■ 楊仕鈺 張?zhí)m蘭 燕志宏 吳光松 李 平 龔 涔 曹莉麗 邱雪松

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州煜宏生物科技有限公司，貴州貴陽(yáng) 550604；3.開(kāi)陽(yáng)縣畜禽品種改良站，貴州貴陽(yáng) 550300；4.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州貴陽(yáng) 550024）

我國(guó)是牛羊養(yǎng)殖大國(guó)，也是草牧業(yè)種植大國(guó)，對(duì)青貯飼料需求極高，青貯飼料主要由牧草、農(nóng)業(yè)和食品加工副產(chǎn)物青貯發(fā)酵而成，玉米秸稈是青貯最豐富的原料之一，也是反芻動(dòng)物的主要飼糧，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、飼喂成本低、易保存等特點(diǎn)[1-2]。青貯發(fā)酵主要原理是飼草表面的微生物在厭氧條件下利用飼草中可溶性碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，形成酸性環(huán)境[3]，從而抑制好氧性細(xì)菌、霉菌和梭菌的生長(zhǎng)[4]。青貯添加劑能顯著提升青貯品質(zhì)[5]，廉價(jià)培養(yǎng)基的篩選對(duì)開(kāi)發(fā)青貯玉米秸稈微生物作為青貯添加劑尤為重要。青貯飼料發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物菌落演替過(guò)程[6]，青貯微生物的組成受青貯原料、環(huán)境氣候、加工工藝、厭氧程度等因素影響[7-10]。不同環(huán)境下的青貯微生物組成各不相同，保安安[11]研究結(jié)果表明青藏高原青貯微生物菌群主要由腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）組成；Li等[12]研究熱帶青貯微生物菌群表明，菌群主要為魏斯氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬（Pantoea）等；梁幸等[13]研究表明廣西青貯微生物主要由乳桿菌屬、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Pphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）為主，后期以乳桿菌屬為主；楊佳等[14]研究不同添加劑對(duì)青貯品質(zhì)提升效果不同，辛亞芬等[5]研究表明青貯添加劑的組成成分不同也會(huì)對(duì)青貯品質(zhì)產(chǎn)生影響，添加微生物菌劑能提升青貯品質(zhì)[15-17]。

廉價(jià)培養(yǎng)基是對(duì)適用培養(yǎng)基進(jìn)行原料替換和微量元素的控制進(jìn)而達(dá)到降低培養(yǎng)菌群成本的低成本培養(yǎng)基[18]，乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（De Man Rogosa Sharpe，MRS）作為青貯微生物常用培養(yǎng)基，其成本較高，難以作為青貯添加劑主要成分開(kāi)發(fā)利用。在養(yǎng)殖過(guò)程中，養(yǎng)殖戶常因添加劑成本較高、制作工藝復(fù)雜等因素沒(méi)有持續(xù)使用，使得青貯添加劑技術(shù)難以快速推廣。青貯添加劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用的關(guān)鍵技術(shù)在于改良青貯菌劑組成成分和純化微生物菌種，改良青貯菌劑組成成分有利于降低青貯添加劑的成本，改善青貯品質(zhì)，助推青貯添加劑技術(shù)的高速發(fā)展。

本試驗(yàn)通過(guò)采集貴州青貯玉米秸稈飼料，篩選3 種常見(jiàn)廉價(jià)培養(yǎng)基，對(duì)貴州青貯微生物多樣性、微生物組成、微生物生長(zhǎng)曲線、活菌數(shù)和菌劑產(chǎn)量進(jìn)行研究，闡述不同廉價(jià)培養(yǎng)基對(duì)青貯微生物的影響，篩選廉價(jià)培養(yǎng)基作為青貯添加劑的發(fā)酵成分，降低青貯添加劑成本，推動(dòng)青貯發(fā)酵技術(shù)的高效發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MRS固體培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）、MRS肉湯培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司）、4.6%中蛋白乳清粉（佛山西隴化工有限公司）、葡萄糖（佛山西隴化工有限公司）、玉米面（市購(gòu)）、分析純NaCl（成都金山化學(xué)試劑有限公司）、番茄（市購(gòu)）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用貴州優(yōu)質(zhì)全株玉米秸稈原料不添加微生物菌劑裝入聚乙烯袋中，封口置于平均溫度24 ℃室內(nèi)進(jìn)行厭氧發(fā)酵，青貯發(fā)酵90 d，劃開(kāi)聚乙烯袋后，將青貯料取出，充分混勻，隨機(jī)取樣并立即放入加有20%的無(wú)菌甘油EP管中，將EP管置于液氮中進(jìn)行保存，再取樣品100 g 與生理鹽水按照1：9 稀釋，加入無(wú)菌細(xì)菌凍存液，放入液氮罐保存。取部分樣品送往蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序；帶回實(shí)驗(yàn)室后使用MRS 固體培養(yǎng)基對(duì)青貯微生物進(jìn)行分離純化，按2%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)4個(gè)處理，3個(gè)重復(fù)，分別為MRS肉湯培養(yǎng)基組、乳清粉培養(yǎng)基組、玉米面培養(yǎng)基組、番茄汁培養(yǎng)基組。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配置

