王丹丹,孫 麗,于 宏,崔世宇,龐詩琪,解志紅

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,山東泰安 271000)

大豆是我國主要的油料作物之一,也是重要的糧食作物,但隨著大豆連續(xù)種植年限的增加及不合理輪作制度,使大豆連作障礙問題成為制約我國大豆產(chǎn)業(yè)的重要因子[1-2],如何有效緩解大豆連作障礙,提高大豆的產(chǎn)量與品質(zhì),成為我國大豆產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。連作障礙會降低大豆對營養(yǎng)元素的吸收能力,影響大豆各個(gè)時(shí)期的正常生長,同時(shí)還會引起植物病害加重,最終降低大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。大豆連作障礙是植物與土壤2個(gè)系統(tǒng)多個(gè)因素綜合作用引起的,其中一個(gè)重要原因是土壤中自毒物質(zhì)的積累[6-7]。自毒作用是化感作用的一種特殊形式,即作物分泌的化感物質(zhì)在土壤中積累,會抑制同茬或下茬的同種或同科作物的生長發(fā)育[8]。酚酸類化感物質(zhì)常被認(rèn)為是根系分泌物中主要的自毒化感物質(zhì)[9-10],大豆根系分泌物中常見的酚酸類自毒化感物質(zhì)有對羥基苯甲酸、香草酸等[9,11-12],其中對羥基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid,PHBA)能影響根系細(xì)胞線粒體正常功能,導(dǎo)致活性氧積累,從而影響植物根系的正常生長[13-14],也會造成植物無法正常利用光合作用吸收的能量,影響植株正常生長[15];對羥基苯甲酸還會損傷根系細(xì)胞,破壞根系的完整性,使土傳病原菌更易從植物根系入侵,引起植物病害蔓延[16-17];此外,對羥基苯甲酸的積累導(dǎo)致連作土壤理化性質(zhì)惡化,不利于作物對養(yǎng)分的利用[18-19]。

土壤中自毒化感物質(zhì)酚酸的積累是導(dǎo)致連作障礙的一個(gè)重要原因,有效實(shí)現(xiàn)酚酸安全降解進(jìn)而有效緩解連作障礙是大豆產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向。根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指附著于根際土壤顆粒中,對植物健康生長發(fā)揮著重要作用的一類根際微生物[20],根際促生菌具有降解自毒化感物質(zhì)、抑制有害植物病原菌生長、促進(jìn)植物生長、增加土壤微生物群落中有益微生物數(shù)量、對環(huán)境無污染的特點(diǎn),在連作障礙治理中應(yīng)用廣泛[19,21]。在大豆連作障礙土壤中接種有酚酸降解功能的根際促生菌,利用微生物分解連作土壤中累積的自毒化感物質(zhì),有望成為一項(xiàng)健康有效的治理措施。目前,利用選擇培養(yǎng)基從自然環(huán)境中已篩選獲得多種具有對羥基苯甲酸降解功能的根際促生菌,包括假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[19]、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)[21]、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)[22]等,這些微生物可以高效降解對羥基苯甲酸且降解底物多樣,在緩解連作障礙中具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[23]。利用根際促生菌治理大豆連作障礙可持續(xù)性強(qiáng)且對生態(tài)環(huán)境友好,而尋找有效的可以使用的多功能根際促生菌是生物治理實(shí)施的前提,因此,該研究從連作5年的大豆根際土壤中以對羥基苯甲酸為唯一碳源篩選降解菌株,并測定其對大豆發(fā)芽及幼苗生長的影響,為生物治理大豆連作障礙提供可利用根際促生菌菌株。

1 材料與方法

1.1 供試土壤樣品取自吉林省延邊朝鮮族自治州5年連續(xù)大豆種植地,將大豆植株根部挖出,抖落大塊附著土,根系1 cm內(nèi)的根際土收集后置于4 ℃保存運(yùn)輸。

1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器LB培養(yǎng)基(蛋白胨 10 g/L,酵母粉 5 g/L,NaCl 10 g/L)、無機(jī)鹽培養(yǎng)基(KH2PO42 g/L,Na2HPO41.3 g/L,(NH4)2SO42 g/L,NaCl 5 g/L,葡萄糖1 g/L)?；蚪M提取試劑盒,購自Axygen生物技術(shù)(杭州)有限公司;16S擴(kuò)增引物,購自TaKaRa生物技術(shù)(大連)有限公司;高保真聚合酶Primes STAR HS DNA polymerase,購自TaKaRa生物技術(shù)(大連)有限公司。

