■ 李若銘 陳秀梅 田佳鑫 孔祎頔 韓明銘 任義波 王桂芹*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春 130033；3.淮安禾豐飼料有限公司，江蘇淮安 223005）

烏鱧（Channa argus）作為我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，又稱黑魚、火頭、財(cái)魚等，因其生長快、沒有肌間刺、生命力強(qiáng)等優(yōu)勢，深受消費(fèi)者的青睞[1-4]。隨著集約化養(yǎng)殖環(huán)境的發(fā)展，水環(huán)境受到了污染，養(yǎng)殖者為了滿足市場對(duì)水產(chǎn)品的需求，錯(cuò)誤地投喂高糖高脂飼料以及因儲(chǔ)存不當(dāng)導(dǎo)致的霉變飼料，破壞了烏鱧的養(yǎng)殖環(huán)境，增加了烏鱧腸道對(duì)細(xì)菌的易感性，使其健康受到了嚴(yán)重的威脅，進(jìn)而降低了烏鱧的經(jīng)濟(jì)效益[5]。于是，為了解決這些問題，養(yǎng)殖者們大量使用化學(xué)藥物并濫用抗生素，這不僅會(huì)導(dǎo)致藥物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)殘留，而且還會(huì)引起多種耐藥菌株的增加，阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖的綠色發(fā)展，同時(shí)，對(duì)水產(chǎn)品的質(zhì)量也產(chǎn)生了不良影響[6]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告的頒布，宣布了我國的“全面禁抗”時(shí)代已經(jīng)到來，尋求綠色、經(jīng)濟(jì)、有效的替抗物質(zhì)是水產(chǎn)養(yǎng)殖的重點(diǎn)研究方向，這對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。中藥具有高效、副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，是一種安全的飼料添加劑[7-8]。但由于中藥的加工工藝，使飼料的適口性變差，為了尋求效果更佳、殘留更少的替抗產(chǎn)品，經(jīng)過益生菌的發(fā)酵后，中藥的有效成分充分釋放，同時(shí)改善飼料的適口性，發(fā)酵后具有綠色、環(huán)保、無污染的優(yōu)點(diǎn)。因此，益生菌發(fā)酵中草藥的應(yīng)用與開發(fā)已成為國內(nèi)外開展替抗研究的熱點(diǎn)之一[9-10]。但是益生菌發(fā)酵中藥作為新興替抗產(chǎn)品在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用較少，因此，本試驗(yàn)以烏鱧為研究對(duì)象，利用鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）發(fā)酵復(fù)方中草藥，探究發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧生長性能和腸道抗氧化及抗病力的影響，旨在為烏鱧的健康養(yǎng)殖和綠色發(fā)展以及發(fā)酵中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌的活化、復(fù)方中藥液和發(fā)酵產(chǎn)物的制備

試驗(yàn)用L.rhamnosus、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供。將L.rhamnosus進(jìn)行活化，傳代培養(yǎng)后并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并將菌落數(shù)調(diào)整至1×108CFU/mL。

從吉林大藥房購買試驗(yàn)用黃連、木香、蒼術(shù)，洗凈后放置65 ℃烘箱中烘干，粉碎后過80目篩，蒼術(shù)∶黃連∶木香為6∶3∶2比例混合為復(fù)方中藥，精準(zhǔn)稱取10 g，加10倍體積水浸泡4 h，煎煮1 h，紗布過濾藥液至錐形瓶中。將上述所得復(fù)方中藥水體液，棄沉淀分裝，115 ℃滅菌15 min，即得制備好的復(fù)方中藥液，保存于4 ℃冰箱中備用。

取制備好的復(fù)方中藥液置于發(fā)酵罐中，加入活菌數(shù)為1×108CFU/mLL.rhamnosus，通過前期發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)參數(shù)：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，按此發(fā)酵條件制備發(fā)酵液，將發(fā)酵液過濾后獲得發(fā)酵產(chǎn)物放置4 ℃冰箱中備用。

