鄧 力,唐冰灃,黃文政,陳衛(wèi)國,劉學(xué)林,陳欣強(qiáng),符韻林,劉 鑫*

(1.廣西國有欽廉林場,廣西欽州 535000;2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530000;3.廣西大學(xué)林學(xué)院,廣西南寧 530000)

白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.]又稱土沉香,主要分布在我國南部地區(qū),如海南、廣西、廣東、云南、香港、臺灣等[1]。白木香所產(chǎn)生的樹脂是我國和東南亞部分國家的天然香料和傳統(tǒng)名貴藥物,具有降氣溫中、暖身納氣的效果[2],同時能夠用于熏香、香水、藥物、心臟補(bǔ)品等[3];從沉香中提取的精油也具有抗菌特性[4]。沉香的高價值引發(fā)的商業(yè)開發(fā)和不受控制的砍伐正在導(dǎo)致這些樹木數(shù)量的減少,目前8種沉香屬的植物被列于《瀕危物種國際貿(mào)易公約》附錄Ⅱ(1994),并被國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN,2009)列為易受傷害物種。

沉香為沉香屬植物中的樹脂,是沉香屬植物在受到外來刺激或者損傷之后所產(chǎn)生的次生代謝物[5],其成分以倍半萜類化合物(如沉香螺旋醇、白木香酸、白木香醛)和色酮類化合物[2-(2-苯乙基)色酮衍生物]為主。國產(chǎn)沉香化學(xué)成分的研究表明白木香酸和白木香醛的產(chǎn)生是為了應(yīng)對某些外來因素刺激的防御[6],許多學(xué)者針對沉香結(jié)香原理進(jìn)行了研究,Wang等[7]揭示了沉香中2-(2-苯基乙基)色酮的生物合成途徑。沉香作為一種名貴的藥材,其自然發(fā)育需要25～30年,產(chǎn)量較低,無法滿足市場需求[5]。該研究對廣西境內(nèi)一株老齡野生白木香的內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定,探究其內(nèi)生菌結(jié)構(gòu),了解其內(nèi)生菌的菌群多樣性,分析白木香不同部位的內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)差異,為功能菌株的發(fā)掘、人工誘導(dǎo)結(jié)香及研究內(nèi)生菌群與宿主的相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集和處理于2021年9月在廣西欽州浦北縣某村進(jìn)行白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.]樣本采集。該樹樹齡約130年、樹高15 m、胸徑64.5 cm。在不傷害白木香的前提下,采集根部、葉片、樹干表皮有明顯病斑部位、表皮以下1～2 cm內(nèi)層植物組織進(jìn)行表面消毒后,放入滅菌袋中,編號,保存于4 ℃,并在24 h內(nèi)對樣品進(jìn)行處理。

1.2 菌株分離純化白木香內(nèi)生真菌的分離與純化分別使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和沙氏瓊脂培養(yǎng)基;細(xì)菌分別使用Luria-Bertani瓊脂培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

樣品分離前,按下列程序進(jìn)行表面消毒: 分別使用30%過氧化氫和75%乙醇進(jìn)行表面消毒,消毒結(jié)束后使用無菌水漂洗2～3次,漂洗后使用無菌濾紙吸干表面水分。

分離純化方法:①插塊培養(yǎng)法。將消毒后的樣品使用無菌手術(shù)刀切去表面后,裁成約5 mm的均勻小塊,分別插入相應(yīng)的培養(yǎng)基中,使截面與培養(yǎng)基充分接觸,真菌培養(yǎng)基分別添加50 mg/L氨芐西林和50 mg/L卡那霉素,置于(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～10 d。②液培涂布法。將消毒后的樣品使用無菌手術(shù)刀切去表面后,裁成約5 mm的均勻小塊后,用無菌研缽稍加研磨,將樣品內(nèi)部暴露后分別接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,(28±1)℃搖床培養(yǎng)1～3 d。待培養(yǎng)液渾濁后將培養(yǎng)液稀釋至10-4和10-5在對應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布,涂布后置于(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～10 d。③純化。待插塊樣品的培養(yǎng)基和進(jìn)行液培稀釋涂布的培養(yǎng)基上長出菌落后,通過對不同菌落形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分,使用無菌接種環(huán)分別挑取不同群落接入對應(yīng)固體培養(yǎng)基中,在(28±1)℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d,進(jìn)行純化分離。

