■ 顧杰瑞 劉可意 丁 烽 劉午若 文穎月 李丕武

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東濟南 250353）

大米是我國重要的糧食作物之一，2021年度我國大米總產(chǎn)量約為1.47億噸，占全球大米產(chǎn)量的29%[1]。大米中主要成分包括碳水化合物（75%～80%）、蛋白質(zhì)（7%～8%）和脂質(zhì)（1.3%～1.8%），過去在我國食品加工行業(yè)中多以大米為原料生產(chǎn)淀粉和糖漿等產(chǎn)品，作為其生產(chǎn)副產(chǎn)物的大米蛋白卻沒有得到很好的利用，以往多被直接用作動物飼料，少數(shù)被開發(fā)利用成相關(guān)產(chǎn)品，大量的高質(zhì)量蛋白資源遭到浪費。

隨著近年來我國市場對蛋白粉需求量的不斷擴大，可作為食用蛋白粉直接生產(chǎn)原料的大米蛋白受到社會和市場越來越多的關(guān)注[2]。大米蛋白（rice protein，RP）具有易于消化吸收、低致敏性等特點，其生物效價為77，與WHO/FAO建議的營養(yǎng)模型相近，是一種優(yōu)質(zhì)的植源性膳食蛋白。由大米蛋白制備的大米多肽不僅有著很高的營養(yǎng)價值，還具有增強機體免疫力等作用[3]。大米蛋白主要由清蛋白（2%～5%）、球蛋白（2%～10%）、谷蛋白（66%～78%）和醇溶蛋白（1%～5%）組成，其中，水不溶性的谷蛋白和醇溶蛋白占80%以上[4]?，F(xiàn)有大米蛋白肽制備方法中最常用的是通過堿液溶解，然后加酸沉淀的方式，但是，在高堿性環(huán)境中，蛋白質(zhì)的產(chǎn)率通常很低，且容易發(fā)生交叉耦合和重排[5]，從而降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。目前研究和實踐方法中多采用酶制劑對大米蛋白進行增溶改性，并對其水解產(chǎn)物大米多肽進行功能特性和營養(yǎng)價值的開發(fā)。馬曉雨等[6]采用胰蛋白酶法將大米蛋白酶解，使大米蛋白的溶解和乳化性能得到明顯的提高，其抗氧化能力明顯增強，并可有效地改善其功能性。Singh 等[7]利用木瓜蛋白酶處理米糠蛋白，得到的水解產(chǎn)物RBPH 具有較高的溶解度和消化率，其潛在的生物活性有一定程度增加。許多研究者對超聲輔助酶處理大米蛋白的工藝進行了探究，如Fathi等[8]使用超聲-Alcalase 聯(lián)合處理的方法水解米糠蛋白（RBP），證實了超聲處理通過影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來增強酶水解的作用，并在超聲條件（150 W，40 min）下取得最高的水解度[（27.35±0.45）%]。與非水解樣品相比，生成水解物的蛋白質(zhì)和肽擁有更低的分子量。還有研究者運用多酶共同作用復(fù)合酶解等方式處理大米蛋白，如徐珍珍等[9]以大米蛋白為原料，采用優(yōu)化后的酶解法，制備大米蛋白肽，其蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)43.9%，且分子量較低，感官評定及生物活性均較好。為了進一步提高酶法水解大米蛋白的效力，本研究采用堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合酶解大米蛋白的工藝，結(jié)合超聲預(yù)處理技術(shù)，進行大米蛋白肽制備，檢測其溶解度和溶液中短肽含量的變化，并通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術(shù)和氨基酸分析儀對復(fù)合酶解產(chǎn)物進行分子結(jié)構(gòu)和氨基酸成分分析，進而優(yōu)化大米蛋白肽生產(chǎn)工藝，為大米蛋白的深加工技術(shù)提供進一步的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大米蛋白粉，山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活力單位200 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活力單位200 000 U/g），山東隆科特酶制劑有限公司；Methyl red 甲基紅指示劑、Bromocresol Green 溴甲酚綠指示劑，北京酷來搏科技有限公司；混合氨基酸標(biāo)品，北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、三氯乙酸，均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司的分析純試劑。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SCIENTZ-HF5000 超聲波循環(huán)提取機，寧波新芝生物科技股份有限公司；ES-E 系列標(biāo)準(zhǔn)分析天平，天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；PHS-3C 精密pH 計，濟南歐萊博生物科技有限公司；ZQZY-CF8E 三層組合式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；DSHZ-300 旋轉(zhuǎn)式水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；德國Hermle（哈默）大容量冷凍型高速離心機Z326K，賀默(上海)儀器科技有限公司；KDN-16C數(shù)顯溫控消化爐、KDN-1000全自動定氮儀，上海新嘉電子有限公司；FT-IRTracer100 傅里葉變換紅外光譜，日本島津公司;日立氨基酸自動分析儀L-8900，廣州儀德精密科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