1.2 飼料的制備

在基礎(chǔ)飼料中（見表1）分別添加0（對(duì)照組，無添加）、復(fù)方中藥、L.rhamnosus（1×108CFU/mL）、發(fā)酵中藥，配制成4種等氮等脂的試驗(yàn)飼料（見表2）。利用海藻酸鈉與飼料進(jìn)行混合，并置于烘干箱內(nèi)37 ℃烘干，烘干后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，在25 ℃空調(diào)房晾干，每3 d準(zhǔn)備一批新的飼料，保存在自封袋中4 ℃冷藏，以保持L.rhamnosus的活性，每天檢測制備的飼料中L.rhamnosus活性。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日常管理

購自山東臨沂某養(yǎng)殖場的烏鱧，暫養(yǎng)馴化14 d后，選取360尾體質(zhì)健康、大小一致的烏鱧，隨機(jī)分成4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾。養(yǎng)殖期間日常管理及水質(zhì)條件同暫養(yǎng)期間保持一致，水溫26～28 ℃，溶解氧大于5 mg/L，pH（7.1±0.1），氨氮含量<0.5 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.05 mg/L，每日飽食投喂兩次（09：00、16：00）。

1.4 樣品收集

飼養(yǎng)8 周試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，計(jì)數(shù)并稱重。每桶隨機(jī)抽取10 尾魚，用MS-222 麻醉后，冰上解剖取腸道液氮速凍后置于-80 ℃保存待測。

1.5 指標(biāo)測定

根據(jù)記錄的烏鱧初重、末重，按照常規(guī)公式計(jì)算平均增重率（WG）、特定生長率（SGR）、成活率（SR）和飼料效率（FER）。

烏鱧腸道超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物技術(shù)研究所有限公司試劑盒檢測，按照說明書進(jìn)行操作。

烏鱧腸道SOD、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）、緊密連接claudin-3 及閉合小環(huán)蛋白-1（ZO-1）mRNA 表達(dá)水平采用熒光定量PCR法檢測，引物序列見表3。

表3 引物序列

飼養(yǎng)試驗(yàn)8 周后，禁食2 d 后，腹腔注射100 μLA.hydrophila（1×107CFU/mL），攻毒后觀察14 d，記錄死亡情況，計(jì)算相對(duì)存活率評(píng)價(jià)保護(hù)效果。

存活率（RS，%）=（1-各組死亡魚總數(shù)/各組內(nèi)魚總數(shù)）×100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)組間差異，并用Duncan’s 多重比較檢驗(yàn)各處理組差異，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧生長性能的影響

由表4可知，復(fù)方中藥、L.rhamnosus和發(fā)酵中藥的添加使烏鱧的末重、WG、SGR和FER 顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而存活率無顯著差異（P>0.05）。復(fù)方中藥組和L.rhamnosus組的這些指標(biāo)均無顯著差異（P>0.05）。

表4 鼠李糖發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧生長的影響

2.2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧腸道抗氧化能力的影響

由圖1（A）和（C）可知，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，飼料中添加L.rhamnosus和發(fā)酵中藥組烏鱧腸道中的SOD和GSH-Px 活性均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而復(fù)方中藥組SOD 和GSH-Px 活性與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。由圖1（B）可知，復(fù)方中藥、L.rhamnosus和發(fā)酵中藥組烏鱧腸道中的CAT 活性均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），其中發(fā)酵中藥組達(dá)到最高。由圖1（D）可知，與對(duì)照組相比，所有試驗(yàn)組烏鱧腸道中的MDA 含量均顯著降低P<0.05），其中，且發(fā)酵中藥組達(dá)到最低。由圖2可得，與對(duì)照組相比，發(fā)酵中藥的添加顯著提高SOD、GST、claudin-3及ZO-1的表達(dá)量（P<0.05）。SOD和claudin-3表達(dá)量在L.rhamnosus組和復(fù)方中藥組之間無顯著差異（P>0.05），L.rhamnosus組和發(fā)酵中藥組之間無顯著差異（P>0.05），而復(fù)方中藥組和發(fā)酵中藥組之間有顯著差異（P<0.05）。GST的表達(dá)量在L.rhamnosus組和復(fù)方中藥組之間無顯著差異（P>0.05），而與發(fā)酵中藥組之間有顯著差異（P<0.05）。各組之間的ZO-1表達(dá)量均有顯著差異（P<0.05）。