1.3 內(nèi)生菌的鑒定

1.3.1真菌的分子生物學(xué)鑒定。將培養(yǎng)基上無法產(chǎn)孢的內(nèi)生真菌培養(yǎng)一段時間后,從平板上刮取約 1 g 菌絲體,置于1.5 mL 離心管中,使用上海生工DNA提取試劑盒進(jìn)行內(nèi)生真菌DNA的提取,并以此為模板,采用真菌通用引物ITS-4F (TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS-5R(GCAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)擴(kuò)增菌株的ITS序列。PCR 反應(yīng)體系(50 μL體系):TaqDNA Polymerase 0.5 μL,ITS-4F和ITS-5R各 4.0 μL,模板 DNA 9.0 μL,雙蒸水補(bǔ)足 50 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.2%瓊脂糖凝膠核酸染料電泳檢測,將符合要求的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定。將在培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落挑至液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h,用槍頭吸取10 μL菌液于0.2 mL PCR管中,采用細(xì)菌16S通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT )擴(kuò)增菌株16S序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL體系):2× RapidTaqPCR Master Mix 12.5 μL,16S通用引物27F和1492R各1.0 μL,雙蒸水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s, 54 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠核酸染料電泳檢測,將符合要求的擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.3內(nèi)生菌的分子生物學(xué)分析。測得的序列在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上使用Blast工具進(jìn)行檢索比對,選擇相似度大于98%以上的序列作為參考序列,并采用ClustalX 2.0 進(jìn)行同源性比較和匹配排序。

1.4 內(nèi)生菌多樣性分析該研究采用分離頻率、多樣性指數(shù)等方面分析白木香內(nèi)生菌的多樣性以及分布特性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木香內(nèi)生菌的組成

2.1.1白木香內(nèi)生細(xì)菌的組成。從所取樣品中分離得到內(nèi)生細(xì)菌111株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rRNA分析,得到的菌株分屬于13個屬。由表1可知,在門分類水平上分離得到的菌株多為厚壁菌門和變形菌門,在目的分類水平上,芽孢桿菌目和腸桿菌目分離頻率較高,分別為45.94%和39.64%;在科的分類水平上,芽孢桿菌科和腸桿菌科分離頻率較高,分別為45.94%和33.33%;在屬的水平上以芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和假單孢菌屬(Pseudomonas)分離頻率較高,分別為36.03%、10.83%和9.92%。部分細(xì)菌菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1 部分細(xì)菌菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of partial bacterial colonies

表1 白木香內(nèi)生細(xì)菌的菌群組成

2.1.2白木香內(nèi)生真菌的組成。從所取樣品中分離得到內(nèi)生真菌49株,經(jīng)形態(tài)學(xué)和ITS序列分析,得到的菌株分屬于10個屬。由表2可知,分離菌株均為子囊菌門,在目的分類水平上,肉座菌目、葡萄座腔菌目分離頻率較高,分別為36.74%、22.45%;在科的分類水平上,赤殼菌科、葡萄座腔菌科和小叢殼科分離頻率較高,分別為24.49%、22.45%和20.41%;在屬的水平上,鐮刀菌屬、可可毛色二孢菌屬和炭疽菌屬分離頻率較高,分別為24.49%、22.45%和20.41%。部分真菌菌落形態(tài)如圖2所示。

表2 白木香內(nèi)生真菌的菌群組成

2.2 白木香內(nèi)生菌多樣性分析

2.2.1不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析。從表3可以看出,白木香不同部位的細(xì)菌分離頻率差別較大,其中從干莖中分離得到的菌株最多,占分離菌株的86.48%,其次為干莖內(nèi)層(5.41%)、根部(5.41%),從葉中得到的菌株最少(2.70%)。不同部位的細(xì)菌分布差異較大,其中,干莖中分離得到96株,在屬的分類水平上有13個屬,其中占比較高的有芽孢桿菌屬和腸桿菌屬;干莖內(nèi)層中分離得到6株菌株,在屬的分類水平上分別為芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、假單孢菌屬;根部分離得到6株菌株,在屬的分類水平上分別為芽孢桿菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和假單孢菌屬;葉片分離得到3株菌株,在屬的分類水平上有2個屬,分別為芽孢桿菌屬和泛菌屬。

2.2.2不同部位內(nèi)生真菌多樣性分析。從表4可以看出,不同部位的真菌分離頻率差別較大,其中從干莖中分離得到的菌株最多,占分離總菌株數(shù)的71.43%,其次為根部(12.25%)、葉(10.20%)、干莖內(nèi)層(6.12%)。不同部位的真菌分布差異較大,其中,干莖分離得到35株,在屬的分類水平上有9個屬,其中,主導(dǎo)菌株為炭疽菌屬、鐮刀菌屬和可可毛色二孢菌屬;從葉片分離得到5株,屬分類水平上分為4個屬,分別為木霉屬、可可毛色二孢菌屬、鐮刀菌屬和炭疽菌屬;從根部分離得到6株,屬分類水平上有5個屬,分別為炭疽菌屬、附球霉屬、鐮刀菌屬、可可毛色二孢菌屬、木霉屬;從干莖內(nèi)層分離得到3株,在分類水平上分屬3個屬,分別為附球霉屬、鐮刀菌屬、平臍蠕孢屬。