稱取10 g（精確至0.000 1 g）大米蛋白粉置于250 mL玻璃燒杯中，加入0.1 mol/L NaOH溶液120 mL，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，配置成固液比1∶12的大米蛋白懸液，進行超聲預(yù)處理[10（]超聲處理的條件為：在每升處理液施加超聲功率250 W、超聲處理時間10 min、超聲工作間歇比1∶2、循環(huán)速率30 r/s）。冷卻至室溫后，在8 000 r/min、18 ℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為對照組。

將超聲預(yù)處理過的溶液pH 調(diào)至10，在50 ℃條件下，按質(zhì)量比0.8%加入堿性蛋白酶酶解2 h，酶解過程中保持pH不變，酶解結(jié)束后90 ℃水浴滅酶10 min，待冷卻到室溫，在8 000 r/min 、18 ℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為單一酶解組。

用0.2 mol/L HCl溶液將單一酶解組初始pH調(diào)節(jié)為7.5，按質(zhì)量比0.8%加入中性蛋白酶，在50 ℃條件下酶解2 h，酶解過程中維持pH 不變，復(fù)合酶解液水浴90 ℃滅酶10 min，冷卻至室溫后，在8 000 r/min 、18℃條件下離心15 min，取上清液，微濾、超濾后置于4 ℃保存，此為復(fù)合酶解組。

1.3.2 總氮含量的測定

總氮含量的測定采用凱氏定氮法[11]。使用移液器吸取1 mL 樣品溶液置于250 mL 消化管底部，加入0.4 g 五水硫酸銅和6 g 無水硫酸鉀，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)分次沿壁緩慢加入10 mL 濃硫酸，用掌心輕拍消化管外壁，將樣品和試劑小心混勻，在消化管口處放置彎頸漏斗，靜置過夜。放入消化爐中消解，首先設(shè)置240 ℃，不蓋蓋子保持30 min，然后轉(zhuǎn)為420 ℃，直至溶液變?yōu)榈{(lán)色，繼續(xù)保持1 h 后，將消化爐關(guān)掉，室溫冷卻、待測。利用全自動凱氏定氮儀對消化管進行蒸餾，設(shè)置程序為加入50 mL超純水、40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的氫氧化鈉溶液，反應(yīng)2 min 后，開始加熱，用20 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的硼酸溶液吸收。在蒸餾過程中，硼酸溶液會不斷吸收蒸餾出的氨水。在蒸餾結(jié)束后的硼酸吸收液中滴加1～2 滴甲基紅-溴甲酚綠指示劑，混勻，用酸性滴定管向蒸餾液中加入0.1 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，直至溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色，并記錄鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗體積。

式中：X——試樣中總氮含量（g/mL）；

V1——滴定試樣時所消耗的鹽酸體積（mL）；

V2——滴定空白試樣時所消耗的鹽酸體積（mL）；

V3——試樣取用量（mL）；

c——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度（mol/L）；

0.014——與1.00 mL 標(biāo)準(zhǔn)HCl 溶液相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量（g）。