圖1 鼠李糖發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧腸道抗氧化的影響

圖2 鼠李糖發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧腸道m(xù)RNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧抗病力的影響

由圖3 可知，對(duì)照組在攻毒后7 d 內(nèi)全部死亡，經(jīng)過14 d的觀察，復(fù)方中藥組、L.rhamnosus組以及發(fā)酵中藥組的死亡率低于對(duì)照組，死亡率分別為55%、50%、25%。

圖3 鼠李糖發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧抗病力的影響

3 討論

3.1 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧生長性能的影響

發(fā)酵中藥作為飼料添加劑已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，在畜禽動(dòng)物的研究中均證實(shí)發(fā)酵中藥的添加會(huì)提高飼料利用效率，同時(shí)具有提高動(dòng)物機(jī)體免疫力和抗氧化的能力[11-12]。中藥是一種兼具營養(yǎng)和藥用的天然傳統(tǒng)植物，益生菌是一種能夠促進(jìn)生長、提高抗氧化和抗逆性的活性微生物，二者具有協(xié)同作用[13-14]。發(fā)酵后，具有無抗藥性、安全高效等優(yōu)勢，發(fā)酵中藥能夠釋放出更多有效成分，增強(qiáng)其原有的性能，促進(jìn)活性成分更好地被吸收利用。中藥經(jīng)過發(fā)酵后，一方面，抗?fàn)I養(yǎng)因子被有效的降解、飼料的適口性得到了優(yōu)化，進(jìn)而提高了飼料的利用效率；另一方面，發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生不同類型的有機(jī)酸、生物堿、黃酮類等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有增進(jìn)食欲、增強(qiáng)誘食效果的作用[15-16]。本試驗(yàn)的結(jié)果證明了這一結(jié)論，雖然飼料中添加益生菌和復(fù)方中藥均能夠促進(jìn)烏鱧的生長，但是發(fā)酵中藥組的烏鱧WG 更高，促進(jìn)生長的效果更顯著。在對(duì)其他魚的研究上得出了相似的結(jié)論，齊國山等[17]在南北白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）的飼料中添加了不同濃度的發(fā)酵中藥連續(xù)投喂45 d，研究表明，添加1.0%～4.0%的發(fā)酵中藥均顯著提高了南美白對(duì)蝦的末重、WG 和SGR，但是不同發(fā)酵中藥的添加量之間差異不顯著。陳秀梅等[18]用添加乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）發(fā)酵復(fù)方中藥的飼料投喂烏鱧，研究乳酸乳球菌與復(fù)方中藥的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)其生長性能的影響，結(jié)果表明，中草藥發(fā)酵物能夠顯著提WG 和FER。謝炎福等[19]研究結(jié)果表明，與復(fù)方中藥組相比，中劑量發(fā)酵組的黃河鯉（Cyprinus carpio）WG 提高了11.7%，餌料系數(shù)降低了8.1%。由此可見，益生菌與復(fù)方中藥的發(fā)酵產(chǎn)物能夠促進(jìn)生長，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有營養(yǎng)價(jià)值。