1.3 對羥基苯甲酸高效降解菌的分離從連續(xù)種植5年的大豆耕地中選取長勢較好的植株,采集根際土壤,按1%質(zhì)量體積比將土壤接種于1 g/L對羥基苯甲酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,35 ℃搖床180 r/min,使能夠降解對羥基苯甲酸的菌株得到富集。土壤懸液在搖床中培養(yǎng)10 d后稀釋涂布于LB培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落劃線于LB固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)12 h后觀察菌落特征,若培養(yǎng)特征完全一致則為同一種菌,否則需多次劃線反復(fù)純化直至菌落特征一致。

1.4 高效降解菌株篩選及其耐受性測定為獲得高效降解菌株,將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對羥基苯甲酸濃度提高至5 g/L。將-80 ℃甘油管菌種于LB固體培養(yǎng)基上活化,35 ℃培養(yǎng)12 h,挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h即為種子液。種子液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至新LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5,取1 mL菌液加至49 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)觀察菌株是否可以生長。

將篩選到的高效降解菌株再接種到對羥基苯甲酸濃度為10、15、20、25、30 g/L無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,35 ℃、180 r/min培養(yǎng)觀察菌株生長情況。

1.5 自毒物質(zhì)降解率測定高效降解菌株菌液(培養(yǎng)方法見“1.3”)接種至49 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液中(對照加入1 mL無菌水),培養(yǎng)液中以不同酚酸自毒物質(zhì)為唯一碳源,濃度為5 g/L,35 ℃搖床培養(yǎng)72 h,8 000 r/min離心10 min,采用紫外可見分光光度法,取上清液測定對應(yīng)自毒物質(zhì)的最大吸收峰波長的吸光度,并計(jì)算降解率。各物質(zhì)的測定吸收波長分別為對羥基苯甲酸246 nm、苯甲酸230 nm、香草酸250 nm。降解率=(對照吸光度-處理后樣品吸光度)/對照吸光度×100%。

1.6 根際促生菌菌株鑒定提取根際促生菌基因組DNA,擴(kuò)增16S rRNA序列片段,擴(kuò)增引物為27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)、1429R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。

電泳檢測產(chǎn)物片段后送至測序公司測序,16S rRNA序列片段在EZBioCloud網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對分析。

1.7 根際促生菌促生能力測定固氮能力測定采用Ashby無氮固體培養(yǎng)基,將目標(biāo)根際促生菌接種于Ashby無氮固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)7 d,記錄菌株的長勢。

解磷能力測定采用無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和卵黃固體培養(yǎng)基,將目標(biāo)根際促生菌分別接種于無機(jī)磷固體培養(yǎng)基和卵黃固體培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)3 d,觀察是否有溶磷圈出現(xiàn)。

IAA合生能力測定采用Salkowski法,將目標(biāo)根際促生菌接種于含L-色氨酸(200 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中,35 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)4 d,菌液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min,取上清液于酶標(biāo)板中,加入等體積Salkowski比色液,黑暗條件下靜置反應(yīng)30 min后,迅速于530 nm下測定吸光度。

1.8 種子發(fā)芽試驗(yàn)根際促生菌促進(jìn)種子萌發(fā)試驗(yàn)以大豆為試驗(yàn)對象,大豆浸泡于70%乙醇10 min后用無菌水清洗3遍完成消毒。CK為空白對照,消毒后的大豆種子置于含無菌水的培養(yǎng)皿中;處理T1為消毒后的種子置于根際促生菌菌液中(細(xì)菌在OD600為0.5時(shí)離心收集菌體,菌體用無菌水清洗3次后重懸,接種量為1%)。每個(gè)處理10粒種子,設(shè)置5次重復(fù)。