1.3.3 大米蛋白粉溶解度測定

使用量程為10 mL玻璃量筒分別準(zhǔn)確量取對照組、單一酶解組和復(fù)合酶解組的大米蛋白溶液各10 mL，置于50 mL玻璃燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以4 200 r/min 離心10 min，小心移取上清液1 mL，放入消化管中，通過1.2.2中的方法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，同時測定同一樣品總蛋白質(zhì)含量[12]。

1.3.4 大米蛋白溶液中短肽含量評價

用三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）來衡量大米多肽中短肽含量[13]。使用量程為10 mL 的玻璃量筒分別準(zhǔn)確稱取對照組、單一酶解組和復(fù)合酶解組大米蛋白溶液各10 mL，置于50 mL玻璃燒杯中，在磁力攪拌器上攪拌15 min，混勻，使用10 mL 移液管分別準(zhǔn)確加入10 mL 10%的三氯乙酸（TCA），靜置30 min后4 200 r/min 離心10 min，取上清液2 mL 進行微量凱氏定氮，測定其三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）。

1.3.5 大米蛋白肽的結(jié)構(gòu)鑒定

將45 ℃烘干至恒重的大米蛋白粉狀樣品與KBr按1∶100 比例在研缽中研磨混勻，壓片后均勻地平鋪于FTIR Tracer100 傅里葉紅外光譜儀的金剛石檢測窗口，旋轉(zhuǎn)壓力旋鈕至指示壓力，確保試樣和測試面窗口保持緊密的接觸，以減少在試驗中的紅外光束損耗。記錄每個樣品在波數(shù)400～4 000 cm-1光譜范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率掃描32 次光譜的平均值。在做樣品之前須做空白干凈金剛石的背景掃描。檢測到的光譜數(shù)據(jù)采用FT-IR Tracer100 光譜儀所配備的軟件OMNIC 進行基線校正和均一化處理，最后計算光譜差值，得到紅外光譜[14]。

1.3.6 氨基酸成分分析

將樣品稱重后放入玻璃水解管，并加入6 mol/L鹽酸10 mL，在減壓下密封水解管，垂直氮吹3 min后，壓蓋密封，使用水解器在110 ℃的加熱溫度下分解22 h。加熱結(jié)束后，將水解管取出冷卻至室溫，在減壓下干燥成固體，去除鹽酸。最后使用0.02 mol/L鹽酸稀釋至一定濃度后用作樣品，最終標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.5 mg prot./mL。樣品上機前用0.22 μm 濾膜進行過濾，收集濾液進行分析，進樣量為20 μL，檢測器波長為570 nm和440 nm，色譜柱型號為LCA K06/Na，流動相為緩沖液A、緩沖液B、緩沖液D（再生液）和水，洗脫泵流速：0.45 mL/min，衍生泵流速：0.25 mL/min，溫度為58～75 ℃梯度溫控，壓力為3～7 MPa[15]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用SPSS 18.0 軟件進行單因素分析（oneway ANOVA），用Duncan’s 法進行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白溶液溶解度的測定結(jié)果分析

如圖1所示，對照組溶解度為37.05%，與對照組相比，單一酶解組溶解度（51.55%）極顯著提高（P<0.01）；復(fù)合酶解組溶解度（56.18%）極顯著提高（P<0.01）。復(fù)合酶解組溶解度顯著高于單一酶解組（P<0.05）。

圖1 不同酶解條件大米多肽溶液溶解度

2.2 大米蛋白溶液中短肽含量的測定結(jié)果分析

如圖2 所示，對照組的短肽含量僅為12.15%，與對照組相比，單一酶解組短肽含量（71.44%）極顯著提高（P<0.01）；復(fù)合酶解組短肽含量（89.38%）極顯著提高（P<0.01）。復(fù)合酶解組溶解度顯著高于單一酶解組（P<0.05）。

