后,木聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有明顯變化,木質(zhì)素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少到23.36%,比DS降低了16.1%。然而,在預(yù)處理過程中添加不同用量(體積分?jǐn)?shù))的硫酸作為助劑后,固體回收率和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低,隨著H2SO4體積分?jǐn)?shù)從0.1%增加到0.75%,底物中木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由19.09%降低到4.60%;與沒有添加H2SO4的PA預(yù)處理相比,降低了18.28%～80.30%。由于木質(zhì)素的大量脫除,固體回收率降低,導(dǎo)致預(yù)處理底物中葡聚糖和木聚糖的含量明顯增加。表1中數(shù)據(jù)表明在PA預(yù)處理過程中,硫酸用量的增加,使巨龍竹原料中的木質(zhì)素的脫除率增加,但對底物中葡聚糖和木聚糖的影響相對較小。

表1 硫酸用量對過氧化氫-乙酸(PA)預(yù)處理巨龍竹化學(xué)成分的影響1)

2.1.2酶解效果 10 FPU/g纖維素酶劑量和5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)PA預(yù)處理巨龍竹在pH值為4.8,50 ℃和150 r/min條件下酶水解72 h,不同H2SO4用量的影響如圖1所示。從圖1(a)中可以看出,未預(yù)處理的巨龍竹原料經(jīng)纖維素酶降解后,水解液中的葡萄糖和木糖得率分別為3.79%和4.91%。經(jīng)未添加硫酸的PA預(yù)處理后,葡萄糖和木糖的得率分別為59.53%和64.47%,比原料分別提高了14.70倍和12.13倍。然而,當(dāng)PA預(yù)處理過程中添加硫酸作為助劑時,預(yù)處理底物的酶水解得率呈現(xiàn)進(jìn)一步增加趨勢。當(dāng)硫酸用量為0.5%時,葡萄糖和木糖的得率分別為84.77%和85.05%,達(dá)到最大值,比未添加硫酸的樣品分別增加了42.40%和33.72%。但是,當(dāng)進(jìn)一步增加硫酸用量到0.75%時,葡萄糖和木糖得率反而降低了。這主要是因為PA預(yù)處理過程中H2SO4用量的增加能夠促進(jìn)過氧化氫和乙酸的反應(yīng),使其產(chǎn)生更多的過氧乙酸,過氧乙酸能夠破壞木質(zhì)素與碳水化合物復(fù)合物(LCC)之間的復(fù)合結(jié)構(gòu),甚至是木質(zhì)素基本單元之間的連接鍵,使大量的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)被破壞并溶出[13-14]。從表1可知,當(dāng)硫酸用量從0.5%增加到0.75%時,底物中木質(zhì)素脫除率從80.32%增加到86.53%,葡萄糖和木糖得率(圖1)略有下降,表明盡管高的硫酸用量能夠促進(jìn)PA預(yù)處理過程中底物木質(zhì)素的溶解,但是并沒有增效酶解得率,可能是在預(yù)處理過程中有抑制酶水解效率的副產(chǎn)物附著在底物上面。

a.葡萄糖 glucose; b.木糖 xylose

2.1.3發(fā)酵效率 將不同H2SO4用量下的PA預(yù)處理巨龍竹進(jìn)行纖維素酶水解72 h后,收集水解上清液。同時配制20、 30和40 g/L的葡萄糖水溶液,分別命名為Glu-20、Glu-30和Glu-40。利用釀酒酵母將水解上清液和葡萄糖溶液發(fā)酵18 h,發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度、乙醇質(zhì)量濃度和乙醇得率如圖2所示。從圖中可以看出,在最初的10 h,釀酒酵母快速地轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中的葡萄糖,在16 h時葡萄糖幾乎被消耗殆盡。其中巨龍竹原料發(fā)酵10 h產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度和得率分別為0.196 g/L和3.48%,而DS/PA-0的水解液發(fā)酵10 h后,乙醇質(zhì)量濃度和得率分別為7.80 g/L和65.25%,當(dāng)添加0.5%硫酸作PA預(yù)處理的助劑后,乙醇的質(zhì)量濃度和得率分別為13.52 g/L和83.24%,比DS/PA-0分別提高了73.33%和27.57%。而Glu-30的乙醇質(zhì)量濃度和得率分別為14.46 g/L和88.01%,高于具有同等發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度的DS/PA-0.5,在DS/PA-0.5發(fā)酵液中檢測到了甲酸(1.23 g/L)和乙酸(0.79 g/L),這表明水解過程產(chǎn)生的酸類物質(zhì)會阻礙釀酒酵母對葡萄糖的轉(zhuǎn)化[15]。此外,發(fā)酵10 h時,乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最高值,之后隨著發(fā)酵時間的延長,乙醇質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢,原因可能是在失去了葡萄糖后,釀酒酵母會繼續(xù)消耗溶液中的乙醇來提供能量[16]。

a.葡萄糖質(zhì)量濃度 glucose mass concn.; b.乙醇質(zhì)量濃度 ethanol mass concn.; c.乙醇得率 ethanol yield

2.2 巨龍竹預(yù)處理后的理化性質(zhì)