表4 白木香不同部位內(nèi)生真菌類群組成、分布、多樣性指數(shù)和分離頻率

2.3 白木香內(nèi)生菌相似性

2.3.1內(nèi)生細(xì)菌相似性分析。各部位的細(xì)菌菌種相似性如圖3所示。各部分分離得到的菌株在屬水平分類差別較大;根部分離出的內(nèi)生細(xì)菌與其他部分有較大重合度;干莖中分分離得到最多菌株,但所分離得到的菌株在屬水平分類上與其他部位分離出的菌株重合度不高。

圖3 不同部位細(xì)菌屬水平上的分布韋恩圖Fig.3 Venn diagram of the distribution of bacteria genera in different parts

2.3.2內(nèi)生真菌相似性分析。各部位的真菌菌種相似性如圖4所示。與分離得到的細(xì)菌在屬水平分類上較為相似,各部分離得到的菌株在屬水平分類差別較大;根部分離出的內(nèi)生真菌在屬水平分類上與其他部分有較大重合度;干莖中分分離得到最多菌株,但所分離得到的菌株在屬水平分類上與其他部位分離出的菌株重合度不高。

圖4 不同部位真菌屬水平上的分布韋恩圖Fig.4 Venn diagram of the distribution of fungi genera in different parts

3 小結(jié)與討論

從20世紀(jì)以來,國內(nèi)外研究者從沉香屬植物樹體分離了一些內(nèi)生真菌,主要為鐮刀菌、毛色二孢菌、可可毛色二孢菌、曲霉、木霉、毛霉、青霉等。研究認(rèn)為沉香的形成可能是由于樹體被一種或者多種真菌侵染寄生,在真菌體內(nèi)酶的作用下,導(dǎo)致木薄壁細(xì)胞貯藏的淀粉發(fā)生變化,形成香脂,多年沉積形成沉香。戚樹源等[9]針對黃綠墨耳菌與沉香結(jié)香機(jī)制進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)沉香組織中色酮類成分含量與真菌侵染時間呈正相關(guān),且沉香主要成分的形成很可能是在逆境條件下白木香和內(nèi)生真菌相互作用所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。Bhore等[10]對沉香中可培養(yǎng)的77種細(xì)菌進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大部分(36.4%)為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。近年來大量的研究表明鐮刀菌、毛色二孢菌、可可毛色二孢菌、曲霉、木霉、毛霉、青霉等真菌均具有促進(jìn)沉香樹結(jié)香的效果[6],也有研究證明,內(nèi)生細(xì)菌對沉香的產(chǎn)生也有促進(jìn)作用,Chhipa 等[11]利用泛菌(Pantoea)成功誘導(dǎo)了沉香螺醇的產(chǎn)生;該研究從白木香的葉、莖、根和周邊干莖內(nèi)層等不同部位分離出111株細(xì)菌和49株真菌。其中細(xì)菌中厚壁菌門和變形菌門的占比較大,主要為芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和假單孢菌屬。真菌均屬子囊菌門,主要為鐮刀菌、炭疽菌和可可毛色二孢菌。陳瑤[12]從齊楠沉香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.]分離得到的真菌有擔(dān)子菌門和子囊菌門,在屬水平上的優(yōu)勢菌為鐮刀菌屬、枝孢屬和帚枝霉屬,此結(jié)果與該試驗(yàn)有較大區(qū)別,該試驗(yàn)分離得到的真菌在門分類水平上專一性高,可能與試驗(yàn)樹種有關(guān)系,該試驗(yàn)樣品采自多年樹齡的結(jié)香白木香。

分離得到的根部中的細(xì)菌有芽孢桿菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬和假單孢菌屬,分離得到的干莖內(nèi)層的細(xì)菌有芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和假單孢菌屬。其中腸桿菌屬和芽孢桿菌屬是常見的植物根際促生細(xì)菌;分離得到的干莖內(nèi)層真菌主要有鐮刀菌屬、附球霉屬和平臍蠕孢屬,存在于根部的真菌主要有炭疽菌屬、附球霉屬、鐮刀菌屬、可可毛色二孢菌屬和木霉屬,二者也有高度的相似性。存在于干莖內(nèi)層和根部中的真菌多為植物致病菌,或與真菌從樹干入侵后,菌絲在樹干內(nèi)分布,或者直接從土壤入侵,進(jìn)而滲透到根部有關(guān)[13]。