圖2 不同酶解條件大米蛋白溶液中短肽含量

2.3 大米蛋白肽的結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，3 309.23 cm-1附近吸收峰主要歸因于酰胺Ⅱ帶的泛頻和費米振動；2 892.65 cm-1附近吸收峰處于酰胺B 帶，歸屬于C―H 伸縮振動；1 632.72 cm-1附近吸收峰屬于酰胺Ⅰ帶，主要是由80% C═O 伸縮振動所導(dǎo)致，表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 557.31 cm-1附近吸收峰主要是由60%―H 面內(nèi)彎曲振動和40%C―N伸縮振動所導(dǎo)致；1 406.90 cm-1附近吸收峰主要歸屬于―CH3和―CH2的不對稱變形振動；1 240.58 cm-1附近吸收峰屬于酰胺Ⅲ帶，主要是C═O彎曲振動和C―N伸縮振動所產(chǎn)生；1 097.57 cm-1附近吸收峰可歸為少量胱氨酸氧化物。

圖3 復(fù)合酶解組大米多肽紅外光譜分峰圖

2.4 大米蛋白肽的氨基酸成分分析

如圖4、圖5所示，樣品中含量最高的是谷氨酸，含量達(dá)到了8.8 nmol/L，接下來依次是天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸，含量均達(dá)到了4 nmol/L以上，主要氨基酸成分中還有絲氨酸、纈氨酸和精氨酸，含量分別為3.631、3.309、3.181 nmol/L。除了含量排名前8 位的氨基酸之外，其他氨基酸（蘇氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸）共占比28.31%。

圖4 復(fù)合酶解組大米多肽中主要氨基酸成分及其含量

圖5 復(fù)合酶解組大米多肽VIS1和VIS2整體色譜圖

3 討論

溶解度是蛋白質(zhì)的一種功能特性，是在不同加工條件下判斷蛋白質(zhì)潛在應(yīng)用價值的關(guān)鍵因素，可以作為評價指標(biāo)在食品和飼料研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[16-17]。物質(zhì)溶解能力的大小往往取決于其內(nèi)在組成部分。未經(jīng)處理的大米蛋白溶解度較低，與其中所含高比例的谷蛋白和醇溶蛋白有較大關(guān)系。由圖1可得，經(jīng)過超聲和堿處理的大米蛋白溶液溶解度可達(dá)37.05%，這是因為經(jīng)過超聲波處理后蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的改變，增強了其溶解性，并且經(jīng)過超聲處理可以使蛋白酶更好地作用于蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而部分堿溶性蛋白在堿性環(huán)境下有著更好的溶解效果。與對照組相比，單一酶解組和復(fù)合酶解組使得大米蛋白溶液溶解度得到進一步提升，說明堿性蛋白酶和中性蛋白酶的復(fù)合酶解對大米蛋白的溶解度有顯著提升作用，這很大程度上是因為堿性蛋白酶的作用位點多存在于谷蛋白和醇溶蛋白上，經(jīng)過酶解作用后，使兩者的肽鏈被切斷，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，溶解度顯著提高，而中性蛋白酶作為堿性蛋白酶的補充，使得大米蛋白的水解更為徹底。

三氯乙酸可以作為蛋白質(zhì)沉淀劑，將大米蛋白溶液中的可溶性蛋白質(zhì)和肽鏈較長的肽沉淀，并用酸將短肽溶解出來，所以可以利用三氯乙酸氮溶指數(shù)(TCA-NSI)與相同條件下蛋白溶液溶解度的比值，來反映短肽在蛋白溶液的溶質(zhì)中所占比例，簡稱短肽含量。相比于游離氨基酸，動物機體以短肽形式吸收的氨基酸強度要更高，并且短肽這種易吸收特性有利于動物體內(nèi)腸道益生菌的繁殖和微量元素的吸收，以促進動物體的生長發(fā)育[18]。與對照組和單一酶解組相比，復(fù)合酶解組中短肽在溶液溶質(zhì)中所占的比例有顯著的提高，可以說明堿性蛋白酶和中性蛋白酶對大米蛋白有著極佳的酶解效果，能夠使大米蛋白內(nèi)部的功能區(qū)更多地被釋放出來，從而使其具有制備各種功能短肽的條件，增進其利用價值。