MRS 固體培養(yǎng)基由胰酪胨10 g、牛肉膏粉5 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂15 g、吐溫80 1 mL組成；MRS肉湯培養(yǎng)基由蛋白胨10 g、牛肉粉8 g、酵母粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.04 g、吐溫80 1 mL組成；乳清粉培養(yǎng)基由4.6%中蛋白乳清粉50 g、葡萄糖10 g組成。玉米面培養(yǎng)基由玉米面與水按照1：40 的比例在60 ℃煮1 h 后用0.2 mm 過(guò)濾器過(guò)濾，過(guò)濾后加入1%葡萄糖和0.05%氯化鈉制成；番茄汁培養(yǎng)基用市場(chǎng)的番茄熬煮制成番茄汁，按1：5稀釋番茄汁制成。培養(yǎng)基配置完成后用1%鹽酸將pH調(diào)至6.4，121 ℃滅菌20 min。

1.3.2 青貯微生物分離培養(yǎng)及鑒定

稱取10 g 青貯玉米飼料加入到250 mL 含有研磨珠的錐形瓶?jī)?nèi)，加入90 mL 生理鹽水，進(jìn)行研磨制成懸浮液，取上清液備用；在超凈工作臺(tái)內(nèi)用生理鹽水按照1：9比例進(jìn)行梯度稀釋，振蕩混勻，選擇10-4、10-5、10-6稀釋液100 μL，涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，于37 ℃倒置厭氧培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)皿上所有菌種刮入凍存管中保藏。

1.3.3 青貯微生物DNA提取及Illumina Miseq測(cè)序

使用Tiangen DNA kit 提取分離純化菌株總DNA。送往蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增V3～V4 區(qū)。將測(cè)序結(jié)果與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release132，http://www.arb-silva.de）進(jìn)行OTU 序列比對(duì)，篩選有效序列。16S rRNA 擴(kuò)增V3-V4 區(qū)引物為通用引物，序列為27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3'，1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTAC-3'。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

將分離純化的菌種按2%接種量分別接種到MRS肉湯培養(yǎng)基、玉米面培養(yǎng)基、乳清粉培養(yǎng)基、番茄汁培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，每2 h取一次樣，使用賽多利斯pH 計(jì)測(cè)定pH，使用普析T6 紫外分光光度計(jì)在600 nm 處測(cè)定OD 值；培養(yǎng)48 h 取1 mL 的菌液加入99 mL的生理鹽水梯度稀釋，稀釋至10-8、10-9、10-10三個(gè)梯度濃度，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中注入1 mL 稀釋菌液，將MRS 固體培養(yǎng)基傾注培養(yǎng)皿中，用量約15 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使菌液與MRS 固體培養(yǎng)基均勻混合；倒置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)72 h。采用菌落計(jì)數(shù)器進(jìn)行觀察，參考GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》計(jì)算活菌數(shù)。將剩余菌液在盧湘儀18M 離心機(jī)12 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，稱取空管重和菌重，計(jì)算菌種產(chǎn)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

微生物測(cè)序數(shù)據(jù)使用R 4.2.1 進(jìn)行Alpha 多樣性和豐度計(jì)算處理；使用SPSS 27進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，分別對(duì)不同培養(yǎng)基微生物生長(zhǎng)曲線、pH、活菌數(shù)、產(chǎn)率進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin 2018 制圖。P≤0.05表示差異顯著，P≤0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯飼料微生物組成分析

通過(guò)對(duì)青貯飼料進(jìn)行16S 測(cè)序分析，結(jié)果由圖1可知，青貯飼料中微生物門(mén)水平菌群主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）組成。貴州青貯飼料微生物屬水平菌群主要由魏斯氏菌屬（Weissella），豐度值為51.20%；假單胞菌屬（Pseudomonas），豐度值為34.25%；片球菌屬（Pediococcus），豐度值為12.75%等菌屬組成。

2.2 青貯微生物Alpha多樣性研究

由表1 可知，青貯飼料中微生物Simpson 指數(shù)為0.684 2，Shannon指數(shù)為7.445 5，Chao指數(shù)為1 887.197，ACE指數(shù)為1 901.210 2。