3.2 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧腸道抗氧化的影響

腸道不僅能夠消化吸收，而且具有免疫功能、屏障功能等作用，氧化應(yīng)激與很多的綜合征相關(guān)，其中腸道受到氧化損傷的幾率更高且危害更大[20-21]。氧化應(yīng)激會(huì)使水產(chǎn)動(dòng)物的腸道黏膜受損，降低分泌吸收功能，同時(shí)，影響通過腸細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增殖分化和凋亡等過程。因此，水產(chǎn)動(dòng)物受到氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損，降低免疫力，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損傷。中藥經(jīng)過發(fā)酵后，不僅可以保持原有菌株的優(yōu)勢，而且能夠抑制病原菌繁殖生長；同時(shí)，清除自由基、調(diào)節(jié)腸道的菌群平衡，從而達(dá)到保護(hù)腸道健康的效果[22]。SOD、CAT、MDA、GSH-Px 和GST 作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的主要指標(biāo)，均在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的過程中發(fā)揮重要功能[23]。SOD、CAT和GSH-Px能夠有效清除機(jī)體自由基，MDA是檢測機(jī)體氧化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，過多的自由基產(chǎn)生就會(huì)攻擊細(xì)胞產(chǎn)生MDA，破壞機(jī)體的抗氧化屏障。孟欣等[24]研究干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵人參莖葉提取物對(duì)錦鯽（Carassius auratus）抗氧化功能的影響，結(jié)果表明，添加5%的益生菌發(fā)酵中藥組的SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著高于對(duì)照組，而MDA 含量顯著低于對(duì)照組，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。以上結(jié)果均可表明，益生菌與中藥共發(fā)酵產(chǎn)物可以清除魚體內(nèi)蓄積的自由基，增強(qiáng)魚類的抗氧化能力。魚體受到應(yīng)激時(shí)，腸道的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，病原菌侵入腸腔，會(huì)導(dǎo)致腸道損傷，進(jìn)而加重腸道屏障功能損傷[25]。而腸道緊密連接蛋白能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性和維持細(xì)胞極性，對(duì)腸道屏障保護(hù)具有重要意義，主要為封閉蛋白（Claudins）和跨膜蛋白與閉合小環(huán)蛋白（ZOs）[26-27]。Claudin-3作為緊密連接蛋白家族極具代表性的基因，Claudin-3表達(dá)量的下降會(huì)造成腸道通；ZO-1 與多種緊密連接蛋白聯(lián)系密切，而且在胞內(nèi)通路的信號(hào)傳輸方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，益生菌和中草藥的添加都能夠改善緊密蛋白結(jié)構(gòu)受損情況，降低腸上皮細(xì)胞間的通透性、阻擋病原菌的進(jìn)入，進(jìn)而有效保護(hù)魚類腸道屏障功能[28-30]。益生菌和中藥具有協(xié)同作用，經(jīng)過發(fā)酵后，效果更佳。盡管發(fā)酵中藥對(duì)保護(hù)腸道健康方面具有巨大潛力，但是對(duì)于腸道健康的調(diào)控機(jī)制仍然缺乏，還需要深入研究。

3.3 鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥對(duì)烏鱧抗病力的影響

發(fā)酵中藥在動(dòng)物疾病防治方面發(fā)揮重要作用，因此，發(fā)酵中草藥是一種安全的抗生素替代品，對(duì)綠色健康水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展具有重要意義。中藥和益生菌在抑菌和免疫調(diào)節(jié)中均有良好的效果，二者相互作用，中藥為益生菌的生長繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，而益生菌通過氧化、甲基化等生物反應(yīng)，對(duì)阻礙有效成分釋放的中藥細(xì)胞壁進(jìn)行消化，釋放更多有效活性物質(zhì)且產(chǎn)生更多的活性成分，進(jìn)而增強(qiáng)藥效、減少用量，從而縮短有效成分達(dá)到有效濃度的時(shí)間以及提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力和抗病力[31-35]。本試驗(yàn)攻毒嗜水氣單胞菌后觀察并記錄死亡情況，結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵中藥能夠有效地阻止病原菌的侵襲，降低烏鱧的死亡率，提高相對(duì)免疫保護(hù)率。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了中藥發(fā)酵后不僅可以分泌更多的抑菌物質(zhì)，而且可以通過營養(yǎng)爭奪的方式抑制病原菌的生長[19，36]。李永娟等[37]研究表明投喂發(fā)酵中藥的飼料，能夠提高草魚（Ctenopharyngodon idella）抗嗜水氣單胞菌能力。湯菊芬等[38]用含哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）的水浸泡凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei），對(duì)照組和發(fā)酵組的死亡率分別為93.33%、31.11%，說明在飼料中添加發(fā)酵中藥提高了水產(chǎn)動(dòng)物的成活率，促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。但目前，益生菌和中藥的種類繁多、來源廣泛，使發(fā)酵產(chǎn)物具有差異性，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物的功能和效果大不相同，因此，篩選不同功效的發(fā)酵中藥作為水產(chǎn)飼料添加劑需要進(jìn)一步地探究，且發(fā)酵中藥的作用機(jī)制也需深入研究。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗(yàn)條件下，鼠李糖乳桿菌與復(fù)方中藥共發(fā)酵產(chǎn)物不僅能夠促進(jìn)烏鱧的生長和腸道健康，而且在遭受細(xì)菌感染時(shí)，具有更高的存活率。