1.9 盆栽試驗(yàn)盆栽土壤取自吉林省延吉市5年連續(xù)大豆種植地塊,121 ℃滅菌20 min,重復(fù)滅菌2次后自然風(fēng)干,土壤、蛭石、珍珠巖按3∶1∶1體積比混勻,拌入無菌MS營養(yǎng)液到達(dá)濕潤狀態(tài),分裝至盆栽盆中,每杯約200 g。大豆種子70%乙醇浸泡10 min,無菌水清洗3遍后在無菌水中浸泡12 h,放入培養(yǎng)基質(zhì)中。CK為空白對照,消毒后的大豆種子置于固體基質(zhì)中;處理T1則加入根際促生菌菌液,將活化好的菌株菌液統(tǒng)一調(diào)節(jié) OD600為0.5,每杯加入500 μL菌液,每組重復(fù)5次。培養(yǎng)30 d后小心從培養(yǎng)基質(zhì)中取出完整的大豆植株,將根部沖洗干凈后測量植株的根長、苗高、鮮重、干重。

1.10 數(shù)據(jù)處理及分析利用Microsoft Excel和Origin 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 對羥基苯甲酸高效降解菌的篩選以對羥基苯甲酸為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基,在大豆根際土壤中共計(jì)分離得到42株可降解利用對羥基苯甲酸的根際促生菌株。將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對羥基苯甲酸的濃度提高至5 g/L,獲得6株在高濃度對羥基苯甲酸培養(yǎng)基中可正常生長的根際微生物,分別為PA08、PA11、PA14、PA17、PA18、PA40。通過提高無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對羥基苯甲酸濃度,探究所篩6株根際促生菌對對羥基苯甲酸耐受性,試驗(yàn)結(jié)果表明,PA18和PA40對對羥基苯甲酸的最大耐受濃度為15 g/L,PA11、PA14的最大耐受濃度為20 g/L,PA08、PA17的最大耐受濃度為25 g/L。

2.2 高效降解菌降解底物多樣性的測定利用底物廣譜試驗(yàn)探究所篩的6株根際促生菌對3種大豆常見的酚酸類自毒化感物質(zhì)(對羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸)的降解效果,試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,6株高效降解菌對3種酚酸都有降解能力,其中PA08、PA11、PA17對對羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均超過50%。

圖1 6株根際促生菌酚酸降解率Fig.1 The degradation rates of phenolic acids by 6 plant growth-promoting rhizobacteria

2.3 酚酸高效降解菌的鑒定對分離篩選得到的6株高效降解菌株的16S rRNA基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫完成分子生物學(xué)鑒定,其結(jié)果如表1所示。從表1可以看到,6株高效降解菌株與其相似菌的相似度均超過99%,分別為無色桿菌PA08 (AchromobactermucicolensPA08)、布魯氏桿菌PA11 (BrucellaciceriPA11)、假單胞菌PA14 (PseudomonasalloputidaPA14)、假單胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)、布魯氏桿菌PA18 (BrucellaciceriPA18)、無色桿菌PA40 (AchromobactermucicolensPA40)。

表1 菌株的分類

2.4PseudomonashunanensisPA17促生特性分析高效降解菌AchromobactermucicolensPA08、BrucellaciceriPA11、PseudomonashunanensisPA17對大豆常見3種酚酸類自毒化感物質(zhì)降解率均超過50%,但無色桿菌根據(jù)NY/T1109菌株生物安全標(biāo)準(zhǔn)為生物安全三級,而布魯氏桿菌安全未分類,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中仍需要進(jìn)一步進(jìn)行致病性分析,因此選取PseudomonashunanensisPA17進(jìn)行促生特征分析。

定量檢測PseudomonashunanensisPA17的產(chǎn)IAA能力,結(jié)果如圖2A所示,PA17在含L-色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,與Salkowski比色液反應(yīng)后呈現(xiàn)粉紅色,表明PA17可以合成植物激素IAA,合成量可以達(dá)到(8.65±0.26) mg/L。定性檢測PseudomonashunanensisPA17固氮及解磷能力,PA17在Ashby無氮固體培養(yǎng)基上可正常生長(圖2B),并且在無機(jī)磷(圖2C)和有機(jī)磷(圖2D)固體培養(yǎng)基上有明顯解磷圈,表明PA17具有固氮和解磷能力。

注:A.IAA合成能力;B.固氮能力;C.解無機(jī)磷能力;D.解有機(jī)磷能力。Note:A.IAA production.B.Nitrogen fixation.C.Inorganic phosphorus solution.D.Organic phosphorus solution.圖2 Pseudomonas hunanensis PA17促生特征分析Fig.2 Promoting growth feature test of Pseudomonas hunanensis PA17