表1 青貯飼料微生物Alpha多樣性指數(shù)

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)青貯微生物活菌數(shù)的影響

由圖2可知，其青貯微生物活菌數(shù)依次是MRS肉湯培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組>玉米面培養(yǎng)基組。結(jié)果表明，MRS肉湯培養(yǎng)基組活菌數(shù)極顯著高于其余各組（P≤0.01），乳清粉培養(yǎng)基組活菌數(shù)極顯著高于玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.01），番茄培養(yǎng)基組活菌數(shù)顯著高于玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.05），乳清粉培養(yǎng)基組與番茄培養(yǎng)基組差異不顯著（P>0.05）。MRS肉湯培養(yǎng)基組、乳清粉培養(yǎng)基組、玉米面培養(yǎng)基組菌泥產(chǎn)量差異不顯著（P>0.05），玉米面培養(yǎng)基組菌泥產(chǎn)量極顯著高于其他組（P≤0.01）。

圖2 不同培養(yǎng)基的青貯微生物活菌數(shù)差異

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)青貯微生物pH、生長(zhǎng)曲線的影響

如圖3 所示，各組培養(yǎng)基在培養(yǎng)貴州青貯微生物48 h后，pH：玉米面培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>MRS肉湯培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組；OD值：MRS肉湯培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組>玉米面培養(yǎng)基組。如圖4所示，番茄汁培養(yǎng)基組pH顯著低于MRS肉湯培養(yǎng)基組、乳清粉培養(yǎng)基組（P≤0.05），極顯著低于玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.01），MRS肉湯培養(yǎng)基組與乳清粉培養(yǎng)基組差異不顯著（P>0.05）；MRS肉湯培養(yǎng)基組的OD值顯著高于乳清粉培養(yǎng)基組（P≤0.05），極顯著高于番茄汁培養(yǎng)基組、玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.01），乳清粉培養(yǎng)基組OD值極顯著高于番茄汁培養(yǎng)基組、玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.01），番茄汁培養(yǎng)基組OD值顯著高于玉米面培養(yǎng)基組（P≤0.05）。

圖3 不同培養(yǎng)基組青貯微生物pH及生長(zhǎng)曲線變化圖

圖4 不同培養(yǎng)基組青貯微生物pH和OD值

3 討論

近年來(lái)對(duì)地方青貯微生物作為青貯添加劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用研究逐漸增加[19]，青貯添加劑主要有乳酸菌制劑、化學(xué)添加劑、酶制劑、營(yíng)養(yǎng)性添加劑等[20]。其中微生物添加劑改善效果最為顯著，很多的微生物青貯添加劑均已實(shí)現(xiàn)商品化，并且制備開(kāi)發(fā)的新型添加劑也在不斷涌現(xiàn)[21]。本研究探究廉價(jià)培養(yǎng)基對(duì)青貯微生物的影響，旨在挖掘低成本的青貯微生物培養(yǎng)基配方，結(jié)果表明，貴州青貯微生物在不同培養(yǎng)基中活菌數(shù)依次是MRS肉湯培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組>玉米面培養(yǎng)基組，pH 為玉米面培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>MRS肉湯培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組，OD濃度為MRS肉湯培養(yǎng)基組>乳清粉培養(yǎng)基組>番茄汁培養(yǎng)基組>玉米面培養(yǎng)基組；MRS肉湯培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素全面，能提供乳酸菌繁殖生長(zhǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)條件[22]，乳清粉培養(yǎng)基因其含有較高蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等，常用作酵母菌發(fā)酵增菌培養(yǎng)基[23]，前人研究表明乳清粉培養(yǎng)基能提供促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提升發(fā)酵效果[24]，番茄培養(yǎng)基發(fā)酵效果優(yōu)于玉米面培養(yǎng)基，因番茄培養(yǎng)基初始pH和維生素含量豐富等條件優(yōu)于玉米面組[25-26]。本次研究表明MRS肉湯培養(yǎng)基具有高產(chǎn)、高品質(zhì)的效果，但其成本較高，難以作為青貯添加劑培養(yǎng)基進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，乳清粉培養(yǎng)基與MRS肉湯培養(yǎng)基同樣有著高產(chǎn)、高品質(zhì)的特點(diǎn)，并且乳清粉培養(yǎng)基成本低，可作為玉米秸稈青貯微生物添加劑的廉價(jià)培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

綜上，乳清粉培養(yǎng)基與MRS 肉湯培養(yǎng)基有著高產(chǎn)、高品質(zhì)的特點(diǎn)，可作為青貯玉米秸稈微生物添加劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用的廉價(jià)培養(yǎng)基。