沈陽，馬婷偉，吳晶，柴雨柱

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

鹽酸伊伐布雷定（Ivabradine Hydrochloride）是首個單純減慢心率的特異性If抑制劑，本品適用于竇性心律且心率≥75 次/分鐘、伴有心臟收縮功能障礙的NYHAII-IV級慢性心力衰竭患者，與標(biāo)準(zhǔn)治療β-受體阻礙滯劑聯(lián)合用藥，或者用于禁忌或不能耐受β-受體阻礙滯劑治療時。其作用機制是通過選擇性抑制心臟起搏點If（控制在竇房結(jié)內(nèi)的自發(fā)舒張去極化和調(diào)節(jié)心率）電流，對竇房結(jié)有選擇性作用而對心臟內(nèi)傳導(dǎo)、心肌收縮或心室復(fù)極化無作用[1-3]。本品的特異性決定了其對支氣管、血脂、血糖、血壓無干擾的特點，在減慢心率的同時不影響心肌收縮和平均射血室壁壓；治療劑量下不影響QTc，無尖端扭轉(zhuǎn)風(fēng)險，也不干擾心房、房室結(jié)、希氏-浦肯野系統(tǒng)及心室的傳導(dǎo)功能[4-5]。

鹽酸伊伐布雷定由法國施維雅（Servier）公司研發(fā)，于2005年10月歐洲藥品審評署（EMEA）批準(zhǔn)在27個歐洲國家上市，商品名為Procoralan。2014年4月，F(xiàn)DA授予Amgen 公司實驗性藥物伊伐布雷定治療慢性心臟衰竭（HF）的快速通道地位。

鹽酸伊伐布雷定具有一個手性中心，為S 異構(gòu)體，分子結(jié)構(gòu)圖見圖1。R 型異構(gòu)體暫無藥理活性，其含量需要嚴(yán)格控制，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量安全[6]。目前，鹽酸伊伐布雷定異構(gòu)體的檢測標(biāo)準(zhǔn)暫未收載在各國藥典中，國內(nèi)也沒有局頒標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)文獻(xiàn)鮮有報道[7-11]。我們參考了文獻(xiàn)和各技術(shù)研究指導(dǎo)原則，結(jié)合該產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，建立了鹽酸伊伐布雷定原料藥中R-異構(gòu)體測定的方法——正相色譜法，以期為該原料藥質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖1 鹽酸伊伐布雷定分子結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT液相色譜儀，Lasolution色譜工作站，日本島津公司；XP205DR 電子分析天平，METTLER TOLEDO 公司。

1.2 試藥

供試品，鹽酸伊伐布雷定，南京正大天晴制藥有限公司，批號：121001；對照品，鹽酸伊伐布雷定工作對照品，南京正大天晴制藥有限公司，批號：20120720；對映異構(gòu)體，南京正大天晴制藥有限公司，批號：20120725；正己烷、異丙醇、三乙胺、乙醇、二乙胺、三氟乙酸均為色譜級。

2 檢測方法的選擇

2.1 波長的篩選

分別取鹽酸伊伐布雷定、對映異構(gòu)體對照品適量，先加入乙醇溶解（每10 mL 量瓶中加入2 mL），再用正己烷∶乙醇∶二乙胺∶三氟乙酸（92∶8∶0.1∶0.1）稀釋制成每1 mL 中約含25 μg 的溶液，作為供試品溶液。在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體的紫外掃描（nm）

結(jié)果與分析：鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體均在286 nm 和210 nm 波長附近有最大吸收，在對映異構(gòu)體測定波長選擇時，我們綜合考慮，選擇干擾較小的286 nm作為本品對映異構(gòu)體的測定波長。

2.2 色譜條件的篩選

參考鹽酸伊伐布雷定原臨床申報標(biāo)準(zhǔn)（南京正大天晴制藥有限公司），優(yōu)化對映異構(gòu)體測定色譜條件。當(dāng)選用CHIRALPAK AS-H（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相條件設(shè)定為正己烷∶乙醇∶二乙胺∶三氟乙酸（92∶8∶0.1∶0.1），流速為0.5 mL·min-1時，鹽酸伊伐布雷定（主峰）與對映異構(gòu)體（雜質(zhì)）保留時間（RT）分別為123.373 min、137.356 min，目標(biāo)峰保留時間較晚，檢測效率低；當(dāng)流速改為0.8 mL·min-1時，相同條件下鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體的RT 分別為79.073 min、88.828 min，峰型較寬，分離度為1.469，無法達(dá)到基線分離。

選用CHIRALPAK AD-H（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，流速設(shè)為0.8 mL·min-1時，調(diào)整流動相體系與比例，鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體的分離情況見表1。

表1 色譜條件篩選

2.3 色譜條件

綜上實驗結(jié)果，確定最終檢測條件如下：

色譜柱：CHIRALPAK AD-H（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇-三乙胺（60∶40∶0.1），等度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：286 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