2.2.1疏水度和酶可及度 不同硫酸用量下PA預(yù)處理的樣品疏水度如表2所示,未處理巨龍竹的疏水度為0.871 L/g,經(jīng)過無硫酸助劑的PA預(yù)處理后,底物疏水度降低到0.192 L/g,比原料降低了77.85%,說明PA預(yù)處理使巨龍竹原料中疏水性物質(zhì)脫除,物料的結(jié)構(gòu)或表面特征發(fā)生了變化。當(dāng)在PA預(yù)處理過程中添加了硫酸作為助劑后,底物疏水度呈現(xiàn)進(jìn)一步降低的趨勢,均下降了約30%,這可能是因為隨著硫酸用量從0.1%增加0.5%,木質(zhì)素的脫除率從38.20%增加到80.32%,大量疏水性木質(zhì)素的溶解,使底物疏水性降低,親水性能增加,并且PA預(yù)處理也可能改變底物中殘余木質(zhì)素結(jié)構(gòu),進(jìn)而改變底物的親/疏水性能,而親水性和酶可及度的提高將有利于增加底物與酶的接觸,從而提高酶水解效率。酶可及度是制約纖維素酶水解效率的主要因素之一,纖維素酶對底物可及度的增加,能夠提高底物對纖

表2 H2SO4用量對疏水度和酶可及度的影響

維素酶的吸附量和底物與酶蛋白之間的親和力,進(jìn)而增效纖維素酶水解效率[17]。不同硫酸用量的PA預(yù)處理的酶可及度如表2所示,巨龍竹原料的酶可及度為153.12 mg/g;經(jīng)過無硫酸作助劑的PA預(yù)處理后,酶可及度提高到282.15 mg/g,較巨龍竹原料增加了86.35%,這主要是由于巨龍竹經(jīng)過PA預(yù)處理后,大約30%的木質(zhì)素被除去,導(dǎo)致纖維底物暴露,使酶可及度增加。當(dāng)PA預(yù)處理采用不同用量的H2SO4作助劑處理物料時,比DS提高了大約1.9～2.3倍,酶解72 h后葡萄糖得率增加了16%～42%。當(dāng)硫酸用量增加到0.75%時,酶可及度反而降低了,主要是因為預(yù)處理底物表面有木質(zhì)素覆蓋或者是木質(zhì)素凝縮結(jié)構(gòu)的增多,阻礙了纖維素對酶的吸附[18]。

2.2.2XRD分析 采用XRD測定了未處理巨龍竹、無硫酸作助劑的PA預(yù)處理巨龍竹和0.5%硫酸作助劑的PA預(yù)處理巨龍竹的結(jié)晶度,結(jié)果見圖3。從圖可知,巨龍竹原料的結(jié)晶度為62.35%,經(jīng)過無硫酸作助劑的PA預(yù)處理后,底物(DS/PA-0)的結(jié)晶度增加到67.31%,這主要是由于在預(yù)處理過程中,無定形區(qū)的物質(zhì)(如木質(zhì)素)的脫除溶解,導(dǎo)致纖維素結(jié)晶區(qū)相對比例的增加,而經(jīng)過添加0.5%硫酸的PA預(yù)處理后,底物(DS/PA-0.5)結(jié)晶度為68.51%,與DS/PA-0的結(jié)晶度相比略有增加。

圖3 PA預(yù)處理前后巨龍竹的XRD圖譜

2.2.3BET比表面積 通過BET法對未處理、無硫酸作助劑的PA預(yù)處理和硫酸用量0.5%的PA預(yù)處理巨龍竹的比表面積進(jìn)行分析,樣品的N2吸附/脫附曲線,如圖4所示。

DS的BET比表面積為0.99 m2/g,經(jīng)過無硫酸作為助劑的PA預(yù)處理后,DS/PA-0的BET比表面積增加到1.30 m2/g;當(dāng)硫酸作為助劑添加到PA預(yù)處理過程中,DS/PA-0.5的BET比表面積進(jìn)一步增加到1.41 m2/g,比原料DS和DS/PA-0分別增大42%和9%。預(yù)處理后BET比表面積的增加與樣品微觀結(jié)構(gòu)的破壞密切相關(guān),如大部分木質(zhì)素的去除和部分半纖維素的溶解。底物比表面積增大,能夠與酶有更多的接觸面積,增加底物對纖維素酶的吸附量,進(jìn)而增效纖維素酶水解[19]。

2.2.4XPS分析 采用XPS來分析過氧化氫-乙酸(PA)預(yù)處理前后巨龍竹表面木質(zhì)素覆蓋率和化學(xué)鍵類型的變化,如表3所示。

表3 PA預(yù)處理前后巨龍竹的表面特征

3 結(jié) 論

3.1過氧化氫-乙酸(PA)預(yù)處理能夠有效地脫除巨龍竹中的木質(zhì)素,隨著預(yù)處理過程中H2SO4用量從0增加到0.75%,木質(zhì)素脫除率從28.68%增加到86.53%;底物中大量木質(zhì)素的脫除,導(dǎo)致葡聚糖和木聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加。

3.2硫酸用量對PA預(yù)處理巨龍竹酶水解和發(fā)酵產(chǎn)乙醇效率影響明顯。預(yù)處理過程中,當(dāng)硫酸用量為0.5%時,葡萄糖和木糖得率分別為84.77%和85.05%,是未添加硫酸的1.42倍;水解液經(jīng)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度和得率分別為13.52 g/L和83.24%。

3.3在巨龍竹PA預(yù)處理過程中添加硫酸作為助劑,可以降低底物的疏水性和底物表面木質(zhì)素覆蓋率,增加比表面積,使纖維素酶可及度從未添加硫酸時的282.15 mg/g提高到添加0.5%硫酸的500.12 mg/g,增加了纖維素酶蛋白和纖維素之間的生產(chǎn)性吸附。