從葉片中分離得到的細(xì)菌只有芽孢桿菌屬和泛菌屬,分離得到的真菌有炭疽菌屬、可可毛色二孢菌屬、鐮刀菌屬和木霉屬,均為常見的植物致病菌?？煞蛛x的真菌在葉片的分布與其在根部的分布高度相似,由于葉片和根莖不是結(jié)香部位,并且上述細(xì)菌和真菌常見于各種植物,所以其部位上分離得到的內(nèi)生菌應(yīng)該與結(jié)香沒有直接關(guān)系。

干莖上有豐富的結(jié)香,于干莖部位分離得到大量的真菌和細(xì)菌。分離的細(xì)菌有芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬、克氏桿菌屬、克呂沃氏桿菌屬、科薩克氏菌屬、泛菌屬、假單孢菌屬、鞘脂桿菌屬、普里斯特氏菌屬和勒克氏菌屬。分離得到的真菌有節(jié)菱孢屬、炭疽菌屬、鐮刀菌屬、可可毛色二孢菌屬、脈孢菌屬、擬盤多毛孢屬、青霉屬、木霉屬、平臍蠕孢屬。干莖的細(xì)菌和真菌的群落組成與葉片和根部的差異較大。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌在莖中的定殖率顯著高于葉片,葉片和根的組織內(nèi)的真菌群落差異顯著。這與該試驗(yàn)的結(jié)果一致。

分離得到的真菌主要為鐮刀菌屬、炭疽菌屬和可可毛色二孢菌屬,均為常見的植物致病菌。目前已有研究證明鐮刀菌屬對沉香的產(chǎn)生有重要影響,Faizal等[15]在對Gyrinopsversteegii(Gilg.)接種茄病鐮孢菌90 d后對比未接種菌株的穿孔對照組,發(fā)現(xiàn)接種鐮刀菌的樹枝產(chǎn)生了明顯的產(chǎn)香區(qū)域;GC-MS分析表明接種區(qū)域含有別香橙烯、β-真烯醇、β-斯利烯以及色酮衍生物2-(2-苯乙基)色酮-4-1,6-甲氧基-2-(2-苯乙基)鉻酮、6,7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)鉻酮等沉香的特征倍半萜物質(zhì) ;繼而又使用茉莉酸甲酯和茄病鐮孢菌培養(yǎng)液提取物進(jìn)行AquilariamalaccensisLamk組織培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)茄病鐮孢菌能夠?qū)е鲁料慊衔锷蒣16]。毛色二孢菌屬也是常見的植物致病菌,廣泛分布于熱帶的亞熱帶地區(qū)。毛色二孢菌會促進(jìn)產(chǎn)生茉莉酸甲酯,該物質(zhì)與植物防御有密切關(guān)聯(lián),可以從化學(xué)分子的角度上開啟植物防御機(jī)制,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)香[17]。Chen等[18]在利用菌株發(fā)酵液誘導(dǎo)沉香形成的研究發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌(L.theobromae)和茄病鐮孢菌(Fusariumsolani)能夠有效導(dǎo)致白木香結(jié)香,但茄病鐮孢菌無法長期保持結(jié)香效果,而可可毛色二孢菌能在一年內(nèi)持續(xù)結(jié)香。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)由可可毛色二孢菌誘導(dǎo)產(chǎn)生沉香后提取的精油與野生沉香的精油無論是在化學(xué)成分還是抗菌活性方面都具有高度相似性,進(jìn)一步證實(shí)可可毛色二孢菌促進(jìn)沉香結(jié)香。分離得到的細(xì)菌中,占比最大為的芽孢桿菌屬,有研究證實(shí),腐生芽孢桿菌通過分解纖維素促進(jìn)沉香的有效成分釋放[20];此外,芽孢桿菌屬可以通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和揮發(fā)物質(zhì)表現(xiàn)出對鐮刀菌屬等植物病原菌的抑制作用[21]。

該研究通過對具有百年樹齡的結(jié)香白木香進(jìn)行內(nèi)生菌的分離鑒定,得到了大量的沉香內(nèi)生菌,豐富了沉香內(nèi)生菌的多樣性,并為人工結(jié)香提供了菌種資源。下一步擬使用分離得到的菌株對白木香進(jìn)行結(jié)香試驗(yàn),進(jìn)一步探究各類微生物的結(jié)香功能和人工結(jié)香條件。