3 方法驗證與結(jié)果

3.1 專屬性定位實驗

對映異構(gòu)體溶液的配制：精密稱定對映異構(gòu)體對照品，以流動相為溶劑，配成每1 mL 中約含1.0 mg 的溶液，即得。

鹽酸伊伐布雷定溶液配制：精密稱定鹽酸伊伐布雷定對照品，配成每1 mL中約含1.0 mg的溶液，即得。

混合溶液配制：精密稱定鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體對照品各約5 mg，置于100 mL量瓶中，以流動相為溶劑，溶解搖勻，即得。

測定：取上述各供試品溶液與流動相（空白）各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，定位試驗結(jié)果見圖3。

圖3 鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體混合溶液分離圖

由上述實驗結(jié)果可知：空白溶劑對對映異構(gòu)體檢測無干擾，主峰與對映異構(gòu)體的分離度大于1.5，見圖3，該方法專屬性良好。

3.2 溶液穩(wěn)定性實驗

待測溶液：取鹽酸伊伐布雷定適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成1.0 mg·mL-1的溶液。按照前述的色譜條件，在25℃放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 和12 h分別進(jìn)樣20 μL，對對映異構(gòu)體和主峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表2。

表2 待測溶液穩(wěn)定性考查結(jié)果

表3 系統(tǒng)適用性試驗溶液穩(wěn)定性考查結(jié)果

3.3 系統(tǒng)適用性試驗溶液穩(wěn)定性

系統(tǒng)適用性試驗溶液：取鹽酸伊伐布雷定與對映異構(gòu)體對照品各約5 mg，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。按前述色譜條件，在25℃放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h分別進(jìn)樣20 μL，對對映異構(gòu)體和主峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表4。

以上結(jié)果表明，待測溶液和系統(tǒng)適用性試驗溶液在12 h內(nèi)峰面積沒有明顯變化，說明本品在流動相中25℃放置至少12 h內(nèi)構(gòu)型不會發(fā)生轉(zhuǎn)變。

3.4 對映異構(gòu)體的線性與范圍

貯備液的配制：精密稱量對映異構(gòu)體對照品約15 mg，置50 mL量瓶中，以流動相為溶劑溶解稀釋至刻度，即得。

線性溶液的配制：精密量取上述溶液100 μL、200 μL、250 μL、400 μL、500 μL、600 μL 分別置于100 mL、100 mL、50 mL、50 mL、50 mL、50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得。

精密量取上述溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖，以對映異構(gòu)體進(jìn)樣量為x軸，峰面積為y 軸，對映異構(gòu)體進(jìn)樣量在6.19～74.30 ng 范圍內(nèi)與峰響應(yīng)值呈顯著線性關(guān)系，對映異構(gòu)體線性方程為y=1 157.50x-2 499.86，相關(guān)系數(shù)r 為0.999 5，具有良好的線性關(guān)系。

3.5 檢測限與定量限實驗

取對映異構(gòu)體對照品適量，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，取上述溶液逐次稀釋進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL，按信噪比（S/N）3∶1計算檢測限，按信噪比（S/N）10∶1計算定量限，對映異構(gòu)體的檢測限質(zhì)量為2.1 ng，相當(dāng)于供試品濃度0.01%；定量限質(zhì)量為4.7 ng，相當(dāng)于供試品濃度0.02%，該方法靈敏度良好。

3.6 準(zhǔn)確度實驗

對映異構(gòu)體按照供試液濃度的0.03%、0.15%、0.3%三個點配制樣品，每份樣品平行配制3 份，共9 份。按“2.3”下色譜條件注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算對映異構(gòu)體的含量與準(zhǔn)確度。結(jié)果：平均準(zhǔn)確度為94.05%，RSD小于5.0%，該方法準(zhǔn)確度良好。

3.7 進(jìn)樣精密度與重復(fù)性實驗

方法：分別取對映異構(gòu)體與鹽酸伊伐布雷定適量，以流動相為溶劑，配制成每1 mL 分別含有3 μg、10 μg樣品的溶液，作為混合供試品溶液。按照上述色譜條件，精密量取該供試品溶液20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，重復(fù)進(jìn)樣6次，以主峰與雜質(zhì)峰面積計算，其RSD 均小于2.0%，進(jìn)樣精密度良好。

按上述制備方法，平行配制6 份混合供試品溶液，以主峰與雜質(zhì)峰面積計算，其RSD 均小于2.0%（n=6），該方法的重復(fù)性良好。

3.8 樣品異構(gòu)體的測定

依“2.3”項色譜檢測方法，取5批鹽酸伊伐布雷定原料藥，2 批鹽酸伊伐布雷定參比制劑，對對映異構(gòu)體進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，5批鹽酸伊伐布雷定原料對映異構(gòu)體均未檢出，2批鹽酸伊伐布雷定參比制劑中分別檢出對映異構(gòu)體含量為0.03%、0.03%。

4 結(jié)論

本研究的分析方法對于鹽酸伊伐布雷定對映異構(gòu)體檢測簡便、準(zhǔn)確、可行，分離效果理想，專屬性強，靈敏度高，可作為異構(gòu)體檢測的質(zhì)控方法。