據(jù)相關(guān)研究表明[19-20]，大米多肽可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)多個生理過程，還具備抗衰老、增強機體免疫力等作用。為了進一步證明經(jīng)過堿性蛋白酶和中性蛋白酶作用的大米蛋白溶液中，主要成分為具有多種生物學(xué)功能的多肽，而非小分子氨基酸，我們利用FTIR 技術(shù)對復(fù)合酶解組中的溶質(zhì)進行了分析檢測，由圖3 分析可得，復(fù)合酶解組中溶質(zhì)的特征峰位置與蛋白肽相吻合[21]，可以判定通過堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解所制得的大米蛋白肽具有多肽的基本結(jié)構(gòu)，而不是小分子氨基酸結(jié)構(gòu)。

將復(fù)合酶解組制得的產(chǎn)物大米多肽溶液進行氨基酸成分分析[22]，根據(jù)圖4、圖5 可得，經(jīng)復(fù)合酶解后的大米多肽中，具有8 種人體必需的氨基酸，氨基酸組成和種類十分豐富。將所測得的大米蛋白肽氨基酸成分與豆粕蛋白、玉米蛋白相比[23]，大米蛋白的生物價相對較高，其營養(yǎng)價值可與動物源蛋白相媲美。在保健功能方面，大米多肽還能夠降低人體內(nèi)的膽固醇水平，預(yù)防高血壓，并具有促進傷口愈合的功效[24-25]。根據(jù)上表分析，大米蛋白與豆粕蛋白、玉米蛋白相比，三者含有的氨基酸種類齊全，均含有人體所需的8 種必需氨基酸和2 種半必需氨基酸。雖然大米蛋白必需氨基酸總量較豆粕蛋白略低，但大米蛋白的氨基酸組成較為均衡，符合世界衛(wèi)生組織的建議。并且大米蛋白具有低抗原性，更有利于生產(chǎn)嬰幼兒食品。

本試驗使用了堿性蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解大米蛋白，結(jié)合超聲預(yù)處理技術(shù)，優(yōu)化其生產(chǎn)工藝，顯著提高了大米多肽溶液的溶解度和短肽含量，并分析了大米蛋白肽的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸成分，為大米蛋白的深加工技術(shù)提供進一步的研究基礎(chǔ)。

但本試驗未對蛋白肽中所含的風(fēng)味物質(zhì)展開研究，未來市場會對蛋白肽相關(guān)產(chǎn)品表現(xiàn)出極大興趣，相應(yīng)的功能性飲料和保健飲品也會隨之逐漸面世。在未來的研究中，可以嘗試多種不同的酶對植物蛋白進行復(fù)合酶解，結(jié)合超聲處理，提高產(chǎn)物濃度，改善其風(fēng)味和口感，并對產(chǎn)物多肽的功能性展開研究，生產(chǎn)出更多對身體健康有益的產(chǎn)品，減少大米蛋白資源的浪費，促進中國食品深加工技術(shù)的發(fā)展。

4 結(jié)論

本研究首次通過堿性蛋白酶和中性蛋白酶對大米蛋白溶液的復(fù)合酶解作用，與超聲預(yù)處理技術(shù)相結(jié)合，工藝簡單，成本低廉，使所得大米多肽溶液溶解度提高到56.18%，且溶質(zhì)中短肽含量占比高達(dá)89.38%。通過FTIR 技術(shù)進行檢測，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶解產(chǎn)物紅外光譜特征峰位置與蛋白肽基本符合，具有多肽的基本結(jié)構(gòu)。氨基酸分析儀的檢測結(jié)果表明，其氨基酸組成豐富，含有8 種必需氨基酸，大米蛋白營養(yǎng)價值得到了充分地提高。