2.5PseudomonashunanensisPA17對大豆種子的促生作用測定大豆種子在不同處理下發(fā)芽率,結(jié)果表明,置于PseudomonashunanensisPA17菌液中的大豆種子發(fā)芽率(100%)明顯高于CK(80%),此外,PA17明顯促進(jìn)大豆胚根的生長(圖3)。

圖3 Pseudomonas hunanensis PA17對大豆胚根生長的影響Fig.3 Effects of strain Pseudomonas hunanensis PA17 on root development of soybean

2.6PseudomonashunanensisPA17對大豆幼苗生長的影響幼苗盆栽試驗(yàn)結(jié)果如圖4和表2所示,盆栽基質(zhì)中添加根際促生菌PseudomonashunanensisPA17對大豆幼苗的鮮重、干重、株高、根長有明顯的促進(jìn)作用,相比于CK,PA17處理后鮮重增加11.20%,干重增加6.92%,地上部分苗高增加14.62%,地下部分根長增加25.27%。

表2 Pseudomonas hunanensis PA17對大豆幼苗生長的影響

圖4 大豆盆栽試驗(yàn)Fig.4 Soybean pot experiment

3 討論

對羥基苯甲酸是大豆連作障礙土壤中積累的主要自毒化感物質(zhì)之一,對植物多方面造成威脅,嚴(yán)重影響大豆植株的健康生長。該研究從大豆連作根際土壤中篩選獲得多株對羥基苯甲酸高效降解根際促生菌,其中假單胞菌PA17 (PseudomonashunanensisPA17)不僅耐受性強(qiáng)且降解底物多樣,對對羥基苯甲酸、苯甲酸、香草酸的降解效率均已超過50%;發(fā)芽及盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明,PA17可顯著促進(jìn)種子發(fā)芽、胚根及幼苗生長,具有較好的應(yīng)用前景。

隨著國家大豆產(chǎn)業(yè)振興計(jì)劃的實(shí)施,大豆種植面積逐步增加,如何實(shí)現(xiàn)減少農(nóng)藥化肥施用,有效緩解連作障礙,提高大豆產(chǎn)量和質(zhì)量是產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向。根際微生物在根表[24]或根內(nèi)[25]定殖,通過多種途徑直接或間接促進(jìn)植物健康生長,如降解自毒化感物質(zhì)[10],合成多種活性物質(zhì)有效抑制植物病原菌生長[26],提高土壤中可利用養(yǎng)分的含量[27],產(chǎn)生植物類激素[28]。該研究中分離純化到的大豆根際促生菌可有效降解自毒化感物質(zhì),并且盆栽試驗(yàn)明顯證明其可促進(jìn)大豆幼苗生長,同時(shí)選取了4株常見的植物病原真菌與一株植物病原細(xì)菌進(jìn)行了植物病原菌拮抗試驗(yàn),但結(jié)果顯示該研究分離到的根際促生菌均沒有拮抗植物病原菌能力,因此,該研究后續(xù)將針對植物病原菌拮抗能力篩選根際促生菌,將多種根際促生菌配合使用,獲得多功能復(fù)合菌劑,并驗(yàn)證其對大豆及其他作物連作障礙緩解能力,如花生、黃瓜、番茄等,擴(kuò)大復(fù)合菌劑應(yīng)用范圍。

4 結(jié)論

該研究針對大豆連作土壤中自毒化感物質(zhì)降解菌,利用對羥基苯甲酸為唯一碳源,篩選具有對羥基苯甲酸降解及利用能力的根際促生菌,其中假單胞菌PA17不僅降解能力強(qiáng)且降解底物多樣;促生試驗(yàn)表明,PA17具有吲哚乙酸合成能力、固氮能力,同時(shí)具有解有機(jī)磷及無機(jī)磷的能力;發(fā)芽試驗(yàn)證明PA17可促進(jìn)大豆種子的萌發(fā),并可顯著促進(jìn)大豆胚根的發(fā)育;盆栽試驗(yàn)表明PA17也可明顯促進(jìn)大豆幼苗的生長,具有較好的應(yīng)用前景。